肖保衡，張 旭，陳培超，于 萍，劉 劍，嚴(yán)陽(yáng)蕾，吳明江

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江溫州 325035)

羊棲菜Sargassum fusiforme又名海大麥、鹿角菜、海菜芽等,屬于褐藻門,圓子綱,墨角藻目,馬尾藻科,馬尾藻屬,是一種多年生的大型海藻,在我國(guó)沿海均有生長(zhǎng),尤其以浙江省溫州市洞頭縣最多,同時(shí)還分布于日本和朝鮮沿海地區(qū)。該海藻在《本草綱目》草部水草類海草條中記載有軟堅(jiān)散結(jié),利水泄熱等功效[1],而從羊棲菜中提取的羊棲菜褐藻糖膠(巖藻聚糖硫酸酯)更具有多種生理活性：研究表明其具有抗氧化、抗凝血、降血脂、降血糖等功能,此外還具有抗炎[2]、抗病毒[3]、促進(jìn)血管生成[4]、減少組織損傷[5]、神經(jīng)保護(hù)、抗突變、抗輻射、吸附金屬離子、吸濕保濕等作用[6-8]。因而成為近年來海洋藥物研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。

褐藻糖膠具有的多種生理活性與其分子量大小、硫酸根含量及位置等結(jié)構(gòu)因素密切相關(guān)。本文通過對(duì)羊棲菜褐藻糖膠酸水解后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)解析,可以進(jìn)一步的了解褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)信息,為羊棲菜褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)分析提供一個(gè)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

羊棲菜,采集于浙江省溫州市洞頭縣。

實(shí)驗(yàn)試劑：三氟乙酸(分析純)、L-鼠李糖和D-半乳糖醛酸、高碘酸鈉、732陽(yáng)離子交換樹脂購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;右旋糖酐標(biāo)樣、D-甘露糖和D-木糖均購(gòu)自中國(guó)藥物生物制品鑒定所;D-葡萄糖醛酸購(gòu)自SIGMA;D-葡萄糖購(gòu)自TCI;D-半乳糖購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH;L-巖藻糖購(gòu)自Fluka Bio-Chemika。溴化鉀購(gòu)自天津市科器高新技術(shù)公司。重水購(gòu)自Cambridge Isotope Laboratories,Inc。

實(shí)驗(yàn)儀器：TENSOR27紅外光譜儀,Bruker光譜儀器公司;離子色譜ICS-1000,戴安公司;高效液相色譜儀1525,Waters科技有限公司;色譜柱TSK-G5000 PWxl、TSK-G3000 PWxl、TSK-G2500 PWxl,日本TOSOH公司;C18色譜柱ODS-2 HYPERSIL,Thermo SCIENTIFIC;核磁共振儀,瑞士Bruker BioSpin公司。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊棲菜褐藻糖膠的制備

1.2.1.1 冷水浸提褐藻糖膠

經(jīng)過清洗的羊棲菜于烘箱50℃下烘干,粉碎,然后進(jìn)行提取。(1)脫脂：稱取上述羊棲菜粉末500 g,加入95%乙醇,80℃冷凝回流,充分脫去其中醇溶性脂質(zhì)和色素。(2)冷水浸提：按照料液比1：20向上述濾渣中加入蒸餾水,磁力攪拌器攪拌8 h后四層紗布過濾,濾渣再重復(fù)冷水浸提7次,合并浸提液,50℃下減壓濃縮至約1 L。(3)第一次醇沉：向濃縮好的浸提液加入95%乙醇至乙醇終濃度為80%,常溫靜置過夜。然后4 000 r/min離心10 min得到沉淀,再將沉淀依次經(jīng)95%乙醇、無水乙醇和丙酮洗滌,減壓干燥,得水溶性羊棲菜粗多糖。(4)除褐藻膠：將第一次醇沉的總糖按照料液比1：20加入蒸餾水進(jìn)行復(fù)溶,緩慢加入4 mol/L氯化鈣,邊加邊攪拌至不再產(chǎn)生沉淀,離心后取上清液。(5)將上述上清液再次濃縮醇沉,方法同第一次醇沉,即可獲得羊棲菜粗褐藻糖膠。

