王力群 鄭 曦 吳欽穗 陳 魁 陳依期

（福州市第一醫(yī)院普外科13區(qū)，福建 福州 350009）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的1%～4.42%，以45～50歲多見，國(guó)內(nèi)普查報(bào)道甲狀腺癌發(fā)病率為11.44/10萬，近年來其發(fā)病率呈增高趨勢(shì)，近十年中國(guó)甲狀腺癌發(fā)病率升高3.9倍，是所有實(shí)體腫瘤中，發(fā)病率上升最快的癌癥。每年全世界約有122 000例新發(fā)病例，男女發(fā)病率之比約為1∶（3～4），男性約（0.8～5.0）/10萬，女性約（1.9～19.4）/10萬。雖然發(fā)病率升高明顯，但病死率并沒有升高，約占癌癥死亡病例的0.4%。其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）占75%～85%。對(duì)于甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的診斷主要依靠彩超和甲狀腺細(xì)針穿刺（fine needle aspiration，F(xiàn)NA）細(xì)胞學(xué)檢查。BRAF V600E基因突變是PTC最常見的遺傳學(xué)因素，也是甲狀腺癌變過程中的早期事件[1-2]。本研究選取53例術(shù)后病理證實(shí)的甲狀腺乳頭狀癌患者，術(shù)前經(jīng)過UG-FNA檢查提示見核異質(zhì)細(xì)胞，制備細(xì)胞蠟塊行免疫組化檢測(cè)BRAF V600E突變蛋白表達(dá)，并與術(shù)后石蠟標(biāo)本中BRAF V600E的表達(dá)進(jìn)行對(duì)照，以檢測(cè)該方法可靠性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取我院2014年7月至2017年3月甲狀腺乳頭狀癌病例53例，其中男性11例，女性42例；年齡32～69歲。平均年齡41歲。本組44例患者行患側(cè)甲狀腺腺葉+峽部+中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，9例行功能性頸淋巴結(jié)清掃術(shù)。同時(shí)選取10例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫或甲狀腺腺瘤良性病例石蠟標(biāo)本進(jìn)行對(duì)照。

1.2 穿刺方法和標(biāo)本制備。UG-FNAB穿刺方法：術(shù)前常規(guī)檢查凝血功能，并停用抗凝藥物5～7 d以上，告知患者穿刺注意事項(xiàng)，征得患者同意后簽署知情同意書。進(jìn)行FNA時(shí)，患者取仰臥位，肩下墊枕使頸部過伸，首先應(yīng)用高頻超聲探頭確定穿刺靶區(qū)，選擇穿刺點(diǎn)，穿刺路徑應(yīng)避開喉返神經(jīng)、血管、氣管所在區(qū)域，確定腫塊部位、大小、活動(dòng)情況、最淺表處，標(biāo)記定位。碘伏常規(guī)消毒皮膚，鋪巾，一般不用局麻藥，若患者過分緊張或深部結(jié)節(jié)可適當(dāng)予以局部麻醉后再行FNA，選擇7號(hào)針頭或22G～25G PTCD穿刺針，連接10 mL注射器，右手持注射器經(jīng)標(biāo)記點(diǎn)皮膚刺入，平行法超聲引導(dǎo)下進(jìn)入腫塊內(nèi)，到達(dá)適當(dāng)深度確定在腫塊內(nèi)后，回抽針?biāo)ǎ诰S持負(fù)壓的狀態(tài)下，在腫塊內(nèi)多點(diǎn)、多方向，反復(fù)穿刺抽吸3～6次，觀察針頭內(nèi)有少許淡褐色組織碎屑為佳。緩慢解除負(fù)壓并退出針頭。視標(biāo)本量情況，每個(gè)結(jié)節(jié)最多重復(fù)穿刺3次，穿刺涂片2張，95%乙醇快速固定，常規(guī)巴氏染色封片，剩余組織反復(fù)洗脫于細(xì)胞固定液中，備細(xì)胞蠟塊制備用，穿刺點(diǎn)局部有效按壓至少30 min，復(fù)查彩超無明顯出血后患者方可離開。

細(xì)胞蠟塊（cell block）制備：固定在細(xì)胞固定液中的剩余細(xì)針穿刺組織，多次離心后棄去上清液，用瓊脂沉淀包埋后，將凝固的細(xì)胞塊切片，常規(guī)脫水、石蠟包埋、HE染色，鏡檢。并進(jìn)行BRAF V600E突變免疫組化檢測(cè)。

