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(中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081)

0 引 言

2018年是中科院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所建所60周年(以原長春地理所成立時間計)，同時也是東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)技術(shù)中心成立40周年(以原黑龍江農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化所成立時間計)的慶典年。借此時機(jī)，本文對農(nóng)田分子生態(tài)學(xué)科組將近10年的主要研究成果進(jìn)行梳理、總結(jié)，并對未來的研究方向進(jìn)行展望。

農(nóng)田分子生態(tài)學(xué)科組定位：闡明東北黑土區(qū)主要農(nóng)作物高產(chǎn)生理遺傳基礎(chǔ)與環(huán)境效應(yīng)的關(guān)系，解析作物根系-土壤-微生物之間的相互作用關(guān)系，明確農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化及其生態(tài)功能，發(fā)掘有益的生物資源，提高土壤固碳潛力和氮素利用效率等，為東北地區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論和技術(shù)支撐。

農(nóng)田分子生態(tài)學(xué)科組現(xiàn)有成員7人，其中3人獲得黑龍江省杰出青年科學(xué)基金，2人為中科院“百人計劃”入選者，1人為中科院青年創(chuàng)新促進(jìn)會成員，1人獲得黑龍江省青年科技獎。學(xué)科組年流動人員(博士、碩士研究生)平均10名左右。

學(xué)科組10年來承擔(dān)各類科研項目30余項，其中國家自然科學(xué)基金項目14項，中科院百人計劃項目2項，中科院重點部署項目4項，黑龍江省杰出青年基金和重點項目4項等。發(fā)表學(xué)術(shù)論文160余篇，其中SCI源論文112篇。獲得黑龍江省自然科學(xué)二等獎2項(2011、2017)。

1 學(xué)科組10年來的研究工作的主要進(jìn)展

1.1 系統(tǒng)解析了東北黑土農(nóng)田土壤微生物的生物地理分布格局和主要驅(qū)動因素，為大尺度刻畫黑土微生物群落結(jié)構(gòu)組成及生態(tài)功能提供了第一手資料

東北黑土是我國重要的土壤資源，在保障國家糧食安全和生態(tài)安全上具有重要地位。由于受氣候、開墾年限和農(nóng)田管理措施等影響，東北黑土農(nóng)田土壤養(yǎng)分含量，特別是土壤有機(jī)質(zhì)含量呈現(xiàn)規(guī)律性的地理分布格局，總體呈現(xiàn)出南低北高的趨勢[1]。但對于黑土土壤微生物是否也存在著地理分布格局？如果存在，其驅(qū)動因素是什么？還不清楚。為此，學(xué)科組成員于2012年南起遼寧省昌圖北至黑龍江省訥河，采集了26個農(nóng)田土壤樣品，采用第二代高通量測序技術(shù)，對細(xì)菌[2]、真菌[3]、酸桿菌[4]、氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)[5]等微生物群落結(jié)構(gòu)的地理分布規(guī)律及其驅(qū)動因素進(jìn)行了解析。

研究發(fā)現(xiàn)黑土農(nóng)田細(xì)菌和真菌都表現(xiàn)出明顯的地理分布格局，但真菌群落地理分布規(guī)律性體現(xiàn)的更明顯，黑土微生物地理空間分布存在微生物尺度效應(yīng)。黑土土壤細(xì)菌與真菌均具有相似的緯度梯度多樣性，即微生物α-多樣性都呈現(xiàn)出高緯度土壤樣品低而低緯度樣品多樣性高的分布規(guī)律。在土壤因子調(diào)控微生物空間分布格局方面，揭示出黑土農(nóng)田細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成、多樣性及優(yōu)勢細(xì)菌門的相對豐度受土壤pH和土壤有機(jī)質(zhì)含量的雙重影響，但土壤pH的作用強(qiáng)度更強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)土壤真菌數(shù)量與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而與土壤pH值無關(guān)；有機(jī)質(zhì)含量還與土壤真菌一些分類單元豐度呈顯著正/負(fù)相關(guān)關(guān)系，有機(jī)質(zhì)是驅(qū)動黑土農(nóng)田土壤真菌群落地理分布格局的主要土壤因子。

酸桿菌細(xì)菌一般具有嗜酸、寡營養(yǎng)和難培養(yǎng)的特點。土壤中酸桿菌門細(xì)菌與變形菌門細(xì)菌數(shù)量相當(dāng)，一般占細(xì)菌總量的20%～50%左右，在土壤生態(tài)過程中起到重要的作用。高通量測序發(fā)現(xiàn)黑土農(nóng)田酸桿菌門細(xì)菌豐度平均占到細(xì)菌總量的24%。國際上多篇論文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，森林和草原土壤中酸桿菌的相對豐度與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，然而這種關(guān)系在東北黑土農(nóng)田上不成立，暗示黑土農(nóng)田土壤酸桿菌可能存在獨特的分布格局。為此，我們采用酸桿菌特異性引物ACIDO/342r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Miseq測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑土帶農(nóng)田土壤中存在21個酸桿菌亞門，其中GP1、GP3、GP4和GP6為優(yōu)勢類群，占測序總數(shù)的90%左右。揭示出酸桿菌絕對豐度(數(shù)量)與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈高度正相關(guān)關(guān)系，表明黑土中一些酸桿菌成員為富營養(yǎng)菌，補(bǔ)充了學(xué)術(shù)界對酸桿菌是寡營養(yǎng)菌的認(rèn)知。同時還揭示出黑土農(nóng)田酸桿菌α-多樣性與pH呈現(xiàn)非線性單峰分布關(guān)系，在土壤pH為6.0左右時，酸桿菌多樣性最高。研究還發(fā)現(xiàn)，有別于黑土農(nóng)田細(xì)菌和真菌群落分布規(guī)律，地理距離對酸桿菌群落在黑土帶上分布格局影響不大，而土壤因素，特別是土壤pH是驅(qū)動酸桿菌群落結(jié)構(gòu)地理分布的關(guān)鍵因子。