1.2.1.2 粗多糖脫色

采用500 mL的D101型大孔吸附樹脂層析柱來進(jìn)行脫色,得脫色冷提羊棲菜褐藻糖膠(CSFP)。

1.2.1.3 脫色褐藻糖膠的水解與超濾分級(jí)

向CSFP中加入三氟乙酸(TFA)在一定的條件下反應(yīng)后用NaOH進(jìn)行中和。然后將水解液放入1 kDa的透析袋中流水透析過夜,蒸餾水透析16 h后,用截流量為10 kDa的超濾系統(tǒng)對(duì)袋內(nèi)液進(jìn)行分級(jí),可獲得Mw＞10 kDa和Mw＜10 kDa的多糖溶液。將Mw＞10 kDa的多糖溶液濃縮凍干后得到CSFP1(Mw＞10 kDa)。將Mw＜10 kDa的多糖溶液轉(zhuǎn)入3.5 kDa的透析袋中,蒸餾水透析16 h,袋內(nèi)袋外液體分別濃縮凍干,獲得袋內(nèi)和袋外兩個(gè)不同級(jí)分 CSFP2(10 kDa＞Mw＞3.5 kDa)、CSFP3(3.5 kDa＞Mw＞1 kDa)。

1.2.2 羊棲菜褐藻糖膠的性質(zhì)測(cè)定

1.2.2.1 總糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量測(cè)定

以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖,應(yīng)用苯酚-硫酸法[9]測(cè)總糖含量;以0.1 g/L的D-半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過間羥基聯(lián)苯法[10]測(cè)定糖醛酸的含量;以5 mg/mL牛血清白蛋白為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,考馬斯亮藍(lán)法[11]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.2 羊棲菜褐藻糖膠中硫酸根含量的測(cè)定

用ISC-1000離子色譜儀測(cè)定硫酸根含量,選用Shodex IC SI-52 4E柱(4.0×250 mm),以3.6 mmol/L碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液為流動(dòng)相,流速為1 mL/min測(cè)定[12]。

1.2.2.3 單糖組成的測(cè)定

采用PMP衍生化及HPLC測(cè)定所得樣品單糖組成[13]。

1.2.2.4 多糖的分子量測(cè)定

采用高效尺寸排阻色譜(HPSEC)測(cè)定所得樣品分子量,以右旋糖酐為標(biāo)準(zhǔn)品,選擇TSK-G5000 PWxl、TSK-G3000 PWXL、TSK-G2500 PWXL凝膠色譜柱。流動(dòng)相為0.1 mol/L Na2SO4溶液,流速為0.6 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL來測(cè)定樣品的分子量及其分布[14]。

1.2.2.5 多糖的紅外光譜分析

取干燥的CSFP1、CSFP2、CSFP3多糖樣品,加入KBr研磨壓片,在4 000 cm-1～400 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描,記錄紅外光譜圖[14]。

1.2.3 CSFP2結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析

1.2.3.1 CSFP2多糖的高碘酸氧化與Smith降解

采用文獻(xiàn)[15]中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.2 CSFP2的脫硫

CSFP2的脫硫：實(shí)驗(yàn)采用Nagasawa法脫硫酸根[16-18]。

1.2.3.3 CSFP2與脫硫后樣品的甲基化

采用文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行測(cè)定[19-20]。

1.2.3.4 CSFP2的核磁共振分析

稱取50 mg多糖CSFP2,充分溶解于重水中,然后12 000 r/min 10 min。取上清液,在Bruker AV 600 MHz spectrometer上測(cè)定其13C NMR譜。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

圖1 CSFP的水解及分級(jí)的流程圖Fig.1 Flow chart of hydrolysis and fractionation of CSFP

2.1 羊棲菜多糖的提取、脫色與多糖的水解

羊棲菜經(jīng)過冷水浸提其總多糖的得率為16.4%,經(jīng)氯化鈣沉淀去除褐藻膠后得到的羊棲菜褐藻糖膠得率為3.0%。再經(jīng)過大孔樹脂脫色,最終獲得冷提脫色羊棲菜褐藻糖膠CSFP,其脫色產(chǎn)率為76.7%。

