包銀莉，曾旭健，趙金旺*，胡 勇

（1．四川海林格生物制藥有限公司，四川 成都 611130；2．成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130）

黏膜是動物機體內(nèi)表面積最大的一個組織，由呼吸道、消化道、泌尿生殖道、眼角膜、內(nèi)耳以及多種外分泌腺的管道黏膜所構(gòu)成。它是動物機體與內(nèi)、外環(huán)境進行物質(zhì)交換和信息交流的重要部位，同時也是多種病原微生物及其他抗原侵入機體的主要門戶。報道指出：95%以上的傳染病病原微生物的入侵門戶是由黏膜入侵機體。如大腸桿菌、沙門氏菌、豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒等主要通過胃腸道入侵；豬繁殖與呼吸綜合征病毒、流感病毒、豬肺炎支原體等主要通過呼吸道入侵。因此，黏膜是機體抵抗病原微生物入侵的第一道屏障。黏膜屏障主要由上皮細(xì)胞間緊密連接所形成的生物學(xué)結(jié)構(gòu)屏障、微生物菌群所形成的微生物屏障、含有多種生物活性物質(zhì)的黏液屏障等構(gòu)成，形成了一個具有獨特免疫學(xué)功能的獨立免疫體系——黏膜免疫系統(tǒng)。

黏膜免疫系統(tǒng)不僅在體內(nèi)分布廣泛，而且其所含淋巴組織也是數(shù)量最多的。已知的黏膜部位免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、B細(xì)胞）和免疫分子（如SIgA、IgM）的數(shù)量均超過其他免疫系統(tǒng)，黏膜免疫系統(tǒng)在防御傳染病的發(fā)生中發(fā)揮著非常重要的作用。因此，本文將從黏膜免疫系統(tǒng)的組成及相互聯(lián)系、黏膜免疫的優(yōu)勢、黏膜免疫在動物疫苗中的應(yīng)用及挑戰(zhàn)等方面闡述黏膜免疫在動物疫病免疫防控中的重要地位和作用。

1 黏膜免疫系統(tǒng)的組成及相互聯(lián)系

黏膜免疫系統(tǒng)是指由呼吸道、消化道、泌尿生殖道黏膜及某些外分泌腺（如唾液腺、淚腺及乳腺等）黏膜相關(guān)淋巴組織所組成的免疫系統(tǒng)，包括黏膜相關(guān)淋巴組織（mucosal－associated lym-phoid tiss ue，MALT）、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、抗體、細(xì)胞因子和補體等。根據(jù)各組成結(jié)構(gòu)在解剖學(xué)和功能上的特性，黏膜免疫系統(tǒng)又被劃分為誘導(dǎo)位點和效應(yīng)位點。誘導(dǎo)位

點是黏膜系統(tǒng)首先接觸抗原的部位。在該部位，抗原物質(zhì)活化淋巴細(xì)胞，幼稚的B細(xì)胞和T細(xì)胞進行克隆選擇并與攝入的抗原接觸后進行增殖，然后活化的淋巴細(xì)胞從誘導(dǎo)位點遷移。誘導(dǎo)位點主要由MALT等構(gòu)成，發(fā)揮著向黏膜效應(yīng)位點提供記憶性B細(xì)胞和T細(xì)胞的作用。它包括T細(xì)胞區(qū)，可以產(chǎn)生表面黏膜IgA的B細(xì)胞富集區(qū)以及具有用于啟動特異性免疫應(yīng)答的抗原遞呈細(xì)胞的上皮區(qū)域。不同組織含有不同的黏膜相關(guān)淋巴組織，如消化道的扁桃體、胃腸道黏膜相關(guān)淋巴組織，呼吸道的鼻黏膜相關(guān)淋巴組織、支氣管黏膜相關(guān)淋巴組織，泌尿生殖道黏膜相關(guān)淋巴組織以及眼結(jié)膜相關(guān)淋巴組織等。此外，誘導(dǎo)位點還包括微皺褶細(xì)胞（microfold cell，M 細(xì)胞）、上皮細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞（DC）等。

效應(yīng)位點是B細(xì)胞和T細(xì)胞進行免疫反應(yīng)的位點，包括消化道、呼吸道、生殖道等黏膜的固有層及部分腺體（如乳腺、唾液腺、淚腺等）和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞。這些組織含有抗原特異性黏膜效應(yīng)細(xì)胞，例如產(chǎn)生IgA的漿細(xì)胞以及B和T細(xì)胞等。此外，樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腔內(nèi)淋巴細(xì)胞等以及多種細(xì)胞因子參與黏膜免疫的效應(yīng)反應(yīng)。

