滕官宏偉，蔣 晗，張雷蕾，朱 誠

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310018)

受大規(guī)模、高密度、集約化養(yǎng)殖模式的制約，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中亂用濫用抗生素、殺蟲劑等漁藥，導致養(yǎng)殖水產(chǎn)品中藥物殘留的現(xiàn)象嚴重，由此引發(fā)的水產(chǎn)品安全問題層出不窮.為了提高水產(chǎn)品食用安全信息的完備性，有效保證水產(chǎn)品食用性、可靠性和安全性，亟需解決抗菌藥物等化學污染物殘留快速檢測、控制及安全性評價的關鍵問題.常規(guī)檢測手法如分子印跡技術、免疫分析法、色譜法及質(zhì)譜法等，存在檢測效率低、樣品破壞、檢測滯后等缺點[1-3].因此，如何實現(xiàn)水產(chǎn)品化學污染物殘留的快速無損檢測成為當務之急.

作為食品安全檢測最具潛力的新方法之一，光譜技術具有快速、實時和無損傷三個技術特征，在水產(chǎn)食品品質(zhì)安全檢測領域發(fā)揮出巨大的潛力[4-5].Soroush H等[6]為了檢測水中福美雙、甲基對硫磷和孔雀石綠，設計了無泵式流動SERS微型檢測系統(tǒng)，結(jié)果表明三種藥物最低檢測質(zhì)量分數(shù)為1×10-9、5×10-6、0.1×10-9，對混合的三種殺菌劑也可以較為明顯的區(qū)分.美國密蘇里大學Li等[7]利用樹枝狀銀納米顆粒為基底，研究了溶液中氯霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星三種抗生素SERS檢測限，通過實驗，環(huán)丙沙星的檢測限為20×10-9，并且可以將三種抗生素的混合溶液區(qū)別開.光譜檢測技術在水產(chǎn)品品質(zhì)安全檢測的應用上非常廣泛[8-10].上海海洋大學海洋藥物與健康食品研究團隊，利用表面增強拉曼光譜技術進行水產(chǎn)品中多殘留漁藥的檢測研究中取得了很好的成果[11-13].馬海寬等[16]以銀溶膠為表面增強拉曼活性基底，實現(xiàn)了比目魚肉中磺胺類抗生素的痕量檢測，在試驗中，根據(jù)磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶分別在1 102 cm-1和1 134 cm-1處的特征拉曼信號，檢測質(zhì)量分數(shù)都為1×10-6.

本文通過自行設計拉曼光學檢測系統(tǒng)，選取磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、恩諾沙星和氟苯尼考這四種常用抗菌藥物為檢測對象，檢測得到相應的光譜圖并對其進行特征峰識別，從而實現(xiàn)這四種抗生素在大黃魚的殘留狀況定性判別，并分析此項技術應用于實際的可行性.

1 光學無損檢測裝置構(gòu)成及工作原理

本文研制的便攜式魚肉抗菌藥物殘留拉曼檢測系統(tǒng)，包括光源系統(tǒng)、信號采集系統(tǒng)和載物裝置三大模塊.

1.1 光源系統(tǒng)模塊

光源系統(tǒng)是光學檢測系統(tǒng)的重要部分，本試驗采用基于外腔式體光柵技術500 mW的785 nm激光器(Laser-785, Ocean optics)作為激發(fā)光源，該激光器集成了反饋式穩(wěn)定功率模塊和內(nèi)置半導體制冷，具有窄線寬、強度穩(wěn)定的激光輸出及可抑制待測樣品熒光等特性，從而可以保證檢測系統(tǒng)的精度和魯棒性.

1.2 信號采集系統(tǒng)模塊

該模塊采用了可選擇配置狹縫和光柵類型的微型拉曼光纖光譜儀(USB2000-VIS-NIR，Ocean optics).為了實現(xiàn)低照度條件響應，配置狹縫為50 um，探測器：TE制冷背照薄型面陣CCD陣列，所覆蓋有效拉曼光譜范圍：340～3 000 cm-1.同時為了采集785 nm激發(fā)波長下樣品的斯托克斯光譜，配置有780 nm長通濾波片.儀器光譜分辨率為5 cm-1，信噪比1000∶1.非浸入式拉曼光纖探頭(SPL-RPB-785，Ocean optics)，該探頭擁有深度激光譜線覆蓋，瑞利線光學密度OD=6.所采用Y型光纖(數(shù)值孔徑0.22)一端與光纖探頭連接，另一端與光譜儀的輸入端和激光器的輸出端連接.