羊棲菜褐藻糖膠CSFP經(jīng)過TFA水解、中和、透析及初步分級(jí)(具體流程如圖1)后的總回收率是82.84%。其中CSFP1的得率最多為33.51%,CSFP2和CSFP3的得率分別為25.87%和23.46%,相對(duì)較少。

2.2 CSFP、CSFP1、CSFP2、CSFP3 的性質(zhì)

各樣品的糖含量、糖醛酸含量、蛋白質(zhì)和硫酸根含量列于表1。CSFP1、CSFP2和CSFP中糖含量都較高(分別為84.2%、72.2%和76.13%),前兩者蛋白質(zhì)含量較低(均小于2%),而CSFP蛋白質(zhì)含量稍高(3.55%)。CSFP1中糖醛酸含量稍高(14.3%),硫酸根含量稍低(10.0%),而CSFP2中糖醛酸含量稍低(9.8%),硫酸根含量最高(18.7%),CSFP的糖醛酸含量最低(1.06%),硫酸根含量(17.96%)僅次于CSFP2。CSFP3中糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)的含量都非常低,具體成分有待于進(jìn)一步分析。

表1 水解多糖片段中糖含量、糖醛酸含量、蛋白質(zhì)含量及硫酸根含量Tab.1 The content(%)of sugar,uronic acid,protein and sulfate of CSFP and its hydrolysates

2.3 各級(jí)分的單糖組成

表2中列出了CSFP及其水解產(chǎn)物的分子量和單糖組成。冷提羊棲菜褐藻糖膠CSFP主要由巖藻糖與半乳糖組成,其次是葡萄糖和木糖,還包含少量的半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖和甘露糖。水解后的3個(gè)級(jí)分中分子量最大的CSFP1主要由半乳糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和木糖組成,其組成非常類似陸生植物中的半纖維素成分,值得注意的是其中甘露糖含量豐富(18.8%)。中等分子量的CSFP2中半乳糖含量顯著增加到41.1%,其次還有巖藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和甘露糖,推測(cè)是典型的褐藻糖膠成分中的巖藻半乳聚糖。分子量最低的CSFP3單糖組成以葡萄糖為主(57.7%),其次是巖藻糖和半乳糖,推測(cè)其可能是褐藻淀粉類似物。

表2 多糖中的單糖組成情況Tab.2 Molecular weight and monosaccharide composition of CSFP and its hydrolysates

2.4 多糖的分子量測(cè)定結(jié)果

圖2為羊棲菜多糖的高效尺寸排阻色譜分析圖。各多糖級(jí)分經(jīng)TSK-G3000分析后的洗脫曲線如圖2b所示：CSFP大部分集中在外水體積洗脫出來的位置,說明其分子量大部分大于TSK-G3000的排阻限;水解獲得的級(jí)分CSFP1和CSFP2的分子量分布則是前者在大于10 kDa的范圍內(nèi),而后者則在3.5 kDa與10 kDa之間;CSFP3洗脫體積明顯小于內(nèi)水體積,說明其分子量已經(jīng)小于TSK-G3000的分析范圍。隨后應(yīng)用TSK-G5000和TSK-G2500分別分析CSFP和CSFP3的分子量,結(jié)果顯示CSFP的分子量集中分布在37 kDa和73 kDa之間(圖2a),CSFP3的分子量集中分布在1.0 kDa和3.5 kDa之間(圖2c)。

圖2 羊棲菜水解多糖的高效尺寸排阻色譜分析圖Fig.2 High performance size exclusion chromatographic analysis of polysaccharides from S.fusiforme