誘導(dǎo)位點和效應(yīng)位點是黏膜免疫系統(tǒng)所特有的，二者并不獨立作用，而是在黏膜淋巴細(xì)胞歸巢受體的作用下，相互聯(lián)系。黏膜免疫中的淋巴細(xì)胞歸巢是指淋巴細(xì)胞在誘導(dǎo)位點處的黏膜濾泡中受抗原誘導(dǎo)分化增殖后通過淋巴液進入血液循環(huán)，在血液循環(huán)系統(tǒng)中選擇性地穿越毛細(xì)血管高內(nèi)皮靜脈（HEV），向?qū)?yīng)的效應(yīng)位點處的器官或者組織定向遷移。大部分（80%）致敏的淋巴細(xì)胞歸巢至效應(yīng)部位的腸固有層或上皮內(nèi)，逐步分化成熟為記憶性或者效應(yīng)性淋巴細(xì)胞，發(fā)揮效應(yīng)功能；一部分（20%）致敏的淋巴細(xì)胞歸巢至其他黏膜組織（如呼吸道黏膜、消化道黏膜、生殖道黏膜、乳腺、唾液腺等），發(fā)生效應(yīng)反應(yīng)。通過淋巴細(xì)胞的歸巢可使黏膜局部的免疫效應(yīng)細(xì)胞游走到全身各處，從而使局部的免疫接種可以引發(fā)其他黏膜免疫效應(yīng)部位的免疫應(yīng)答，使不同的黏膜部位的免疫反應(yīng)相互聯(lián)系起來，形成一個廣泛的免疫網(wǎng)絡(luò)——共同黏膜免疫系統(tǒng)。一個部位黏膜免疫反應(yīng)可擴散到其他黏膜位點。即一個特定的黏膜區(qū)域抗原激活產(chǎn)生T細(xì)胞和B細(xì)胞可遷移到遠(yuǎn)離此黏膜的其他黏膜位點，產(chǎn)生效應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞。研究表明：口服免疫可以誘導(dǎo)呼吸道、生殖道黏膜和其他黏膜部位（如乳腺）產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，口服免疫后胃腸道、唾液腺和乳腺的SIgA水平顯著升高；鼻腔免疫不僅能夠提高鼻腔局部的免疫力，還能誘導(dǎo)其他黏膜處產(chǎn)生有效的抗原特異性免疫應(yīng)答，如唾液腺、消化道和生殖道等。

通過黏膜淋巴細(xì)胞歸巢性，黏膜免疫不僅將不同黏膜部位的免疫反應(yīng)形成一個免疫網(wǎng)絡(luò)，還能誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫反應(yīng)。淋巴細(xì)胞的歸巢過程是通過淋巴細(xì)胞與各組織、器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的相互作用實現(xiàn)的。由于各處黏膜組織中淋巴細(xì)胞的歸巢受體和毛細(xì)血管高內(nèi)皮靜脈的配體有些差異，所有不同黏膜組織中的淋巴細(xì)胞的歸巢位點也會存在差異。在腸道中，小腸派爾氏結(jié)（PP結(jié)）中90%淋巴細(xì)胞表達整和素α4β7，剩下的淋巴細(xì)胞表達L-選擇素。由于PP結(jié)大多數(shù)HEV只表達MAdCAM-1——整和素α4β7的配體，表達L-選擇素的淋巴細(xì)胞最終歸巢至外周淋巴結(jié)，誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫反應(yīng)。在呼吸道支氣管相關(guān)淋巴組織中也存在此現(xiàn)象。支氣管黏膜相關(guān)淋巴組織具有同時表達黏膜地址素和外周地址素的特點，能夠同時誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)和系統(tǒng)免疫反應(yīng)。值得注意的是，傳統(tǒng)的肌肉注射或者皮下注射疫苗只能刺激機體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫應(yīng)答（體液免疫應(yīng)答），而不能誘導(dǎo)有效的黏膜免疫反應(yīng)。

2 黏膜免疫的優(yōu)勢

目前，動物中疫苗免疫預(yù)防接種主要還是通過傳統(tǒng)的免疫方式——肌肉或皮下注射進行。該免疫方式在實際的疫苗接種的過程中，需要專業(yè)的技術(shù)人員進行操作，耗時耗力；而注射所帶來的疼痛感以及注射過程中的緊張感會使動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，影響動物的生長。同時，注射疫苗需要針頭和注射器。為了節(jié)約養(yǎng)殖成本，在臨床操作中，往往多頭動物共用一個針頭，可能導(dǎo)致不同動物個體間病原微生物的傳播。此外，注射接種后殘留的疫苗（尤其是由油佐劑制備的疫苗）會影響動物肉制品的質(zhì)量，間接影響食品安全和公共衛(wèi)生。

