周宇波，李霞飛，高岳芳*，肖 斌，楊亞軍,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310000)

我國是主要茶葉生產(chǎn)國，茶園總面積居世界第一。然而我國茶葉生產(chǎn)總值并不高，其中一個主要原因是在茶葉的生產(chǎn)加工過程中，大量粗老枝葉和茶葉灰末等副產(chǎn)品常被丟棄，造成了自然資源的巨大浪費。研究發(fā)現(xiàn)茶多糖在成熟葉片中的含量比嫩芽中高[1]，并且茶多糖的生物活性也得到了廣泛關(guān)注與研究[2-6]，為茶樹葉片的高值化利用開辟了一條新的途徑。

目前茶多糖的提取方法很多，Y.F.Wang[7]等采用熱水浸提法對茶花中多糖進(jìn)行了提取純化；何曉梅[8]等采用酶法輔助提取低檔綠茶多糖，并對其抗氧化活性進(jìn)行了研究；李繼偉[9]等利用響應(yīng)面法優(yōu)化了微波輔助下綠茶多糖提取工藝條件；高仁金[10]等采用超聲波輔助酶法對茶葉廢料中茶多糖進(jìn)行提取。這些提取方法同樣適用于其他樣品多糖的提取，如張強[11]等采用超聲波輔助法提取南瓜葉多糖，并對其抗氧化活性進(jìn)行研究；劉婷[12]等使用超聲波法對西洋參多糖的提取工藝進(jìn)行研究；常昕[13]等采用水提醇沉法對博湖蘑菇多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。其中熱水浸提法是多糖類提取最常用的方法，但卻鮮有提及水熱法在多糖提取中的應(yīng)用。

水熱法是指在密封的壓力容器中，以水為溶劑，在高溫高壓的條件下進(jìn)行反應(yīng)，多應(yīng)用于納米材料的合成制備[14-17]。在密閉反應(yīng)體系中水受熱變成蒸汽并形成一定的壓強，茶葉中纖維素、半纖維素等的碳鏈發(fā)生裂解，形成分子質(zhì)量更小的水溶性多糖。水熱法不需要添加其他化學(xué)物質(zhì)或酶制劑，生產(chǎn)設(shè)備也比微波法和超聲波法簡單，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

本試驗將水熱法應(yīng)用于茶多糖的提取，并結(jié)合提取溫度、料液比、提取時間3個因素研究茶多糖提取得率。運用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化提取工藝，為茶多糖的提取提供嶄新的思路與試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍井長葉，陜西省漢中市南鄭縣牟家壩鎮(zhèn)何氏家庭農(nóng)場多年生茶園的成熟葉片。試驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MC-MRH-100高溫高壓反應(yīng)釜(北京滿倉科技有限公司)；FW-400AD高速萬能粉粹機(天津鑫博得儀器有限公司)；80目標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩(浙江省上虞市大亨橋化驗儀器廠)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；WFZ UV-2102C紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖提取 將茶樹葉片于80℃下烘干、粉碎、過80目篩。準(zhǔn)確稱取茶粉2 g，并使用攪拌提取的方法，在轉(zhuǎn)速400 r·min-1條件下，利用高溫高壓反應(yīng)釜對茶多糖進(jìn)行水熱提取。

1.3.2 粗多糖得率測定 將提取液真空抽濾、棄殘渣，濾液定容至250 mL，定容后的溶液使用苯酚硫酸法[18]在490 nm處測定吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得出多糖濃度，再代入多糖得率公式，即得到茶多糖得率。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用蒸餾水溶解后定容至100 mL容量瓶中，再吸取該溶液10 mL至100 mL容量瓶中，即得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，補水至1.0 mL，配制成0、20、40、60、80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)待測液。在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)待測液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻后再加入3.5 mL濃硫酸，充分混勻，靜置20 min后在波長490 nm處測定吸光度值，以葡萄糖質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)、吸光度值y為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

1.3.4 水熱法提取

1.3.4.1 單因素試驗 1)不同料液比處理：準(zhǔn)確稱取已預(yù)處理的茶葉粉末2.0 g，分別按料液比1∶15、1∶20、1∶25和1∶30(g·mL-1)于120℃下浸提60 min。2)不同浸提溫度處理：準(zhǔn)確稱取已預(yù)處理的茶葉粉末2.0 g，在料液比1∶20條件下，分別于100、120、140℃和160℃條件下浸提60 min。3)不同浸提時間處理：準(zhǔn)確稱取已預(yù)處理的茶葉粉末2.0 g，在料液比1∶20(g·mL-1)、120℃條件下，分別浸提30、60、90 min和120 min。

1.3.4.2 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以粗多糖提取率為考察指標(biāo)，用正交試驗L9(33)優(yōu)化龍井長葉中茶多糖水熱法的提取工藝，設(shè)置因素水平(表1)。