2.5 多糖的紅外光譜結(jié)果

從紅外光譜圖(圖3)中可得,CSFP及三個(gè)水解羊棲菜多糖級(jí)分是明顯的多糖物質(zhì),在3400 cm-1～3500 cm-1處有很寬的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰,在2 800 cm-1～2 912.34 cm-1處有吡喃環(huán)的C-H彎曲伸縮振動(dòng)峰及巖藻糖和半乳糖基C-6,1 430 cm-1～1450 cm-1處為半乳糖和木糖CH2的剪切震動(dòng),巖藻糖和O-乙?；鵆H3的非對(duì)稱彎曲振動(dòng),1 384 cm-1為巖藻糖和O-乙?；鵆H3的對(duì)稱彎曲振動(dòng);CSFP、CSFP1和CSFP2在1 630 cm-1附近出現(xiàn)羰基非對(duì)稱伸縮振動(dòng),在1 425 cm-1前后是與糖醛酸相關(guān)的振動(dòng)峰,1 230 cm-1～1 250 cm-1處表現(xiàn)出硫酸酯中O=S=O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng),CSFP2多糖與CSFP多糖的硫酸根含量相近且峰值都最高、CSFP-1硫酸根含量次之,CSFP3不含硫酸根,與前面硫酸根含量的測(cè)定相符;CSFP3在1 683 cm-1處具有糖的水化峰,在1 049 cm-1～1 141 cm-1處有吡喃環(huán)的特征吸收峰,在879 cm-1處具有β-糖苷鍵的典型振動(dòng)峰,但具體結(jié)構(gòu)特征還有待進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

圖3 羊棲菜水解多糖的紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of polysaccharides fractions from S.fusiforme

2.6 CSFP2的高碘酸氧化與Smith降解結(jié)果

CSFP2樣品經(jīng)過高碘酸氧化后,經(jīng)過測(cè)定：CSPF2樣品在反應(yīng)中總共消耗0.107 0 mmol的高碘酸鈉。甲酸的生成量為0.041 7 mmol。CSFP2單糖殘基的平均分子量為159,故50 mg樣品中有約0.31 mmol糖基,經(jīng)過計(jì)算CSFP2每個(gè)單糖基分子消耗0.35個(gè)高碘酸鈉分子;平均每個(gè)糖基生成0.13個(gè)甲酸分子。我們通過比較高碘酸鈉消耗量與甲酸生成量可知,CSFP2中有1→6糖苷鍵的存在或是含有非還原性末端,同時(shí)還存在1→2或1→4糖苷鍵。從消耗高碘酸鈉的量分析可知,CSFP2中含有大量的1→3,1→2,3,1→3,6和1→3,4等不能被高碘酸氧化的糖苷鍵。

CSFP2的高碘酸氧化產(chǎn)物經(jīng)Smith降解,產(chǎn)物用HPLC分析,分析結(jié)果列于表3。通過分析數(shù)據(jù)中氧化后產(chǎn)物YCSFP2 a中單糖的組成與之前未氧化的CSFP2的單糖組成可知,高碘酸氧化前后樣品中Gal都為主要的單糖,并且氧化后Gal、Fuc的含量增加,Man、Rha、GlcA、Glc的含量減少說明Gal和Fuc含有不易被氧化的1→3,1→2,3,1→3,6和1→3,4糖苷鍵,而Man、Rha、GlcA、Glc含有易被氧化的1→2或1→4、1→6糖苷鍵,YCSFP2 b中的單糖以Gal為主表明多糖的主鏈很可能以Gal為主。YCSFP c的單糖中Man、Rha、GlcA、Glc、Fuc相比較b中的單糖都增加很多,說明這些多糖更多的分布在多糖的外邊緣的支鏈上。

表3 CSFP2與高碘酸氧化后YCSFP2及Smith降解后的產(chǎn)物的單糖組成Tab.3 Monosaccharide components of CSFP2 and products of YCSFP2 after periodate oxidation and Smith degradation

2.7 CSFP2的脫硫結(jié)果

如圖4所示為CSFP2、TCSFP2的紅外光譜圖,多糖樣品CSFP2經(jīng)過732強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂(H+型)脫硫后,經(jīng)過紅外光譜檢測(cè),我們可以明顯的發(fā)現(xiàn)在硫酸根出峰處1 253 cm-1沒有檢測(cè)出相應(yīng)的峰值,與脫硫之前的樣品CSFP2相比TCSFP2脫硫效果十分明顯。

