張國(guó)榮，劉 楠，徐 洋，劉 莉,3

(1. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院藥理評(píng)價(jià)研究中心，上海 200040；2. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200437；3. 上海市生物物質(zhì)成藥性評(píng)價(jià)專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200437)

呼吸道病毒和細(xì)菌感染誘發(fā)的炎癥能夠使呼吸道疾病惡化，如哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、肺部囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)[1]，疾病惡化會(huì)導(dǎo)致死亡率升高。然而，目前缺乏有效的方法能阻止呼吸道疾病的發(fā)生和惡化。為了明確疾病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)展并驗(yàn)證新的治療方法，許多研究者致力于建立能夠準(zhǔn)確模擬臨床人類(lèi)呼吸道疾病特征的小鼠模型。通過(guò)對(duì)已發(fā)表的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的調(diào)研，本文對(duì)感染加重以上3種常見(jiàn)呼吸道疾病的小鼠模型的研究現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)論述，以促進(jìn)此類(lèi)模型的正確運(yùn)用以及治療藥物的研發(fā)。

1 感染加重哮喘的小鼠模型

呼吸道病毒和細(xì)菌感染與哮喘的發(fā)生及惡化息息相關(guān)[1]，迄今為止，已有大量關(guān)于小鼠呼吸道感染加重哮喘的研究。本部分內(nèi)容根據(jù)小鼠感染年齡的不同，將此類(lèi)研究分為兩種，分別是生命早期感染和成年期感染。

1.1生命早期感染加重小鼠的哮喘模型早期的研究表明，新生兒和初生小鼠的Ⅱ型T輔助細(xì)胞(T helper cell 2，Th2)的免疫調(diào)節(jié)活性遠(yuǎn)低于成年期，所以許多研究者開(kāi)始應(yīng)用初生的小鼠模型研究感染加重哮喘的機(jī)制[2]。

已知呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染能夠誘導(dǎo)兒童支氣管哮喘的發(fā)生和發(fā)展[3]。Siegle等[4]在小鼠初生即感染鼠肺炎病毒(與RSV同種屬)，感染恢復(fù)后，滴鼻給予卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏，再使其長(zhǎng)期吸入霧化OVA，發(fā)現(xiàn)小鼠成功發(fā)展為慢性哮喘，并導(dǎo)致Th2相關(guān)的細(xì)胞因子包括白介素4(interleukin 4，IL-4)、IL-5、IL-13表達(dá)增多。

鼻病毒(rhinovirus，RV)感染是嬰幼兒哮喘發(fā)病的高危因素。Han等[5]發(fā)現(xiàn)，RV感染能夠誘導(dǎo)小鼠的肺部黏液化生和氣道高敏(airway hyperreactivity，AHR)，2型先天性淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cells，ILC2s)的數(shù)目以及IL-13、IL-25的表達(dá)增加，并且缺乏正常的γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)反應(yīng)[6]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)恢復(fù)小鼠的IFN-γ反應(yīng)，能抑制表達(dá)IL-13的ILC2s的擴(kuò)增，從而抑制哮喘的發(fā)展，說(shuō)明IFN-γ可能是治療哮喘的靶標(biāo)[6]。Han等[5]應(yīng)用Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，TLR2+巨噬細(xì)胞是RV誘導(dǎo)感染的必要因素。

此外，研究者發(fā)現(xiàn)，生命早期的肺炎衣原體感染能夠誘導(dǎo)Th2免疫反應(yīng)，以及肺部結(jié)構(gòu)和功能的永久性改變[2]。Starkey等[7]使腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)基因敲除的小鼠感染肺炎衣原體，發(fā)現(xiàn)TRAIL與生命早期衣原體感染的嚴(yán)重程度相關(guān)。此外，Starkey等[8]發(fā)現(xiàn)，在敲除IL-13基因的小鼠體內(nèi)，感染誘導(dǎo)的持續(xù)AHR消失，應(yīng)用抗IL-13的單克隆抗體可以防止嚴(yán)重過(guò)敏性氣道病的發(fā)生。由此推斷，通過(guò)靶向TRAIL和IL-13，可能對(duì)生命早期衣原體感染誘導(dǎo)的嚴(yán)重哮喘有治療作用。