1.3 載物裝置模塊

高精度樣品高度調(diào)節(jié)載物臺由探頭夾持器、樣品放置平臺和電動升降臺組成.由于被檢樣品表面和鏡頭之間距離的變化會引起光譜強度的差異，并影響整個檢測系統(tǒng)的檢測精度和準確性，因此通過激光位移傳感器(CD22-100-485, Optex Fa CO Ltd, Japan)，保持檢測距離一致.

整個檢測系統(tǒng)置于一個封閉的暗箱內(nèi)，避免外界光干擾，系統(tǒng)示意圖如圖1.

圖1 水產(chǎn)品品質(zhì)安全光學檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic diagram of the optical detecting system for quality and safety of aquatic products

1.4 工作原理

激光器產(chǎn)生穩(wěn)定的785 nm激光耦合進Y型光纖的光源端，并傳輸?shù)綑z測探頭，照射到待測樣品表面，所產(chǎn)生的散射光再由拉曼探頭獲取，通過濾除瑞利散射后進行光柵分光，然后投射到CCD探測器上，經(jīng)過模數(shù)轉(zhuǎn)換后傳送至計算機，從而獲取到拉曼位移光譜信號.通過光譜數(shù)據(jù)預處理，結(jié)合化學計量學方法提取樣品及不同種類化學污染物的光譜特征參數(shù)，最終對待測樣品殘留的化學污染物進行定性識別分析.

1.5 系統(tǒng)軟件開發(fā)

便攜式魚肉抗菌藥物殘留拉曼檢測系統(tǒng)軟件的設計與開發(fā)是基于windows操作系統(tǒng)MFC(Microsoft Foundation Classes)基礎類庫完成的，主要包括光學信號采集、光譜數(shù)據(jù)保存處理、標準拉曼光譜數(shù)據(jù)庫查詢、以及人機交互界面等功能.如圖2所示.

檢測參數(shù)設置模塊主要是針對光譜儀的積分時間、平均次數(shù)等相關參數(shù)進行設置.數(shù)據(jù)處理模塊是通過MATLAB和C++混合編程實現(xiàn)的，可執(zhí)行光譜數(shù)據(jù)自動導入、實時顯示、保存以及熒光剔除、光譜去噪等預處理等命令.在化學污染物痕量檢測時，采集到的圖譜通常會存在一部分重疊，以致影響各種類殘留物質(zhì)特征峰的準確識別.因此，光譜數(shù)據(jù)預處理的關鍵步驟是識別重疊峰并對其進行基線校準.

圖2 系統(tǒng)軟件功能模塊Figure 2 Function module of the system software

2 裝置試驗測試

2.1 試劑及藥物標準溶液的制備

以甲醇和乙醇作為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度100 mg/L氯霉素-乙醇標準溶液、磺胺二甲基嘧啶-乙醇標準溶液、恩諾沙星-甲醇標準溶液和氟苯尼考-甲醇標準溶液.將標準貯備液稀釋成0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.25 μg/mL和5 μg/mL 四個梯度，共16個藥物樣品溶液.

2.2 魚肉樣品準備和預處理

將購買于農(nóng)貿(mào)市場新鮮的大黃魚為研究對象，采取其魚肉作為實驗樣品，魚去鱗、皮后沿背脊取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肌肉塊后混勻，然后用保鮮膜裹好放在冰箱中冰凍儲存?zhèn)溆?取1 mg制備好的藥品溶液分別和1 g魚肉進行充分混合勻漿處理；將乙腈作為提取及劑添加到混合物中，使?jié)B入魚肉樣本中的藥物被重新提取，再進行離心處理取得上清液；用正己烷去除魚肉中含有一些油脂類物質(zhì)，從而減少這些物質(zhì)對光譜檢測及分析的干擾；離心去除正己烷后將待測液放在冰箱中保存[16].