采用定量PCR和高通量測序，針對氨單加氧酶基因(amoA)研究發(fā)現(xiàn)，東北黑土農(nóng)田功能性微生物AOB和AOA豐度變化與其他農(nóng)田土壤相似，amoA基因豐度均表現(xiàn)出AOA大于AOB，AOA/AOBamoA基因拷貝數(shù)比值在3～91之間。發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)含量和土壤pH分別是決定AOA和AOB數(shù)量的兩個最主要土壤因子。AOA和AOB不同分類單元在黑土帶上的分布受到多種環(huán)境因子的影響，AOA古菌α-多樣性指數(shù)變化不大，不受任何土壤因子的調(diào)控；而AOB細(xì)菌α-多樣性指數(shù)與土壤pH、全磷和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。AOA較AOB在黑土帶上表現(xiàn)出更加明顯的地理分布格局，土壤pH是驅(qū)動兩類氨氧化微生物最主要的土壤因子。相關(guān)分析顯示AOB較AOA對黑土農(nóng)田潛在的硝化速率(PNR)貢獻(xiàn)大。

1.2 對比剖析墾殖與自然恢復(fù)黑土微生物群落結(jié)構(gòu)，追溯還原土地利用方式變化對黑土微生物的影響

東北黑土經(jīng)過多年的墾殖，已從自然生態(tài)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)。從生態(tài)學(xué)的角度出發(fā)，比較兩種生態(tài)系統(tǒng)土壤生物和生物化學(xué)過程，可以追溯還原黑土質(zhì)量退化的生物學(xué)機(jī)制。但事實上，由于人類近百年的活動，在同一塊黑土地上很難找到原始的黑土與農(nóng)田黑土進(jìn)行對比研究。為此，我們以海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實驗站建立的墾殖與自然恢復(fù)黑土長期定位區(qū)為研究平臺，采用分子生物學(xué)技術(shù)，以土壤細(xì)菌、真菌，以及與氮循環(huán)過程密切相關(guān)的氨氧化細(xì)菌和反硝化微生物為研究對象，從動態(tài)角度揭示了土地利用方式改變后上述土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化規(guī)律。

采用PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，黑土細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)首先受到土地利用方式的影響，其次受到季節(jié)變化的影響，而墾殖中不同肥料管理對黑土細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)影響有限[6]。采用構(gòu)建克隆文庫技術(shù)對黑土氨氧化細(xì)菌群落研究發(fā)現(xiàn)[7]，自然恢復(fù)處理的氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與墾殖處理差異顯著，表明土地利用方式改變了氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。比較不同季節(jié)樣品發(fā)現(xiàn)，作物生長期的氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與非生長期群落不同。黑土中尚有12%～27%的AOB序列分類地位不能確定，表明黑土中氨氧化細(xì)菌組成十分豐富。以nirS基因為靶標(biāo)基因，對黑土反硝化細(xì)菌高通量測序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)[8]，黑土反硝化細(xì)菌的主要成員包括Aromatoleum、Rhodanobacter、Cupriavidus、Bradyrhizobium、Proteobacteria_unclassified、Magnetospirillum和Rhodocyclaceae_unclassified。其中，Rhodanobacter和Rhodocyclaceae_unclassified顯著受到季節(jié)變化因素的影響，而Aromatoleum、Bradyrhizobium、Proteobacteria_unclassified、Rhodocyclaceae_unclassified、Betaproteobacteria_unclassified、Dechloromonas、Azoarcus、Thiobacillus、Rubrivivax和Halomonas顯著受到土地利用方式和施肥的影響，主成分分析結(jié)果表明，自然恢復(fù)和長期施肥處理改變了黑土反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，而季節(jié)變化并未影響其群落結(jié)構(gòu)。

1.3 揭示出幾種農(nóng)田管理措施對黑土農(nóng)田土壤微生物影響，為科學(xué)制定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施提供理論支撐

肥料管理是最常見的農(nóng)業(yè)管理措施，國內(nèi)外許多研究表明肥料管理顯著影響土壤微生物，但不同地點的研究結(jié)果不盡相同。東北黑土是地帶性土壤，我們前面研究結(jié)果揭示出不同地點土壤微生物差異明顯，但長期持續(xù)的相似施肥管理能否驅(qū)動不同地點的微生物群落結(jié)構(gòu)具有趨同性？有機(jī)肥和化肥對黑土帶上微生物產(chǎn)生什么樣的影響？為回答這些問題，我們與黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源研究所等單位合作，從黑土帶上3個長期定位實驗站采集無肥(NoF)、單施化肥(CF)、化肥配施有機(jī)肥(CFM)和有機(jī)肥(M)處理，采用高通量測序技術(shù)對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行解析[9]。我們發(fā)現(xiàn)盡管這3個地點不同的肥料管理方式已經(jīng)實施超過了30多年，宏觀來看3個地點微生物差異顯著，不同地點微生物群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。該發(fā)現(xiàn)從一個側(cè)面也驗證了黑土微生物生物地理分布格局的存在，同時也表明黑土帶上“一方水土生存一方微生物”。針對單個地點來看，不同施肥方式對黑土微生物群落結(jié)構(gòu)確實產(chǎn)生了影響，但這種影響在3個地點上的表現(xiàn)方式不同，即相同的施肥方式對不同地點微生物群落結(jié)構(gòu)組成影響不同，驅(qū)動不同地點微生物群落結(jié)構(gòu)變異的土壤因子也因地點而變化。該研究結(jié)果充分地證明不同地點的黑土微生物群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，施肥只能對立地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行微調(diào)。