總之，以上研究表明，生命早期的呼吸道感染可能對(duì)肺部結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)產(chǎn)生永久性的改變作用。

1.2成年期感染加重小鼠的哮喘模型感染使哮喘惡化的成年病人也會(huì)表現(xiàn)出AHR和Th2細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)等病理特征。然而，成人的呼吸道感染更多會(huì)誘導(dǎo)抵抗類(lèi)固醇治療的中性粒細(xì)胞炎癥[1]。目前，研究者也建立了此類(lèi)哮喘小鼠模型來(lái)進(jìn)一步探究感染與哮喘的關(guān)系。

大量的臨床數(shù)據(jù)表明，呼吸道衣原體感染與嚴(yán)重的抵抗類(lèi)固醇治療的哮喘相關(guān)[9]。 Horvat等[10]使小鼠在經(jīng)OVA敏化和激發(fā)前7 d感染衣原體，發(fā)現(xiàn)衣原體感染能使OVA誘導(dǎo)的Th2反應(yīng)和嗜酸性粒細(xì)胞炎癥減輕，但會(huì)使Th1和Th17反應(yīng)以及中性粒細(xì)胞炎癥增加。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞的數(shù)量與炎癥小體3(inflammasome 3，NLRP3)和IL-1β mRNA的表達(dá)呈正比。通過(guò)給予模型小鼠IL-1β的中和抗體能夠使IL-1β的表達(dá)水平降低，氣道炎癥和AHR減輕，說(shuō)明靶向肺部增高的IL-1β可能是難治性哮喘的有效治療靶標(biāo)[9]。Essilfie等[11]應(yīng)用流感嗜血桿菌，也得出Horvat等類(lèi)似的結(jié)果，此外還發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的炎癥增加與IL-17的表達(dá)增加相關(guān)，通過(guò)應(yīng)用抗IL-17的單克隆抗體能消除感染誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞炎癥。

Chen等[12]應(yīng)用RSV感染加重哮喘的小鼠模型證實(shí)，溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain and extra-terminal, BET)蛋白抑制劑能明顯抑制AHR，減少巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量以及細(xì)胞因子的表達(dá)水平，說(shuō)明BET蛋白可以作為治療抵抗類(lèi)固醇的炎癥性哮喘的潛在靶標(biāo)。

總之，細(xì)菌或病毒進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)首先利用Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答的不足來(lái)加重哮喘癥狀，然后通過(guò)誘導(dǎo)Th1和(或)Th17免疫反應(yīng)，造成抵抗類(lèi)固醇治療的嚴(yán)重哮喘[1]。

2 感染加重COPD的小鼠模型

COPD是一種由有害氣體或顆粒引起的，以慢性阻塞性細(xì)支氣管炎、肺氣腫和黏液堵塞為病理特點(diǎn)的，慢性進(jìn)行加重的呼吸系統(tǒng)疾病。COPD病人病情的惡化通常是由并發(fā)癥的發(fā)展或呼吸道細(xì)菌或病毒感染所致[16]。本部分內(nèi)容根據(jù)COPD模型小鼠建立的不同，將研究者對(duì)于感染加重COPD小鼠模型的研究分為兩類(lèi)。