2.3 檢測條件設置及光學信號獲取

采集四種藥物固體純品、不同質(zhì)量濃度的藥物標準溶液及提取液的拉曼特征光譜.取適量的抗菌藥物標準品原料固體粉末于載玻片上壓平；取適量不同藥物不同質(zhì)量濃度的標準液和提取液于比色皿中；將制備好的樣品置于自主設計的便攜式魚肉抗菌藥物殘留拉曼檢測系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)探頭與樣品表面的距離為2 mm，設置激光器的功率為500 mW，中心波長為785.2 nm，設置光譜儀的平均次數(shù)為2次，積分時間為2 000 ms.利用系統(tǒng)軟件控制并采集待檢樣品的光學圖譜，再進行光譜平滑、熒光背景扣除等預處理，將光譜數(shù)據(jù)導入MATLAB2013a中進行進一步處理與分析.

3 結(jié)果與討論

3.1 抗菌藥物固體標準品的拉曼光譜檢測及分析

分析四種不同種類的抗菌藥物固體標準品的拉曼圖譜，可以發(fā)現(xiàn)各個藥物的特征峰比較明顯，并對其各個特征峰進行指認歸屬，結(jié)果如圖3.

圖3 抗菌藥物固體標準品的圖譜Figure 3 Spectra of pure antibactics

從圖3(a)氯霉素標準品的拉曼光譜圖分析其特征峰的相關峰歸屬，可知422 cm-1的特征峰屬于C-C伸縮振動，745 cm-1的特征峰屬于28C和Cl2的彎曲振動，987 cm-1的特征峰屬于苯環(huán)上的CH3和苯環(huán)上的H伸縮運動.根據(jù)圖3(b)磺胺二甲基嘧啶標準品的拉曼光譜圖，分析其特征峰的相關峰歸屬可知，558 cm-1的特征峰屬于C-S伸縮振動， 818 cm-1的特征峰屬于對位二取代苯環(huán)呼吸振動，981 cm-1的特征峰屬于C-H面內(nèi)彎曲振動，1 074 cm-1的特征峰屬于C-N伸縮振動，1 127 cm-1的特征峰屬于SO2對稱伸縮振動，1 580 cm-1的特征峰屬于對位二取代苯環(huán)伸縮振動[17].從圖3(c)光譜圖中可以看出氟苯尼考標準品在359.277cm-1和203.528 cm-1等處有特征峰，其中 1 140 cm-1附近為 C-SO2-C的強峰.此外，氟苯尼考標準品的拉曼光譜圖與氯霉素標準品的拉曼光譜圖存在很大差異.這是因為氟苯尼考結(jié)構(gòu)上的苯環(huán)對位硝基被甲磺酸基所取代，而氯霉素苯環(huán)上是對位硝基，所以二者相差很大.根據(jù)圖3(d)恩諾沙星標準品的拉曼光譜圖，分析其特征峰的相關峰歸屬可知，421 cm-1的特征峰屬于δ(C-H)Q，619cm-1屬于υ(C-C)Q，1 233 cm-1屬于υ(C-F)，1 380cm-1屬于υa(O-C-O)，1 448 cm-1屬于υs(C=O)p，1 609 cm-1屬于υas(C=O)p[13-14].四種抗菌藥物標準品拉曼特征峰的相關峰歸屬如表1所示.

表1 四種抗菌藥物標準品拉曼特征峰的相關峰歸屬

3.2 不同濃度梯度的抗菌藥物標準溶液的拉曼圖譜分析

對四種不同濃度的氯霉素-乙醇標準溶液、磺胺二甲基嘧啶-乙醇標準溶液、恩諾沙星-甲醇標準溶液和氟苯尼考-甲醇標準溶液溶液的拉曼光譜圖進行比較分析，以恩諾沙星-甲醇標準溶液為例，如圖4，從圖中的特征峰可以發(fā)現(xiàn)不同濃度質(zhì)量梯度的藥物溶液的拉曼圖譜中溶劑的峰較為明顯，且不同的濃度梯度都存在著幾個相同的拉曼峰位置，根據(jù)這幾個特征峰也可以推斷出它含有那類物質(zhì).