我們還對一個地點單施N、P、K化肥和施用N、P、K化肥不同組合的土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究(未發(fā)表數(shù)據(jù))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有含N肥組合處理的nifH基因拷貝數(shù)顯著低于無N肥組合，含有N肥處理的固氮菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，明顯地區(qū)別于不含N肥處理的群落結(jié)構(gòu)組成。該結(jié)果揭示出黑土固氮菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成受到N肥的影響，P肥和K肥作用效果不明顯。

向土壤中施入生物炭具有增加土壤碳匯，改善土壤理化性狀，減少溫室氣體排放及提高土壤肥力等作用，生物炭農(nóng)用已經(jīng)成為國際上的研究熱點。目前國內(nèi)外關(guān)于生物炭作為土壤改良劑的研究多是基于一年內(nèi)的室內(nèi)培養(yǎng)或當(dāng)年的盆栽和田間試驗結(jié)果，而針對多年后的短期和長期效應(yīng)的研究還很少。東北黑土素以土壤有機(jī)質(zhì)含量高、土壤肥沃而著稱，但由于長期過度開發(fā)利用和不合理的農(nóng)業(yè)管理措施等原因，導(dǎo)致土壤酸化，土壤壓實和土壤肥力下降等退化問題嚴(yán)重?；谏锾抗逃械奶卣骱褪┤胪寥篮蟮膭討B(tài)，研究生物炭短期和長期的生態(tài)效應(yīng)對于科學(xué)制定生物炭施用策略具有一定的指導(dǎo)意義。為此，學(xué)科組于2012年建立了一個施用秸稈生物炭長期觀測研究平臺。生物炭按耕層土壤質(zhì)量的0、2%、4%和8%一次性混合施入土壤，大豆和玉米輪作種植，監(jiān)測生物炭對土壤理化性質(zhì)和土壤微生物的影響。我們于2014年分4次采集耕層土壤樣品，解析土壤理化指標(biāo)和土壤細(xì)菌和真菌群落變化情況[10-11]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用生物炭3年后仍然對土壤理化指標(biāo)有明顯的影響，表現(xiàn)為增加土壤全碳和全氮含量及土壤含水量，提高土壤pH以及降低土壤容重等。采用實時熒光定量PCR和Illumina Miseq測序技術(shù)對土壤細(xì)菌群落研究發(fā)現(xiàn)，添加生物炭增加了土壤細(xì)菌豐度，在門、屬和OTU等分類水平上均改變了細(xì)菌群落組成；施用生物炭增加了一些功能細(xì)菌的相對豐度，如芽孢桿菌屬(Bacillus)和土微菌屬(Pedomicrobium)等，而降低了慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)相對豐度；典范對應(yīng)分析(CCA)表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與土壤pH、全碳、全氮和全鉀含量緊密相關(guān)。在土壤真菌群落結(jié)構(gòu)方面的研究表明，生物炭施用也增加了土壤真菌豐度，在屬和OTU水平上改變了真菌群落結(jié)構(gòu)，但在門水平上沒有顯著影響；值得注意的是，生物炭施用降低了鐮刀菌屬(Fusarium)和黑粉菌屬(Ustilago)的相對豐度，說明施用生物炭有抑制植物病原菌生長繁殖的作用。CCA分析表明，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化與土壤理化指標(biāo)，如土壤pH、含水量、全碳、全氮、全鉀和速效鉀等密切相關(guān)。

1.4 研究了作物根際微生物和根內(nèi)生菌多樣性，為根際根內(nèi)微生態(tài)調(diào)控和有益微生物資源挖掘利用奠定了基礎(chǔ)

作物根際是作物與土壤進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的界面，也是土壤微生物最活躍的區(qū)域。受到根系分泌物或根際沉積物的影響，作物根際微生物具有非常強(qiáng)的根際效應(yīng)，與非根際土壤相比表現(xiàn)在微生物數(shù)量多，結(jié)構(gòu)組成不同。那么作物根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成有哪些？他們受到什么因素影響？為揭示作物的“根際對話”，我們采用盆栽和田間試驗相結(jié)合的方法，選取3種產(chǎn)量不同的大豆基因型、生長在兩種土壤(黑土和暗棕壤)上的根際細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了PCR-DGGE解析[12-13]。發(fā)現(xiàn)大豆根際微生物豐富度，不論細(xì)菌群落還是真菌群落均表現(xiàn)出隨生殖生長期進(jìn)程推進(jìn)而呈下降趨勢。土壤類型是決定大豆根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主導(dǎo)因子；細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均隨生育時期推進(jìn)而演替，表明生育期是影響大豆根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成的次要因素；不同大豆基因型只對根際可培養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生影響，而對整個細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響。該研究表明根際不同細(xì)菌對環(huán)境變化的響應(yīng)程度不同。根際可培養(yǎng)細(xì)菌可視做“r”類菌群，對環(huán)境變化敏感；根際大量的不可培養(yǎng)微生物可被看作為“k”類菌群，對環(huán)境變化不敏感。采用直接提取土壤DNA進(jìn)行檢測時，“r”類菌群的信息被掩蓋掉；而采用平板培養(yǎng)后再檢測，“r”類菌群的信息得以放大，基因型間的差異得以顯現(xiàn)。因此，在微生物生態(tài)學(xué)研究中，在注重分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用的同時，傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的重要性也不可忽視。