2.8 CSFP2的核磁共振分析結(jié)果（ppm單位在核磁共振中表示化學(xué)位移）

13C-NMR譜圖中(圖5)102.7～103.2 ppm處出現(xiàn)糖基異頭碳的特征峰,顯示CSFP2中的糖基位β構(gòu)型,15.46～15.09 ppm處顯示的巖藻糖C-6的甲基特征峰,由此可知在CSFP2中巖藻糖存在多種鏈接形式。20.0 ppm處可能是乙酰基中甲基碳。而80.14～60.74 ppm范圍內(nèi)位糖基C-2～C-4的特征峰,因?yàn)樘腔溄訌?fù)雜,出峰位置密集,難以歸屬。

2.9 CSFP2、TCSFP2的甲基化結(jié)果

表4和表5為CSFP2經(jīng)過脫硫前后甲基化后的結(jié)果。由表4可知,CSFP2具有相對(duì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu),峰面積比最高的為1,3,6-linked Gal,說明主鏈很可能是以Gal為主,通過1→3或1→6糖苷鍵連接,另外除了1,3,6-linked Gal的外,還存在1,2,3-linked Gal,1,2-linked Fuc,1,2,4-linked Man,1,3,6-linked Man,說明可能在半乳糖的C2、C3、C6位置上連接有甘露糖或是巖藻糖。而由表5可知經(jīng)過脫硫后的TCSFP2中,峰面積比最高的依然為1,3,6-linked Gal,且經(jīng)過脫硫前后甲基化結(jié)果對(duì)比后發(fā)現(xiàn)1,2-linked Fuc沒變,說明Fuc糖上不含有硫酸根,而作為主鏈的1,3,6-linked Gal,變成了1,6-linked Gal,說明硫酸根很可能是連接在Gal的C3位上,結(jié)合Smith降解的結(jié)果,可知巖藻糖和甘露糖可能都處于支鏈上,故CSFP2的結(jié)構(gòu)可能是以Gal為主鏈,通過1→6糖苷鍵連接,在C3位上含有硫酸根基團(tuán),在C2、C3、C6位置上連接有甘露糖或是巖藻糖。

圖4 CSFP2、TCSFP2的紅外光譜圖Fig.4 The IR spectrum of CSFP2,TCSFP2

圖5 CSFP2的13C NMR譜圖Fig.5 The13C NMR spectrum of CSFP2

表4 CSFP2甲基化產(chǎn)物衍生物糖醇乙酸酯的GC-MS分析Tab.4 GC-MS of alditol acetate derivatives from the methylated product of CSFP2

表5 TCSFP2甲基化產(chǎn)物衍生物糖醇乙酸酯的GC-MS分析Tab.5 GC-MS of alditol acetate derivatives from the methylated product of TCSFP2

3 結(jié)論與展望

本文通過酸水解CSFP獲得不同階段分子量的多糖：CSPF1、CSFP2、CSFP3,并對(duì)這三種多糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超濾截留直接獲得的多糖CSFP2本身分子量均一,經(jīng)過測(cè)定其分子量為6.2 kDa,分子量大小也比較適中且硫酸根含量最高,故在CSFP1、CSFP2、CSFP3中CSFP2是一種相對(duì)理化性質(zhì)比較優(yōu)秀的級(jí)分,且經(jīng)過測(cè)定CSFP2的結(jié)構(gòu)可能是以Gal為主鏈,通過1→6糖苷鍵連接,在C3位上含有硫酸根基團(tuán),在C2、C3、C6位置上連接有甘露糖或是巖藻糖。CSFP2結(jié)構(gòu)解析可以為以后其活性研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),便于分析多糖的構(gòu)效關(guān)系,同時(shí)也為褐藻糖膠的的結(jié)構(gòu)分析提供參考,另一方面實(shí)驗(yàn)探索的制備不同分子量多糖的過程也可以為制備低分子量多糖提供參考,而且其中經(jīng)過超濾截留可直接獲得單峰級(jí)分CSFP2的現(xiàn)象表明在特定的水解條件下可以產(chǎn)生量比較多的特定多糖片段,這就為實(shí)驗(yàn)中獲得特定的穩(wěn)定的足夠多的多糖級(jí)分提供了可能。

[1]許忠能,王朝暉,孫 立.羊棲菜藥用價(jià)值的研究進(jìn)展[J].中草藥,2000,31(11)：876-878

[2]ZHANG X W,LIU Q,THORLACIUS H.Inhibition of selectin function and leukocyte rolling protects against dextran sodium sulfateinduced murine colitis[J].Scandinavian Journal of Gastroenterology,2001,36(3)：270-275.