表1 因素與水平

1.3.5 樣品的測定 吸取樣品液0.1 mL，補水至1 mL，加入5%苯酚1 mL混勻后再加3.5 mL濃硫酸充分混勻，靜置20 min后于490 nm下測定吸光度。由回歸方程求出其濃度。根據(jù)濃度和稀釋倍數(shù)計算茶多糖得率。公式即：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長490 nm下建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.013x-0.001,R2=0.999。表明在0～100 μg·mL-1的葡萄糖濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 水熱法單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取溫度對茶多糖得率的影響 由圖2可知，隨著溫度的升高，茶多糖提取率先增加后減少，在120℃時達(dá)到最大值108.26 mg·g-1，之后隨著溫度的提高，得率下降。說明提取溫度升高對茶多糖得率的升高作用有一定的限度，到達(dá)極限后再升高溫度，反而會使茶多糖得率降低。因此當(dāng)茶粉質(zhì)量為2 g，提取時間為60 min，固液比為1∶20時，最佳提取溫度為120℃。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 提取溫度對茶多糖得率的影響

2.2.2 提取時間對茶多糖提取率的影響 由圖3可知，隨著提取時間的增加，提取率先略有升高再降低，當(dāng)提取時間為60 min時，茶多糖得率最高，為109.75 mg·g-1，之后增加提取時間反而導(dǎo)致得率下降。說明提取時間的延長對茶多糖得率的升高作用有一定的限度，到達(dá)極限后再增加提取時間，反而會使茶多糖得率降低。因此當(dāng)茶粉質(zhì)量為2 g，提取溫度為120℃，固液比為1∶20時，最佳提取時間為60 min。同時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取時間為90 min時，得率下降并不明顯，可知提取時間對多糖得率的影響并不明顯。

2.2.3 固液比對茶多糖提取率的影響 由圖4可知，隨著固液比的增加，茶多糖提取率先增加后又減少，且在1∶20時，得率最高，達(dá)到108.45 mg·g-1，說明液料比升高對茶多糖得率的升高作用有一定的限度，到達(dá)極限后再升高液料比，反而會使茶多糖得率降低。因此當(dāng)茶粉質(zhì)量為2 g，提取溫度為120℃,提取時間為60 min時，最佳提取固液比為1∶20。

2.3 正交試驗結(jié)果

由表2中極差R值可得，影響茶多糖得率的主次因素順序為：提取溫度>固液比>提取時間，水熱法提取茶多糖的最佳工藝組合為A3B2C3，即提取溫度120℃、提取時間90 min、固液比1∶25(g·mL-1)。

圖3 提取時間對茶多糖得率的影響

圖4 固液比對龍井長葉中茶多糖得率的影響

編號因素提取時間/min提取溫度/℃固液比/(g·mL-1)得率/(mg·g-1)1301001∶1512.602301201∶2099.113301401∶2597.504601001∶2068.845601201∶25100.726601401∶1574.997901001∶2595.468901201∶1597.489901401∶2089.41K169.7358.9761.69K281.5299.1086.04K394.1287.397.89R24.3940.1336.20優(yōu)水平A3B2C3主次因素BCA

2.4 驗證試驗

由表3可知，按照正交試驗優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件，即提取溫度120℃、提取時間90 min、固液比1∶25 (g·mL-1)。平行做了3次試驗，茶多糖得率達(dá)到(110.23±0.49)mg·g-1，高于正交試驗表中各試驗的結(jié)果，且該工藝重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。

表3 驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究采用水熱提取法對龍井長葉中茶多糖進(jìn)行提取，運用苯酚-硫酸法測定茶多糖得率，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化，得到水熱法提取龍井長葉中茶多糖的最佳工藝條件為：提取溫度120℃，提取時間90 min，固液比1∶25 (g·mL-1)，多糖得率為110.23 mg·g-1。

池愛萍[19]等以紫陽富硒茶為原料，采用傳統(tǒng)熱水法，對經(jīng)過80%乙醇沉淀后的茶渣用80℃熱水浸提4 h，茶多糖得率為3.97%，低于本試驗中最佳得率110.23 mg·g-1。郭艷紅[20]等采用酶法，結(jié)果表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的茶葉水解酶，在pH 5.5，溫度48℃的條件下，茶多糖含量最高，得率為2.01%，同樣低于本試驗的110.23 mg·g-1。本試驗中茶多糖得率相對于傳統(tǒng)熱水浸提法和酶提取法較高的原因，一方面與使用水熱法有關(guān)，當(dāng)溫度高于100℃時，水受熱形成蒸汽使細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素等親水性成分和一些分子量較大的多糖充分發(fā)生裂解，而且加速了其形成水溶性多糖的時間。另一方面可能與試驗中使用攪拌提取有關(guān)，攪拌可以提高反應(yīng)體系的傳質(zhì)速率，縮短反應(yīng)時間，加快多糖的溶出。因此本試驗的提取時間不僅遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)熱水提取法的浸提時間，還低于酶解法。此外茶多糖的提取率及影響茶多糖提取率的因素主要與茶葉的品種、年齡、生長環(huán)境、加工狀態(tài)、所在器官部位等多種因素有關(guān)[21]，這些因素不同也會導(dǎo)致得率的差異。

本試驗使用水熱法提取茶多糖，為茶多糖的高效、高得率的提取開辟了嶄新的途徑，進(jìn)一步開展茶多糖的純化，結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性等方面的探索與分析，將為茶多糖工業(yè)化提取及茶多糖在藥品、食品等領(lǐng)域的開發(fā)提供技術(shù)指導(dǎo)。

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