2.1感染加重吸煙誘導(dǎo)的COPD小鼠模型由于吸煙是人類(lèi)COPD的主要誘因，所以吸煙誘導(dǎo)COPD的小鼠模型能夠準(zhǔn)確模擬人類(lèi)COPD的發(fā)生[13]。流行病學(xué)研究顯示，大約一半的COPD病人的病情惡化是由病毒感染引起的，常見(jiàn)的有流感病毒、RSV、RV[14]。研究者使BALB/c小鼠暴露于煙霧4 d(短期)后感染流感病毒，發(fā)現(xiàn)與單純吸煙或病毒感染的小鼠相比，經(jīng)雙重刺激小鼠的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、病毒特異性CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)目增多[13]。研究者使C57BL/6小鼠吸煙3～5個(gè)月(長(zhǎng)期)后也發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染能夠加重炎癥反應(yīng)，具體表現(xiàn)出氣道中TNF-α、IL-6、IFN表達(dá)的增加，以及死亡率的升高[14]。

由于應(yīng)用活性病毒的實(shí)驗(yàn)需要采取防護(hù)措施，且實(shí)際操作困難，研究者應(yīng)用聚肌胞苷酸[poly(I:C)]模擬病毒感染，成功建立了COPD惡化的小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)香煙暴露與poly(I:C)共刺激能夠加速肺氣腫和氣道纖維化的進(jìn)程，增加中性粒細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)AHR[13]。

呼吸道細(xì)菌感染也是COPD惡化的誘因，Richmond等[15]使能自發(fā)發(fā)展為COPD表型的多聚免疫球蛋白基因敲除的小鼠吸煙6周后，感染流感嗜血桿菌，發(fā)現(xiàn)小鼠的小氣道壁重塑程度和肺氣腫癥狀加重，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目增多。Pichavant等[16]使小鼠吸煙12周后感染肺炎鏈球菌，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的IL-17和IL-22的表達(dá)增加。以上研究表明，細(xì)菌感染和香煙暴露對(duì)COPD惡化有協(xié)同促進(jìn)作用。

結(jié)合臨床研究的結(jié)果分析，以上小鼠模型能夠模擬感染使COPD惡化的病理特征，可以被用于進(jìn)一步探索疾病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的治療方法。

2.2感染加重彈性蛋白酶誘導(dǎo)的COPD小鼠模型雖然吸煙誘導(dǎo)的COPD小鼠模型能夠模擬人類(lèi)COPD的發(fā)病特征，但即使長(zhǎng)期煙霧暴露也很難造成嚴(yán)重的COPD?？紤]到人體內(nèi)彈性蛋白酶的失調(diào)能夠誘導(dǎo)COPD，研究者開(kāi)始應(yīng)用其作為COPD模型小鼠的誘因[17]。Ganesan等[18]給小鼠灌注4周彈性蛋白酶和LPS，誘導(dǎo)COPD樣肺部炎癥和肺氣腫，然后使小鼠感染流感嗜血桿菌，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的細(xì)菌清除能力下降，中性粒細(xì)胞炎癥增加，黏液分泌時(shí)間延長(zhǎng)，與巨噬細(xì)胞吞噬作用相關(guān)的清道夫受體A表達(dá)減少[18]。研究顯示，清道夫受體A在小鼠體內(nèi)的細(xì)菌清除能力中發(fā)揮重要作用，其基因突變也會(huì)增加人類(lèi)COPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。然而，Singanayagam等[17]表示，多次接觸彈性蛋白酶和LPS后感染RV的模型小鼠，不能模擬臨床RV感染加重COPD的病征。相反，通過(guò)單次給予彈性蛋白酶后滴鼻感染RV的方式，可以使氣道中的中性粒細(xì)胞炎癥升高，包括TNF-α、CXCL10、CCL5、CXCL2表達(dá)增加，黏液分泌增加和AHR。此外，研究者分析了可能造成第1種造模方式失敗的原因，一是長(zhǎng)期LPS暴露會(huì)減少中性粒細(xì)胞數(shù)量，以及RV誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)；二是大量的彈性蛋白酶會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷，從而會(huì)阻礙之后的炎癥反應(yīng)[17]。

總之，以上研究表明，感染加重彈性蛋白酶誘導(dǎo)的COPD小鼠模型，可以模擬臨床COPD惡化的病理特征。然而，關(guān)于彈性蛋白酶的應(yīng)用方法還存在爭(zhēng)議，今后需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證，從而促進(jìn)這種建模方式的應(yīng)用。

