劉紅艷，李 維，向 芬，周 琳，丁 玎，曾 振，周凌云

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125）

茶炭疽?。℅loeosporium theae sinesisMiyake）是我國茶園一種重要真菌病害，該病在全國各茶區(qū)普遍發(fā)生，主要危害茶樹的葉部，一般從幼齡葉片背部的毛孔侵入，經(jīng)8～15 d潛伏期后開始形成病斑，遇到溫暖濕潤時易造成該病大面積的爆發(fā)流行，茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。目前茶炭疽病的防治除農(nóng)業(yè)防治外，主要依靠化學(xué)藥劑，造成環(huán)境污染和農(nóng)殘一系列的問題，這些問題已經(jīng)引起國內(nèi)外有關(guān)專家的高度關(guān)注[3-4]。因此加快新型農(nóng)藥研制與采用拮抗微生物來防治茶樹炭疽病非常必要。

放線菌是具有巨大實(shí)用價值的一類微生物，是抗生素的主要生產(chǎn)菌，是新農(nóng)藥和生物防治活菌劑研制的主要源頭[5]。利用放線菌的次生代謝產(chǎn)物——抗生素制備的生物農(nóng)藥，由于其具有無污染、無殘留、可再生、難以使有害生物產(chǎn)生抗藥性、易于產(chǎn)業(yè)化、成本低等特點(diǎn)，目前已成為無公害農(nóng)藥的主體和未來農(nóng)藥的發(fā)展方向[6]。通過分離篩選與利用拮抗放線菌達(dá)到環(huán)保、高效的生物防治目的已經(jīng)成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)科學(xué)研究熱點(diǎn)之一[7]。本試驗(yàn)從湖南茶園采集的土樣中分離篩選的放線菌F2菌株，具有拮抗茶炭疽病的活性，能顯著抑制炭疽病菌的生長。結(jié)合形態(tài)、培養(yǎng)特征、16S rDNA等對其進(jìn)行了分類鑒定，旨在為進(jìn)一步防治茶炭疽病提供生防材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

采自湖南省茶葉研究所長沙高橋試驗(yàn)基地、湘陰縣蘭嶺茶場、長沙縣金井茶場有機(jī)茶園與常規(guī)茶園不同肥力茶園。根據(jù)采樣地點(diǎn)的地形，采用對角線法5點(diǎn)取土樣，每個點(diǎn)取土樣量大體一致，取樣深度為0～20 cm，均勻混合后將其裝入滅菌封口聚乙烯袋，4℃低溫保存，待分離。

1.1.2 供試菌株

供試病原菌茶炭疽病菌（Gloeosporium theae sinesisMiyake）由本所植保實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

分離與保存用培養(yǎng)基：高氏合成一號培養(yǎng)基；拮抗試驗(yàn)用培養(yǎng)基：PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）。

1.2 方法

1.2.1 土壤放線菌的分離、培養(yǎng)

采用稀釋涂布平板法[8]進(jìn)行放線菌的分離。稱取采集的土壤樣品10 g，放入裝有90 mL無菌水的300 mL玻璃三角瓶中振蕩，制得10-1的稀釋液，靜置1 min后用無菌移液管吸取1 mL的上清液，加入已裝有9 mL無菌水的試管中混勻，制得10-2的稀釋液，依次制備10-3～10-6稀釋液。用無菌移液管吸取稀釋液0.1 mL，分別滴加到含有3‰抑菌劑（K2Cr2O7）的高氏合成一號培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃刮刀涂勻，靜置30 min后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)5～7 d，觀察放線菌的出現(xiàn)情況，并將其中的放線菌單菌落挑出，純化培養(yǎng)，純化好的菌種轉(zhuǎn)入斜面，4℃條件下冰箱保存?zhèn)溆谩２捎闷桨鍖χ欧╗5]判斷菌株對病原真菌的作用。

1.2.2 茶炭疽病拮抗菌的篩選

采用平板對峙法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將病原真菌茶炭疽病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，將分離純化好的各種放線菌在高氏合成一號培養(yǎng)基上涂皿繁殖7 d，用滅菌打孔器（d＝5 mm）將放線菌打成圓形的菌餅，并將放線菌菌餅接種于PDA平板的邊緣，呈對等的三角形，置28℃下恒溫培養(yǎng)，待其定殖后將在PDA平板上培養(yǎng)繁殖5 d的1塊直徑為5 mm的茶炭疽病菌菌餅，接種于PDA平板的中央，并設(shè)空白對照。靜置1 h后再放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)3皿，適時檢查其菌落周圍有無抑菌圈，待對照菌落長滿整個培養(yǎng)皿后，測量抑菌圈的直徑。

1.2.3 拮抗菌株F2的分類鑒定

形態(tài)培養(yǎng)特征觀察[8]：肉眼觀察劃線接種在高氏合成一號瓊脂培養(yǎng)基、PDA、酵母精麥芽糖精瓊脂培養(yǎng)基（ISP4）平板上，于28℃培養(yǎng)的培養(yǎng)特征；使用高氏合成一號培養(yǎng)基和插片法接種，28 ℃下培養(yǎng)，分別于 7 d、15 d、30 d 將蓋玻片取出，在顯微鏡下觀察其菌絲、孢子的形態(tài)特征，即分別在 7 d、15 d、30 d 觀察記錄其菌絲、孢子和可溶性色素的顏色變化，以成熟期的顏色作為其定種依據(jù)，顯微觀察并照相。