大豆連作障礙一個重要的關(guān)聯(lián)現(xiàn)象是連作會引起大豆根際微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。盡管這方面研究有許多報道，但由于受到研究手段的制約，我們對連作大豆根際微生物群落變化的了解還是“管中窺豹”。近年來，快速發(fā)展的高通量測序技術(shù)為全面認(rèn)識連作大豆根際微生物變化提供了解決途徑。為此，我們采用定量PCR和Illumina Miseq測序技術(shù)系統(tǒng)解析了連作和輪作大豆根際與非根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成[14]。結(jié)果表明，輪作大豆根際和非根際的細(xì)菌數(shù)量和多樣性均高于對應(yīng)的連作大豆根際和非根際土壤；與非根際土壤相比，不論連作還是輪作大豆根際土壤細(xì)菌數(shù)量多，但多樣性低。連作大豆根際和非根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與輪作大豆差異顯著，且根際較非根際細(xì)菌群落變化更顯著。Betaproteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Alphaproteobacteria是引起連作和輪作大豆根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要細(xì)菌門類。非根際土壤pH、全氮、全磷和速效氮磷鉀是引起連作和輪作非根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的土壤因子，其中土壤pH是主控因子。

作物根內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，研究根內(nèi)生菌多樣性對于發(fā)掘有益的內(nèi)生微生物資源，提高作物的抗逆和促生能力具有重要的意義。植物內(nèi)生菌多樣性研究一直以來是一個熱點也是難點課題，原因在于受植物細(xì)胞器，如葉綠體和線粒體遺傳物質(zhì)的干擾，現(xiàn)在普遍采用的核糖體DNA解析技術(shù)無法直接應(yīng)用于內(nèi)生菌多樣性的研究。為此學(xué)科組與日本鹿兒島大學(xué)合作，建立了鎖核苷酸引物PCR擴(kuò)增(LNA-PCR)和454高通量測序相結(jié)合的方法，解析出玉米和大豆根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成[15]。研究發(fā)現(xiàn)，采用LNA擴(kuò)增的植物樣品中測得的基因序列基本上源自內(nèi)生細(xì)菌，而未采用LNA的玉米和大豆根樣品分別有97.4%和67.8%序列來源于植物細(xì)胞器的序列；采用LNA擴(kuò)增的樣品的OTU數(shù)量、ACE、Chao1和Shannon指數(shù)均高于未加LNA擴(kuò)增的樣品，取得了預(yù)期研究結(jié)果。采用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和黃桿菌屬(Flavobacterium)是大豆內(nèi)生細(xì)菌的主要成員，而鏈霉菌屬(Streptomyces)和Niastella是玉米內(nèi)生細(xì)菌的主要成員。采用平板分離培養(yǎng)的方法，從大豆和玉米根內(nèi)獲得多株分泌IAA和對作物病原真菌產(chǎn)生拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌，對這些細(xì)菌進(jìn)行了16S rRNA基因鑒定和促生效果的研究[16]，采用多相分類學(xué)方法鑒定出一株賴氨酸芽孢桿菌新種，命名為Lysinibacillusendophyticus，典型菌株為C9T[17]。

1.5 率先開展了細(xì)菌病毒(噬菌體)基因多樣性研究，發(fā)現(xiàn)和建立一些新的噬菌體標(biāo)記基因類群

細(xì)菌病毒(噬菌體)是生物圈中數(shù)量最多的生命體，在控制寄主群落演替、生物進(jìn)化和地球生物化學(xué)循環(huán)中起到重要的作用。與環(huán)境中細(xì)菌、古菌和真菌等微生物遺傳基因多樣性的研究相比較，對環(huán)境中噬菌體遺傳基因多樣性研究很少。近年來，國際上針對海洋和湖泊水環(huán)境下的噬菌體基因多樣性研究進(jìn)展迅速，但針對陸地生態(tài)環(huán)境下的噬菌體基因多樣性研究相對滯后。為此學(xué)科組主要以我國東北不同土壤類型衍生出的稻田為研究對象，對稻田生態(tài)系統(tǒng)編碼T4型噬菌體主要殼蛋白的g23基因[18-20]、編碼噬藍(lán)藻體殼組裝蛋白的g20基因[21]、T7型噬藍(lán)藻體的DNA合成酶pol基因[22-23]、噬藍(lán)藻體編碼光和蛋白D1的psbA基因[24]和調(diào)控磷代謝的phoH基因[25]進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)許多新的基因序列，建立多個稻田獨特的噬菌體基因類群，揭示出噬菌體不同的分子標(biāo)記基因在海洋、湖泊和稻田等不同生態(tài)環(huán)境條件下的分布規(guī)律，在國際主流學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表相關(guān)研究論文15篇。

另外，我們還以大豆根瘤菌和煙草3種病原細(xì)菌(青枯、野火和角斑)為寄主，從土壤環(huán)境中分離獲得多株噬菌體，研究了這些噬菌體的生物學(xué)性狀，并對1株大豆慢生根瘤菌[26]和2株煙草青枯病噬菌體進(jìn)行全基因組分析報道[27-28]。這部分工作對于從噬菌體角度了解大豆根瘤菌群落演替規(guī)律和采用噬菌體療法防控細(xì)菌性病害具有積極的意義。