3 感染加重肺部CF的小鼠模型

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)感染在肺部CF病人中最為常見(jiàn)，長(zhǎng)期的呼吸道PA感染也是肺部CF病變最嚴(yán)重的風(fēng)險(xiǎn)因素[19]。所以，本部分內(nèi)容主要總結(jié)目前關(guān)于PA感染使兩種小鼠模型(野生型和基因改造型)肺部CF惡化的研究進(jìn)展。

3.1PA感染加重基因改造小鼠的肺部CFCF是一種因囊性纖維化跨膜受體(CF transmembrane regulator，CFTR)失調(diào)而誘發(fā)的復(fù)雜的多器官疾病，其中肺部CF是CF研究的熱點(diǎn)[20]。早在1992年，先天患有CF的CFTR基因敲除(Cftr-/-)小鼠建立,并被廣泛應(yīng)用于疾病機(jī)制的探索[20]。Wu等[20]給Cftr-/-小鼠鼻內(nèi)滴注PA的LPS，發(fā)現(xiàn)小鼠的氣道狹窄加劇，BALF中的花生四烯酸和前列腺素增多，隨之證實(shí)，能促進(jìn)花生四烯酸產(chǎn)生的胞質(zhì)型磷脂酶A2α(cytosolic phospholipase A2α，cPLA2α) 在氣道狹窄的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，可以被用作肺部CF的治療靶標(biāo)。Paroni等[21]也發(fā)現(xiàn)，耐藥性PA菌株感染使Cftrtm1UNC小鼠的白細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平增加，此外還發(fā)現(xiàn)，穿透素3能夠使CF小鼠肺部的IL-17和CCL2/MCP-1表達(dá)水平明顯降低，顯示出良好的治療效果。

除了關(guān)注CFTR，Antje等[22]也探究了小鼠基因型對(duì)CF的影響，發(fā)現(xiàn)Cftrtm1Unc-Tg(FABPCFTR)1Jaw/J小鼠與其同源野生型小鼠被PA感染的影響程度較低，然而CftrTgH(neoim)Hgu小鼠與其同源野生型小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的感染癥狀，說(shuō)明在PA感染誘導(dǎo)CF的發(fā)展中，基因背景可能比CFTR失調(diào)更為重要。 然而，Emanuela等[23]的研究指出，雖然野生型小鼠和Cftr-/-小鼠在長(zhǎng)期接觸PA的LPS后，都表現(xiàn)出肺部損傷，但野生型小鼠很快恢復(fù)正常，Cftr-/-小鼠卻轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)期慢性炎癥,說(shuō)明Cftr-/-小鼠在此類(lèi)模型的應(yīng)用中顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

3.2PA感染誘導(dǎo)野生型小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重肺部CF在應(yīng)用野生型小鼠時(shí)，研究者關(guān)注的是，通過(guò)PA菌株和小鼠基因型的選擇以及造模方式的改進(jìn)，使PA在小鼠肺部定植時(shí)間延長(zhǎng)，建立慢性嚴(yán)重性肺部CF小鼠模型。在PA的應(yīng)用中比較明確的是，給小鼠氣管或鼻內(nèi)移植固定介質(zhì)(如瓊脂、瓊脂糖、海藻藻酸鹽等)包裹的PA菌株能延長(zhǎng)細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的定植時(shí)間[19]。黏液型PA比同源非黏液型菌株在小鼠肺中的存活率更高。此外，接種菌株的數(shù)目也會(huì)影響造模效果[19]。

不同的小鼠品系具有不同的疾病易感性，如C57BL/6NCrlBR小鼠易感急性中性粒細(xì)胞炎癥為主的廣泛組織損傷。然而，組織損傷較輕或無(wú)的慢性肉芽腫樣炎癥在BALB/c中更為常見(jiàn)。此外，小鼠品系之間微小的基因型差異也會(huì)影響慢性PA的易感性[19]。