16S rDNA的PCR擴(kuò)增：參照Nikodinovic等[9]和Kauffmann等[10]的方法提取放線菌基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物：27F 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,1492R 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，以基因組DNA為模板，PCR的擴(kuò)增：25 μL 反應(yīng)體系94℃預(yù)變性 10 min，94℃變性 1 min，55℃復(fù)性 1 min，72℃延伸 1 min，32 個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。采用 1.0%的瓊脂糖對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離篩選及拮抗活性測定

以茶炭疽病菌（Gloeosporium theae sinesisMiyake）為供試病原菌，從湖南茶園土壤中篩選得到了258個放線菌菌落，篩選出6株具有較好拮抗作用的菌株并編號，其中以F2菌株的抑菌效果最好，通過拮抗性初步測定，對茶炭疽病菌的抑菌圈直徑達(dá)44 mm。

2.2 放線菌F2菌株的分類鑒定

2.2.1 F2菌株的形態(tài)培養(yǎng)特征

F2菌株在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察，菌落在該培養(yǎng)基表面生長緊密，菌落顏色隨著時間的推移逐漸變深 ，即由白色最終變?yōu)榛液谏洌▓D1）；在PDA上培養(yǎng)觀察，可見其產(chǎn)生明顯的黃色色素（圖2）；在ISP4上生長良好，菌落表面由白色變?yōu)楹谏▓D3）。F2菌株在顯微鏡下觀察，氣生菌絲和基內(nèi)菌絲均很豐富，氣生菌絲體形成孢子鏈（圖4）。

圖1 F2菌株的菌落形態(tài)特征（高氏合成一號培養(yǎng)基）Fig.1 Colony morphology of strain F2(Gause’s Synthetic Agar Mediu)

圖2 F2菌株的菌落形態(tài)特征（PDA）Fig.2 Colony morphology of strain F2（PDA）

圖3 F2菌株的菌落形態(tài)特征（ISP4）Fig.3 Colony morphology of strain F2（ISP4）

圖4 F2菌株顯微鏡（400X）觀察照片F(xiàn)ig.4 Strain F2 microscope(400X) observation photograph

2.2.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，放線菌株 F2 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小在 1500 bp 左右 (圖 5)。

圖5 F2 16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.5 16S rDNA PCR product electrophoresis images of F2

結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征和分子生物學(xué)鑒定特征分析，并參照《鏈霉菌鑒定手冊》[11]，F(xiàn)2菌株具有典型的鏈霉菌屬的特征，氣生菌絲和基內(nèi)菌絲均很豐富，氣生菌絲體形成孢子鏈，因此將其初步鑒定為鏈霉菌屬。

3 討論

分離篩選生防菌、研制生防制劑等是當(dāng)前防治植物病蟲害的一種安全、有效的途徑。近年來，分離篩選拮抗放線菌的研究較多，但尚未發(fā)現(xiàn)從茶園土壤這一特定的生態(tài)環(huán)境中篩選拮抗放線菌的報道。作者前期從茶園中分離并篩選到拮抗放線菌，且對茶白星病等病原菌進(jìn)行了拮抗性篩選試驗(yàn)，具有較好的效果。本研究進(jìn)一步對茶炭疽病進(jìn)行篩選試驗(yàn)，其拮抗效果明顯。并對具有顯著拮抗效果放線菌株F2進(jìn)行了初步鑒定。這些研究結(jié)果為該菌株抗菌活性物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和拮抗機(jī)理的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該菌株的抗菌效果好，具有較強(qiáng)開發(fā)潛力，在植病生防方面具有良好的應(yīng)用前景。因此，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大對其抗菌譜研究，增強(qiáng)其生防應(yīng)用價值；對其發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定，并通過盆缽小區(qū)試驗(yàn)、田間試驗(yàn)檢驗(yàn)其生防效果；對其抗菌機(jī)理及最佳發(fā)酵條件進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步開發(fā)為生物農(nóng)藥。

[1]謝寶林.茶炭疽病的識別與防治[J].農(nóng)技服務(wù),2007,24(2)：63-63.

[2]劉威.茶樹炭疽病的病原鑒定及其遺傳多樣性分析[D].福建農(nóng)林大學(xué),2013.

[3]Hyakumachi,M.,Takahashi,H.,Matsubara,Y.,et al.Recent studies on biological control of plant diseases in Japan.Journal of General Plant Pathology[J].2014,80(4): 287-302.

[4]Evangelista-Martinez,Zahaed.Isolation and characterization of soil Streptomyces species as potential biological control agents against fungal plant pathogens.World Journal of Microbiology& Biotechnology[J].2014,30(5): 1639-1647.

[5]安德榮,慕小倩,劉翠娟,等.土壤拮抗放線菌的分離和篩選[J].微生物學(xué)雜志,2002,22(5): 1-3.

[6]蔣細(xì)良,謝德齡.農(nóng)用抗生素的作用機(jī)理[J].生物防治通報,1994,10(2)：76-81.

[7]邱德文.生物農(nóng)藥研究進(jìn)展與未來展望[J].植物保護(hù),2013,39(5): 81-89.

[8]方中達(dá).植病研究方法.第 3版[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[9]Nikodinovic J,Barrow E D,Chuck A.High yields preparation of genomic DNA fromStreptomyces[J].BioTechiniques,2003,38(11): 932-936.

[10]Kauffmann I M,Schmitt J,Schmid R D.DNA isolation from soil samples for cloning in different hosts[J].ApplMicrobiol Biotechnol,2004(64): 665-670.

[11]中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組編著.鏈霉菌鑒定手冊.北京：科學(xué)出版社,1975.