1.6 揭示出東北大豆品種資源遺傳演化關(guān)鍵性狀，為大豆高產(chǎn)育種指標(biāo)的選擇提供參考

對作物基因型進(jìn)行遺傳改良是提高作物產(chǎn)量的重要途徑。大豆產(chǎn)量增加是由于基因改良的結(jié)果，大豆育種的實質(zhì)是連續(xù)地從不同的祖先親本中積累目標(biāo)性狀的增效基因，而淘汰減效基因。然而，在大田生產(chǎn)條件下，對中國東北大豆遺傳改良的評價，并未進(jìn)行系統(tǒng)研究。

我們對過去50年東北大豆，尤其是黑土區(qū)主栽推廣的50余個有代表性的大豆品種進(jìn)行連續(xù)3年的田間試驗研究，重點解析了與產(chǎn)量相關(guān)的光合生理、根系特征等遺傳演化規(guī)律及其環(huán)境穩(wěn)定性[29-30]。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過50年的品種改良，大豆株高下降14.0%，干物質(zhì)重和收獲指數(shù)分別增加25.8%和35.1%，R5期光合速率呈逐漸增加的趨勢，根系生物量、根長及根體積提高，且R5后根系衰老緩慢，倒伏性狀及籽粒病蟲害也得到明顯改善，而且這些性狀與產(chǎn)量及產(chǎn)量性狀呈顯著相關(guān)關(guān)系[30]。品種推廣年代與產(chǎn)量之間表現(xiàn)出顯著的線性回歸關(guān)系，產(chǎn)量呈逐年增加的趨勢，平均每年提高1.27%；莢數(shù)、粒數(shù)也均顯著增加，平均每年提高0.54%和0.98%，但百粒重未表現(xiàn)出顯著變化；在品質(zhì)研究方面發(fā)現(xiàn)大豆蛋白質(zhì)和脂肪含量變化不大，且品種間變異幅度較小?；诒狙芯堪l(fā)現(xiàn)，我們提出高產(chǎn)大豆育種應(yīng)注重改良的指標(biāo)：注重光合速率、干物質(zhì)同化效率和氮素積累的提高。此研究結(jié)果為我國東北大豆高產(chǎn)育種指標(biāo)的有效選擇及品種資源保護(hù)提供理論參考。

1.7 闡明黑土區(qū)高產(chǎn)大豆冠層-根系關(guān)系，為群體調(diào)控大豆生長發(fā)育提供理論依據(jù)

作物生產(chǎn)是群體生產(chǎn)，而群體是由個體組成的，但不是個體的簡單相加。在一個生長周期內(nèi)，對產(chǎn)量形成起決定作用的結(jié)構(gòu)是群體光合系統(tǒng)和非光合系統(tǒng)達(dá)到最大值并相對穩(wěn)定時的結(jié)構(gòu)，而地上部群體結(jié)構(gòu)的優(yōu)化離不開地下部根系的協(xié)調(diào)生長。所以，研究東北黑土及氣候環(huán)境條件下大豆根系-冠層建成與產(chǎn)量形成的關(guān)系，對明晰產(chǎn)量限制因子，有目標(biāo)的選育高產(chǎn)品種至關(guān)重要。

針對高產(chǎn)大豆，開展了大豆根系時空分布與冠層特征關(guān)系的研究[30-31]。通過對大豆根系的動態(tài)及空間分布的量化研究，明確了黑土區(qū)主栽大豆品種根系生長發(fā)育模式，揭示了影響大豆地上部生長的根系關(guān)鍵特征，提出比根長礦質(zhì)養(yǎng)分吸收速率(SRA)的概念。發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代主栽品種根系生長量大，地上部向根系分配更多的干物質(zhì)，使得根冠比提高15%，根長增加24%，根系衰老延遲，在R5期后仍保持較高的根系活力，表現(xiàn)為臨近植株的土壤深層根系分布提高35%，根長和根表面積持續(xù)期相對提高27%，提出根長持續(xù)期與葉面積持續(xù)期顯著相關(guān)[31]。

闡釋了大豆根系生長與土壤養(yǎng)分的關(guān)系。磷影響根系的分級生長，顯著提高三級和四級根重，增加幅度分別為51%和57%；磷提高三級和四級根長和側(cè)根數(shù)量的作用更加明顯，根長的增加幅度為303%和797%，側(cè)根數(shù)量增加幅度為246%和433%，而磷對這兩個級別的側(cè)根的單根根長影響不大[32]。明確了磷通過優(yōu)先刺激三級和四級側(cè)根的分化來增加這兩個根級的根長，進(jìn)而改變大豆根系的生長模式。

1.8 揭示大豆光合碳和大豆殘體碳在黑土中的轉(zhuǎn)運機(jī)制，為不同有機(jī)質(zhì)含量黑土農(nóng)田的土壤有機(jī)質(zhì)形成和維持機(jī)制提供了直接佐證