[3]辛現(xiàn)良,耿美玉,李桂玲,等.海洋硫酸多糖911體外對(duì)HIV-1作用的研究[J].中國(guó)海洋藥物,2000,19(3)：8-11.

[4]CHABUT D,FISCHER A M,COLLIEC-JOUAULT S,et al.Low molecular weight fucoidan and heparin enhance the basic fibroblast growth factor-induced tube formation of endothelial cells through heparan sulfate-dependent α-6 over expression[J].Molecular Pharmacology,2003,64(3)：696-702.

[5]ZEMANI F,BENISVY D,GALY-FAUROUX I,et al.Low-molecular-weight fucoidan enhances the proangiogenic phenotype of endothelial progenitor cells[J].Biochemical Pharmacology,2005,70(8)：1 167-1 175.

[6]胡佩紅,張淑平.褐藻糖膠吸濕、保濕性能的研究[J].精細(xì)與專用化學(xué)品,2006,14(3)：23-25.

[7]王 晶,張全斌,張忠山,等.乙酰化海帶褐藻多糖硫酸酯的制備及其抗氧化活性研究[J].中國(guó)海洋藥物雜志,2008,27(1)：50-54.

[8]WANG Jing,WANG Feng,ZHANG Quanbin,et al.Synthesized different derivatives of low molecular fucoidan extracted from Laminaria japonica and their potential antioxidant activity in vitro[J].International Journal of Biological Macromolecules,2009,44(5)：379-384.

[9]DUBOIS M,GILLES K A,HAMILTON J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry,1956,28(3)：350-356.

[10]BLUMENKARNTZ N,ASBOE-HANSEN G.New method for quantitative determination of uronic acid[J].Analytical Biochemistry,1973,54(2)：484-489.

[11]TSAFFRIR Z,ZVI S.Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity：Theoretical and Experimental Studies[J].Analytical Biochemistry,1996,236(2)：302-308.

[12]張麗萍,王月秋,姜世成,等.離子色譜法測(cè)定高山紅景天多糖硫酸酯中硫酸根含量的研究[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào),2000(3)：161-164.

[13]STRYDOM D J.Chromatographic separation of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone-derivatized neutral,acidic and basic aldoses[J].Journal of Chromatography A,1994,678(1)：17-23.

[14]JIN Weihua,ZHANG Wenjing,WANG Jing,et al.Characterization of laminaran and a highly sulfated polysaccharide from Sargassum fusiforme[J].Carbohydrate Research,2014,385(224)：58-64.

[15]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].第2版.杭州：浙江大學(xué)出版社,1999.

[16]USOV A I,ADAMYANTS K S,MIROSHNIKOVA L I,et al.Solvolytic desulphation of sulphated carbohydrates[J].Carbohydrate Research,1971,18(2)：336-338

[17]STEVENSON T T,FURNEAUX R H.Chemical methods for the analysis of sulphated galactans from red algae[J].Carbohydrate Research,1991,210：277-298

[18]NAGASAWA K,INOUE Y,KAMATA K.Solvolytic desulfation of glycosaminoglycuronan sulfates with dimethyl sulfoxide containing water or methanol[J].Carbohydrate Research,1977,58(1)：47-55

[19]HAWORTH W N.III.A new method of preparing alkylated sugars[J].Journal of the Chemical Society,Transactions,1915,107：8-16.

[20]徐 杰,李八方,薛長(zhǎng)湖,等.羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯的甲基化分析[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2004,34(6)：959-963.