黏膜免疫是應(yīng)用疫苗通過飲水或飼喂（消化道）、滴鼻或噴霧（呼吸道）、點眼等方式誘導(dǎo)消化道、呼吸道、淚腺黏膜免疫動物，誘導(dǎo)局部產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)和適當(dāng)?shù)娜砻庖叻磻?yīng)。它直接模擬病原微生物自然感染途徑，直接刺激黏膜下豐富的淋巴組織產(chǎn)生大量的免疫活性細(xì)胞和抗體，直接切斷病原微生物入侵機體的途徑。在實際的疫苗接種的過程中，其無需專業(yè)的技術(shù)人員操作，飲水、飼喂、噴霧等方式可節(jié)省大量的人力。作為一種不依賴于“針頭和注射器”的免疫接種方式，黏膜免疫在免疫過程中的不產(chǎn)生劇烈的疼痛感，可減輕動物應(yīng)激反應(yīng)，不妨礙動物的生長。同時，避免了因注射器污染而帶來的病原微生物的傳染風(fēng)險以及疫苗體內(nèi)殘留對肉質(zhì)的影響。此外，黏膜免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體主要是SIgA，這是與系統(tǒng)免疫（體液免疫）應(yīng)答主要產(chǎn)生特異性IgG所不同的。SIgA一般由2個IgA單體、一個J鏈和兩個分泌片段(SC)構(gòu)成，所以比單鏈IgA有更強的抗原結(jié)合力。同時，其在機體內(nèi)分泌量最多，合成速率很快，一般為IgG合成速度的2倍，產(chǎn)量遠(yuǎn)超IgG。SIgA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠耐受腸道局部溫度、pH等理化環(huán)境的變化及蛋白酶的消化作用，隨分泌液釋放到黏膜或漿膜表面而發(fā)揮免疫作用。有研究指出，肌注免疫動物血清中PEDV、TGEV、輪狀病毒等特異性IgG并不能保護動物免受上述病毒的感染，疫苗免疫后腸道（糞便）中的特異性SIgA的水平是判斷機體對輪狀病毒保護力的標(biāo)識。因此，對于依賴于特異性SIgA的病原微生物的防控必須采用黏膜免疫。

3 黏膜免疫在動物疫苗中的應(yīng)用、前景及挑戰(zhàn)

黏膜免疫在病原微生物的防控上具有多種優(yōu)勢，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)有多種被批準(zhǔn)使用的人用口服黏膜免疫疫苗。但是黏膜免疫在動物疫苗方面的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于人用疫苗，目前只有少數(shù)的疫苗，如針對鼻腔感染的雞新城疫弱毒疫苗（IV系苗）和偽狂犬弱毒活疫苗等，其中利用雞新城疫弱毒疫苗（IV系苗）滴鼻點眼預(yù)防雞新城疫的發(fā)生和傳播是獸醫(yī)上利用黏膜免疫預(yù)防動物傳染病的典型例子。

雖然黏膜免疫在商品化的動物疫苗中應(yīng)用不多，但是大量的實驗室研究表明，對于與黏膜免疫系統(tǒng)相關(guān)的病原微生物而言，黏膜免疫效果優(yōu)于系統(tǒng)免疫（體液免疫）。以豬流行性腹瀉病毒為例。該病毒是引起豬嘔吐、腹瀉的主要病原。它通過糞口途徑進入豬的體內(nèi)，首先感染小腸集合淋巴區(qū)，與小腸黏膜上皮細(xì)胞進行接觸，并在小腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制。因此，臨床上采用肌肉注射進行疫苗防控時效果并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，懷孕母豬口服接種豬流行性腹瀉病毒DR13弱毒株，仔豬感染PEDV后的死亡率顯著下降。此外，以重組沙門氏菌和重組腺病毒為活載體構(gòu)建的PEDV疫苗可產(chǎn)生針對病毒的局部黏膜免疫應(yīng)答和全身免疫反應(yīng)。因此，隨著研究技術(shù)的成熟和研究理論的完善，黏膜免疫必然會在動物疫苗中得到廣泛的應(yīng)用。

目前，共同黏膜免疫系統(tǒng)給黏膜疫苗的開發(fā)提供了基本概念和實用手段以及廣闊的應(yīng)用前景，但是對于黏膜疫苗的研發(fā)和推廣工作而言，其仍存在著較大的挑戰(zhàn)。一方面，由于黏膜表面環(huán)境復(fù)雜，如微生物抗原的存在及胃腸道中胃酸和各種蛋白酶的存在，黏膜免疫疫苗的免疫效果達不到最理想化一直是制約黏膜免疫廣泛推廣的瓶頸。另外一方面，滅活疫苗缺失在黏膜上增殖的能力，其在黏膜免疫中效果不佳，制約了黏膜免疫接種在滅活疫苗上的使用。為了解決這些難題，從20世紀(jì)90年代起，黏膜免疫疫苗開發(fā)已經(jīng)步入了第三個時期，即運用合適的疫苗遞送載體系統(tǒng)（如生物微球體、活的細(xì)菌病毒載體等）運送抗原物質(zhì)，同時應(yīng)用黏膜免疫佐劑增強其黏膜免疫作用。我們相信，隨著各種新技術(shù)的不斷發(fā)展、研究的深入，會有越來越多的黏膜免疫疫苗被開發(fā)出來，發(fā)揮其在動物疫病免疫防控中的不可代替的作用。