系統(tǒng)研究植物根系生長過程中向土壤中釋放有機(jī)碳對于揭示陸地生態(tài)碳循環(huán)及優(yōu)化土壤有機(jī)碳管理具有重要意義。為此，我們采用13CO2脈沖式示蹤技術(shù)對大豆各生育期進(jìn)行標(biāo)記，動態(tài)監(jiān)測13C在地上部、根系、根瘤及土壤中的分布趨勢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑土上生長的大豆，地上部至少占當(dāng)天同化的碳的3/4，到成熟期，V4期地上部同化的碳僅占7.5%，而R6期的同化碳占71%；隨生育期進(jìn)程的增加同化碳向根系分配的比例逐漸下降，在R4期根瘤對碳的需求最高；V4期的同化碳75%以呼吸形式損失掉，而R6期僅有25%的同化碳被呼吸消耗；在大豆R5期前光合碳對土壤碳庫的動態(tài)貢獻(xiàn)較為穩(wěn)定，表明這部分光合碳對黑土有機(jī)碳有重要貢獻(xiàn)，在全生育期內(nèi)的貢獻(xiàn)率達(dá)到93%以上[33]。研究發(fā)現(xiàn)，在高有機(jī)質(zhì)黑土中大豆光合碳向土壤中的積累量大，而在低有機(jī)質(zhì)黑土中的光合碳大部分被土壤微生物呼吸利用[34]。大豆光合碳對黑土碳庫的貢獻(xiàn)受到土壤有機(jī)質(zhì)、礦質(zhì)粘粒及微生物共同作用的影響。大豆生長季向土壤中轉(zhuǎn)運的光合碳是黑土碳庫不可忽視的重要碳源。

東北黑土有機(jī)質(zhì)含量呈現(xiàn)明顯的地帶性分布特點，作物秸稈在腐解過程中向有機(jī)質(zhì)含量不同的農(nóng)田黑土土壤碳庫歸還量是否存在差異？作物秸稈碳的轉(zhuǎn)化的過程中都有哪些土壤微生物參與了？這些微生物在不同的黑土又存在哪些差異？回答這些問題有助于理解東北黑土農(nóng)田土壤有機(jī)碳“南低北高”的分布規(guī)律，對黑土科學(xué)管理和維持農(nóng)田土壤生產(chǎn)力有著重要的指導(dǎo)意義。為此，我們采用13C標(biāo)記技術(shù)解析不同大豆殘體(葉片、莖稈和根)的腐解過程，首次量化殘體的碳對黑土各個有機(jī)碳庫的貢獻(xiàn)。發(fā)現(xiàn)不同殘體顯著影響殘體有機(jī)碳向土壤各有機(jī)碳庫的轉(zhuǎn)化，順序為根>莖>葉[35]。根殘體中的碳向土壤顆粒有機(jī)碳中轉(zhuǎn)運更多的碳，在穩(wěn)定土壤碳庫方面發(fā)揮重要作用。

在明確大豆根殘體向黑土土壤碳庫歸還量大于莖和葉殘體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步解析了13C 標(biāo)記的大豆莖稈殘體向低、高有機(jī)質(zhì)含量黑土的轉(zhuǎn)化情況。研究發(fā)現(xiàn)，相同量的秸稈碳向有機(jī)質(zhì)含量高的黑土各有機(jī)碳庫(粗顆粒有機(jī)碳、細(xì)顆粒有機(jī)碳和礦物結(jié)合有機(jī)碳)貢獻(xiàn)量顯著高于低有機(jī)質(zhì)含量的黑土[36]；此外，秸稈還田對土壤固有有機(jī)碳產(chǎn)生了激發(fā)效應(yīng)，其效應(yīng)在低有機(jī)質(zhì)含量的黑土中更為顯著；同時采用高通量測序技術(shù)分析了秸稈添加對黑土土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，在屬以及OTU水平上揭示了土壤碳庫變化與微生物群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)關(guān)系；發(fā)現(xiàn)在低有機(jī)質(zhì)含量黑土中，Verrucosispora、Xanthomonadales和Steroidobacter對秸稈還田響應(yīng)顯著，而在高有機(jī)質(zhì)含量黑土中，主要的響應(yīng)菌屬是Anaerolineaceae_uncultured。該研究對黑土區(qū)的秸稈還田策略的制訂和秸稈碳轉(zhuǎn)化機(jī)制研究提供了指導(dǎo)意義。

1.9 研究了大氣CO2升高對豆科作物根際養(yǎng)分循環(huán)、大豆產(chǎn)量和根際微生物的影響，為未來氣候變化條件下提高我國作物的生態(tài)適應(yīng)性提供重要理論價值

大氣CO2濃度影響植物向土壤輸送有機(jī)物的模式，增加根系向土壤中釋放有機(jī)物(包括根系分泌物、根系脫落物等)，改變根際微生物活性、功能及相關(guān)代謝過程，進(jìn)而影響土壤養(yǎng)分循環(huán)過程。我們與澳大利亞國立大學(xué)、拉籌伯大學(xué)和維多利亞省農(nóng)業(yè)部合作，利用FACE系統(tǒng)對高CO2(550 ppm)影響碳分配、根瘤形成及根際養(yǎng)分有效性的機(jī)制開展研究[37-38]，發(fā)現(xiàn)高CO2條件下碳向地下部轉(zhuǎn)運的量明顯增加，同時促進(jìn)了側(cè)根分化、根瘤形成和氮固定，這種影響同植物地上部控制的生長激素類信號分子及相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)[38]。高CO2條件下根際土壤微生物活性提高21%，但土壤磷酸酶活性未受到影響，根際土壤有機(jī)態(tài)磷的含量升高32%，證明微生物功能對高CO2的響應(yīng)與根際養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，但這種轉(zhuǎn)化程度同植物種類和土壤理化條件有關(guān)。利用穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)進(jìn)一步驗證了CO2升高影響植物-微生物間碳流，進(jìn)而影響根際的養(yǎng)分循環(huán)[39]。此項研究揭示了CO2-光合碳-微生物的關(guān)系，這對于未來氣候變化條件下的土壤養(yǎng)分循環(huán)與利用有重要的理論意義。