手術(shù)標(biāo)本石蠟切片常規(guī)行BRAF V600E突變免疫組化檢測(cè)。

1.3 結(jié)果判斷：免疫組化染色采 用EnVision二步法，一抗BRAF V600E（VE 1）Ⅲ中杉公司提供：二抗及DAB試劑盒均購(gòu)自邁新公司。高倍視野（×400）下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)細(xì)胞巢，每個(gè)巢細(xì)胞數(shù)不少于10個(gè)，以＜5%腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色為陰性，≥5%腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色為陽(yáng)性，根據(jù)染色的強(qiáng)度分為：淡褐色（1+）；淡棕色（2+）；深棕色（3+）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率表示，分類對(duì)比采用Crosstabs統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

FNAB中甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞核極具特征性，包括毛玻璃狀（透明）細(xì)胞核、核內(nèi)假包涵體、核溝、核仁、核的微絲等。53例PTC患者BRAF V600E突變蛋白表達(dá)陽(yáng)性為43例，陽(yáng)性率81.13%（43/53）。術(shù)前UG-FNAB結(jié)合BRAF V600E突變檢測(cè)陽(yáng)性為38例，陽(yáng)性率71.70%（38/53）。診斷符合率88.37%（38/43），特異性100.00%（10/10），假陰性率11.63%（5/43）。與術(shù)后石蠟切片免疫組化檢查相比χ2值1.31，P值0.25，提示差異無顯著性，對(duì)照組10例良性結(jié)節(jié)中有0例BRAF V600E突變。

3 討 論

BRAF基因全名為鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1（v-raf murine sarcoma viraloneogene homolog B1）是1988年由Shunta Roikawa等在誘導(dǎo)禽原代細(xì)胞增殖和NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)并克隆確認(rèn)的，屬于RAF基因家族。BRAF是人類最重要的原癌基因之一，大約8%的人類腫瘤發(fā)生BRAF基因突變有關(guān)。BRAF基因V600E點(diǎn)突變具有很強(qiáng)的致癌作用，如促進(jìn)惡變細(xì)胞包膜外浸潤(rùn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，已經(jīng)得到很多實(shí)驗(yàn)的證實(shí)[3-4]。近年來，甲狀腺乳頭狀癌的分子特征和通路研究日趨深入。BRAF突變是目前其最常見的突變形式，BRAF基因是下游 MAPK 信號(hào)通路最強(qiáng)的激活劑。近期一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，BRAF突變與患者的復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯及AJCC分期（Ⅲ/Ⅳ期）有關(guān)[2,5-6]。

甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（fine needle aspiration）作為甲狀腺腫塊常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，具有創(chuàng)傷小，痛苦小，易為患者接受等優(yōu)點(diǎn)，而且術(shù)中冰凍切片由于冰晶效應(yīng)，常常造成細(xì)胞核空殼，呈假性“核內(nèi)包涵體”，導(dǎo)致甲狀腺乳頭狀癌的假陽(yáng)性診斷，所以目前美國(guó)許多醫(yī)院將術(shù)前FNA作為甲狀腺術(shù)中冰凍的必要補(bǔ)充[7-10]。

細(xì)胞蠟塊切片中，瘤細(xì)胞相對(duì)集中，呈巢狀分布，細(xì)胞核形態(tài)大小不一，細(xì)胞呈單層排列，沒有細(xì)胞重疊擁擠現(xiàn)象，免疫組化效果好。同術(shù)后石蠟切片的免疫組化相比一致性較高，可作為術(shù)前FNA結(jié)合BRAF V600E突變檢測(cè)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠的檢查方法。但如果穿刺標(biāo)本量太少，影響CB的制作，容易造成假陰性診斷。

目前高頻超聲檢查對(duì)于甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷敏感性為 100%，但特異性僅為40.6%，F(xiàn)NA 作為甲狀腺結(jié)節(jié)良、惡性鑒別的可靠方法，其敏感度為83%（65%～98%），特異度為92%（72%～100%），由于不同治療單位診療技術(shù)水平差異，即使FNA仍有較高誤差。約有10%～40%的甲狀腺結(jié)節(jié)通過穿刺活檢不能確定性質(zhì)。本組實(shí)驗(yàn)中采用FNA細(xì)胞蠟塊結(jié)合BRAF V600E突變檢測(cè)與術(shù)后病理相比，診斷符合率88.37%（38/43），特異性100.00%（10/10），對(duì)照組良性結(jié)節(jié)中BRAF V600E突變沒有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性，提示BRAF V600E突變沒有假陽(yáng)性，因此術(shù)前UG-FNAB結(jié)合BRAF V600E突變檢測(cè)可提高惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷率，由于BRAF V600E突變與甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此對(duì)甲狀腺癌分層治療及預(yù)后評(píng)估亦有指導(dǎo)意義。