Facchini等[24]成功地使PA的臨床株RP73在C57Bl/6NCr小鼠的氣管內(nèi)存在了3個(gè)月以上，而且小鼠的肺部病變與晚期肺部CF患者相似。Bayes等[25]給C57BL/6小鼠氣管內(nèi)接種PA的臨床黏液株NH57388A，小鼠表現(xiàn)出急性死亡率降低、體質(zhì)量降低、中性粒細(xì)胞增多、抗生素治療無(wú)效等人類(lèi)CF特征。兩個(gè)研究都指出，發(fā)展為慢性PA感染的小鼠是支氣管或部分肺葉的感染，而不是整個(gè)肺實(shí)質(zhì)的感染，說(shuō)明部分肺部感染可能是實(shí)現(xiàn)慢性感染的關(guān)鍵[24-25]。

4 結(jié)語(yǔ)

小鼠模型是幫助研究氣道炎癥誘發(fā)疾病和疾病惡化進(jìn)程的有效工具，通過(guò)控制感染的時(shí)間和水平以及其他條件，模型小鼠能夠比較準(zhǔn)確地反映感染對(duì)慢性呼吸道疾病的影響，幫助闡明疾病的機(jī)制，識(shí)別疾病治療的新靶點(diǎn)，此外，還可用于新方法療效的驗(yàn)證[1]。

通過(guò)小鼠模型的應(yīng)用，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生命早期的病毒和細(xì)菌感染會(huì)改變肺部結(jié)構(gòu)和免疫應(yīng)答，加重哮喘[5]。在接下來(lái)的生命進(jìn)程中，免疫表型會(huì)被進(jìn)一步改變，發(fā)展為抵抗類(lèi)固醇治療的嚴(yán)重疾病癥狀[11]。吸煙或彈性蛋白酶誘發(fā)COPD小鼠的呼吸道感染會(huì)使氣道和肺泡的炎癥和重塑水平進(jìn)一步增加[13,17]。PA感染能夠加重肺部CF小鼠的疾病癥狀，同時(shí)CF小鼠更易遭受PA感染。然而，還有很多機(jī)制未明的臨床案例有待建立相應(yīng)的小鼠模型，例如生命早期感染結(jié)合成年期吸煙加重哮喘，以及生命早期病毒和細(xì)菌共感染誘發(fā)哮喘。目前，有研究建立了病毒誘導(dǎo)二次感染細(xì)菌的COPD小鼠模型，應(yīng)用不同的病原感染時(shí)間和細(xì)菌病毒組合建立的模型，表現(xiàn)出相似的病毒細(xì)菌共感染的機(jī)制，例如病毒感染恢復(fù)期間產(chǎn)生的干擾素會(huì)損害機(jī)體的細(xì)菌防御屏障等[14]，但是這種小鼠模型還有待完善。

值得注意的是，考慮到實(shí)驗(yàn)操作中存在的安全風(fēng)險(xiǎn)因素，通過(guò)動(dòng)物模型得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不可能在臨床人體上驗(yàn)證的，所以，在解釋小鼠模型表現(xiàn)出的結(jié)果以及將結(jié)果轉(zhuǎn)換到人類(lèi)研究時(shí)，必須注意確保疾病特征的一致性[14]。由于人類(lèi)和小鼠之間存在種屬差異，而且?guī)缀醪豢赡茉谏芷谶^(guò)短的小鼠身上復(fù)制人類(lèi)經(jīng)過(guò)多年的多重感染才引發(fā)的疾病的特征，所以動(dòng)物模型幾乎不可能精確模擬人類(lèi)疾病[23]。但是，在充分了解疾病基礎(chǔ)上發(fā)展臨床前動(dòng)物模型，將會(huì)對(duì)人類(lèi)疾病的研究提供極大幫助。