我們利用開頂式氣候箱(OTC)對24個推廣面積大、具有代表性的東北大豆品種進(jìn)行CO2濃度升高以及正常大氣 CO2濃度處理條件下的大豆光合生理、內(nèi)源激素含量及Rubp酶活性及產(chǎn)量形成的機(jī)制研究。發(fā)現(xiàn)CO2濃度升高可顯著提高大豆花期的光合速率，但到鼓粒期，CO2處理對光合速率影響程度減弱；葉綠素也呈現(xiàn)相似的趨勢，開花期葉綠素含量在高CO2濃度條件下顯著高于正常CO2濃度，差異幅度為12.5%～72.2%；CO2處理對葉片IAA含量和Rubp酶活性并沒有產(chǎn)生顯著影響[40]；相關(guān)分析表明，CO2濃度的升高對產(chǎn)量的影響與光合速率和葉綠素含量顯著相關(guān)，但與葉片IAA和Rubp酶活性關(guān)系不大。CO2升高顯著提高大豆產(chǎn)量，但這種影響程度因品種而異。

為了明晰在高CO2條件下，大豆固氮能力是如何響應(yīng)的，我們采取OTC系統(tǒng)，以8個大豆品種為研究材料，選取了R5和R8兩個取樣時期，同時標(biāo)記穩(wěn)定同位素15N來研究高CO2條件下氮源吸收變化與產(chǎn)量的相關(guān)性。結(jié)果表明，大豆在高CO2條件下產(chǎn)量的增加與R5-R8期間共生生物固氮量的增加高度相關(guān)(r=0.95)。雖然高CO2條件下大豆在R5-R8期對肥料氮和土壤氮的吸收量也有小幅度增加，但是這種增加量與產(chǎn)量的增加沒有顯著的相關(guān)性。結(jié)果還表明，升高CO2濃度后營養(yǎng)組織的氮向籽粒中的轉(zhuǎn)運量呈下降趨勢，降低幅度與產(chǎn)量的增加幅度顯著相關(guān)。這與高CO2下大豆生殖生長后期共生固氮能力的增加密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)單個根瘤固氮能力的提高是固氮量增加的重要原因[41]。該研究揭示出CO2升高改變了大豆氮素的積累轉(zhuǎn)運模式，為未來大豆生產(chǎn)的精確氮肥調(diào)控和管理提供了重要的理論依據(jù)。

大氣CO2濃度的升高促進(jìn)了大豆生長，增加大豆光合碳向地下部的分配比例。從土壤微生態(tài)的角度，這些改變將會導(dǎo)致土壤生物地球化學(xué)特性的變化，同時影響土壤微生物生存的微環(huán)境。由于土壤微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)中扮演著重要的角色，在高CO2濃度下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的任何改變都可能會影響到植物養(yǎng)分的有效性，土壤碳存儲，甚至生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力及功能性。為了揭示CO2濃度升高是否對大豆根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，我們進(jìn)一步采用OTC系統(tǒng)，對4個大豆品種在兩種CO2濃度條件下大豆細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行高通量解析，研究結(jié)果清晰地表明，高CO2濃度改變了大豆根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。CO2濃度顯著影響了Gaiellales_uncultured、Acidimicrobiaceae_uncultured、Arthrobacter、Catelliglobosispora、Bryobacter、Bradyrhizobium、Ensifer、Pedomicrobium、Xanthomonadales_uncultured、Roseiflexus、Flavisolibacter、Chitinophagaceae_uncultured、480-2_norank、Gitt-GS-136_norank以及288-2_norank這些根際微生物在屬水平上的豐度，同時CO2濃度所引起的Pseudomonas、Escherichia-Shigella和RB41_norank的變化程度主要取決于大豆品種。Acidimicrobiales_uncultured、Iamia、Blastococcus、Nitrosomonadaceae_uncultured、Escherichia-Shigella、Bacillus、480-2_norank以及GR-WP33-30_norank這8種微生物在屬水平上受大豆品種調(diào)節(jié)最顯著[42]。

1.10 初步量化了黑土侵蝕對生產(chǎn)力的影響并提出了快速恢復(fù)措施

耕層變淺是農(nóng)田黑土侵蝕的最顯著的表征。基于耕層剝離長期定位試驗，確定耕層表土遺失0～5 cm，5～10 cm,10～20 cm為輕度、中度和重度退化的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)黑土輕度退化對作物產(chǎn)量影響不大，但黑土表層(A層)消失，玉米減產(chǎn)50%以上，大豆減產(chǎn)30%，黑土層每變薄1 cm，玉米平均減產(chǎn)80 kg·hm-2，大豆減產(chǎn)14.9 kg·hm-2[43]。

研究發(fā)現(xiàn)，黑土退化抑制了玉米根系的時空分布和養(yǎng)分吸收，輕度、中度和重度退化的黑土玉米苗期根長分別降低7.3%、12.2%和12.9%，根表面積降低10.3%、20.9%和24.2%，根重降低3.7%、4.9%和39.6%；根系生長顯著降低礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收，玉米籽實氮素吸收輕度、中度和重度分別減少17.2%、31.2%和50.5%，磷素吸收減少26.1%、33.5%和61.8%，鉀素吸收減少33.9%、49.2%和69.5%[44]。

首次量化了退化黑土作物根際低分子量有機(jī)酸組成，發(fā)現(xiàn)輕度和重度退化黑土玉米根際的低分子量有機(jī)酸總量比未退化黑土分別減少44%和87%，而大豆減少11%和86%。分析主要低分子量有機(jī)酸組成發(fā)現(xiàn)，玉米根際草酸減少36.8%和73.7%，蘋果酸減少11%和83%，丙二酸輕度無變化，重度減少87.5%，乳酸均減少80%左右，重度退化黑土已經(jīng)檢測不到馬來酸；同樣大豆根際草酸減少21.9%和78.1%，丙二酸減少29.8%和89.5%，乳酸減少25%和91%[45]。

發(fā)現(xiàn)玉米大豆輪作基礎(chǔ)上，正常施用化肥并連續(xù)每年施用15 t·hm-2的牛糞，可以在3年內(nèi)快速恢復(fù)嚴(yán)重退化黑土的有機(jī)碳含量，提高生產(chǎn)力，而且玉米產(chǎn)量提高幅度高于大豆。而且，連續(xù)施用15 t·hm-2的牛糞7年，可以完全恢復(fù)嚴(yán)重侵蝕的黑土的生產(chǎn)力[46]。長期施用牛糞可恢復(fù)嚴(yán)重侵蝕的黑土生產(chǎn)力的主要原因是：(1)增加有機(jī)碳30～45%，提高顆粒有機(jī)碳庫的碳沉積速率7.1～9.0倍；(2)分別增加玉米根際和非根際土低分子量有機(jī)酸70倍和62倍，大豆增加28倍和20倍；(3)顯著改善玉米、大豆的根際環(huán)境，提高養(yǎng)分有效性。全氮、潛在礦化氮、微生物量碳、脲酶和蔗糖酶活性平均分別增加7%、10.5%、15%、24.5%和25%[47-48]。

由此提出增施有機(jī)肥，更好的管理土壤微生物，是快速恢復(fù)嚴(yán)重退化的黑土并維持黑土生產(chǎn)力的關(guān)鍵，為退化黑土的快速恢復(fù)提供了理論性支持及高效可行的措施。但是，有機(jī)肥的長期施用有增加溫室氣體CO2排放的負(fù)面影響，實際應(yīng)用需要權(quán)衡恢復(fù)產(chǎn)量與環(huán)境效應(yīng)的關(guān)系[49]。

2 研究展望

東北黑土區(qū)是保障國家糧食安全的穩(wěn)壓器，也是保障國家生態(tài)安全的重要屏障。經(jīng)過多年的墾殖，東北黑土土壤質(zhì)量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，如何提高黑土農(nóng)田土壤地力？如何可持續(xù)地保護(hù)和利用好寶貴的黑土資源是每個在此區(qū)域從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、科研和管理者必須考慮的問題。農(nóng)田分子生態(tài)學(xué)科組作為在此區(qū)域從事農(nóng)業(yè)生態(tài)研究的一個單元，在未來的研究中，學(xué)科組將立足于黑土土壤生產(chǎn)力的可持續(xù)性發(fā)展，從土壤微生物生態(tài)角度深入解析微生物功能與土壤質(zhì)量和生產(chǎn)力的關(guān)系。研究內(nèi)容將發(fā)生4個轉(zhuǎn)變，即從微生物結(jié)構(gòu)基因向功能基因轉(zhuǎn)變，從單個基因向宏基因組學(xué)轉(zhuǎn)變，從土壤基因組學(xué)向土壤蛋白組學(xué)轉(zhuǎn)變，從不同尺度野外樣品調(diào)查向控制實驗研究微生物過程機(jī)理轉(zhuǎn)變。我們將不斷提升研究技術(shù)手段，采用第三代高通量測序技術(shù)和SIP技術(shù)研究秸稈還田的轉(zhuǎn)化機(jī)制，研究作物根內(nèi)根際微生物群落結(jié)構(gòu)及功能等；我們將關(guān)注黑土農(nóng)田環(huán)境污染問題，如抗生素抗性基因和重金屬污染問題等，盡管這些問題相比我國南方土壤體現(xiàn)的不突出，但未雨綢繆、提前布局有助于持續(xù)保護(hù)好黑土資源；我們也將關(guān)注全球氣候變化背景條件下，如大氣CO2濃度和溫度升高對植物生長、土壤碳庫，以及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，重點針對主栽作物開展光合碳在地下部的分配研究，以及高CO2濃度和溫度升高對根際碳流的影響，揭示作物光合碳對土壤有機(jī)碳組分的貢獻(xiàn)，探討環(huán)境變化對植物-土壤-微生物間物質(zhì)流和信息流的影響。同時還要深入開展耕層厚度與作物根系形態(tài)、發(fā)育以及耕層養(yǎng)分利用方面的工作。在做好基礎(chǔ)性研究工作的同時，也要有針對性地開展實用技術(shù)的開發(fā)工作，如高效生防菌和促生菌資源的利用等，直接服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、服務(wù)于生態(tài)文明環(huán)境建設(shè)。

總體而言，農(nóng)田分子生態(tài)學(xué)科組10年來的工作得到了研究所、各級科研管理部門的支持，同時也得益于學(xué)科組同事和學(xué)生們共同努力和國內(nèi)外同行的支持，但我們也清醒地知道，我們所取得的成績與國家戰(zhàn)略需求和應(yīng)實現(xiàn)的社會責(zé)任還有很大距離。回顧過去，展望未來，我們將秉持“踏石留印、抓鐵有痕”的棄而不舍精神，繼續(xù)為黑土區(qū)農(nóng)業(yè)健康發(fā)展做出新貢獻(xiàn)。

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