圖4 不同濃度的恩諾沙星-甲醇標準溶液的拉曼圖Figure 4 Raman spectra of standard solutions of enrofloxacin in methanol

3.3 魚肉中藥物殘留的探測及危害識別

將具有高檢測靈敏度的光譜檢測技術與主成分分析(PCA)統(tǒng)計分析技術相結(jié)合，對魚肉中不同藥物殘留提取液進行定性分析.利用matlab中[pc,score,variance,t] = princomp(x)函數(shù)對原始光譜進行降維，得到特征向量，在進行主成分PCA分析后，提高特征向量的維數(shù)，能夠使提取的特征向量含有更多有利于分類魚肉樣本中殘留藥物的信息.圖為PCA散點分布圖，PC1、PC2、PC3分別作X、Y、Z軸.如圖5所示，代表不同藥物的數(shù)據(jù)點基本可以聚集到一起，但不能夠完全區(qū)分開來.分析其原因，是在魚肉樣本中提取殘留藥物時，采用乙腈作為提取劑，在一定程度上具有較為強烈的拉曼特征峰，對四種不同種類抗菌藥物自身的光譜峰有所掩蓋.

圖5 魚肉殘留藥物提取液拉曼光譜的主成分分析Figure 5 The Raman spectrum of principal component analysis of fish residual drug extraction

4 結(jié) 語

通過自行構(gòu)建的便攜式魚肉抗菌藥物殘留拉曼檢測系統(tǒng)，獲取魚肉中殘留藥物的光學信號，甄別出磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、恩諾沙星和氟苯尼考等四種抗生素對應的特征峰，并對各個拉曼特征峰進行指認歸屬分析，實驗得到的拉曼圖譜以及對其特征峰的歸屬信息可以作為不同種類抗菌藥物的定性鑒別依據(jù).但也存在一些問題亟待進一步改進：1)嘗試結(jié)合表面增強拉曼光譜技術，使魚肉復雜樣品中抗菌藥物的最低檢測濃度得以突破；2)進一步改進熒光背景消除方法，有效消除不同樣品的組間數(shù)據(jù)波動；3)提高檢測精度和準確度，消除探頭到樣本的距離對光譜數(shù)據(jù)采集的影響.

通過對不同抗菌藥物在魚肉殘留中的拉曼光學檢測的初探，為進一步研發(fā)功能完備、檢測精度高、檢測速度快、可移植性好的小型便攜的水產(chǎn)品污染物檢測儀器，實現(xiàn)漁業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈的藥物有害物質(zhì)殘留控制和品質(zhì)安全檢測提供了研究基礎.

[1] 張毅, 岳振峰, 郭文,等. 動物源性食品中藥物多殘留分析的研究進展[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 213-221.

ZHANG Y, YUE Z F, GUO W, et al. Progress in multiresidue analysis of veterinary drugs in foods of animal origin [J].FoodScience, 2016, 37(1): 213-221.

[2] HE L, CHEN T, LABUZA T P. Recovery and quantitative detection of thiabendazole on apples using a surface swab capture method followed by surface-enhancement Raman spectroscopy [J].FoodChemistry, 2014, 148(3): 42-46.

[3] LI Q Q, DU Y P, XU Y, et al. Rapid and sensitive detection of pesticides by surface-enhanced Raman spectroscopy technique based on glycidyl methacrylate-ethylene dimethacrylate (GMA-EDMA) porous material [J].ChineseChemicalLetters, 2013, 24(4): 332-334.

[4] ZHANG X F, ZOU M Q, QI X H, et al. Detection of melamine in liquid milk using surface-enhanced Raman scattering spectroscopy [J].JournalofRamanSpectroscopy, 2010, 41(12): 1655-1660.

[5] XU Y, DU Y, LI Q, et al. Ultrasensitive detection of enrofloxacin in chicken muscles by surface-Enhanced raman spectroscopy using amino-modified glycidyl methacrylate-ethylene dimethacrylate (GMA-EDMA) powdered porous material [J].FoodAnalyticalMethods, 2014, 7(6): 1219-1228.

[6] YAZDI S H, WHITE L M. Mutiplexed detection of aquaculture fungicides using a pump-free optofluidic SERS microsystem [J].Analyst, 2013, 138(1): 100-103.

[7] HE L L, LIN M, LI H, et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy coupled with dendritic silver nanosubstrate for detection of restricted antibiotics [J].JournalofRamanSpectroscopy, 2010, 41(7)： 739-744.

[8] LAI KQ, ZHAI F L, ZHANG Y Y, et al. Application of surface enhanced Raman spectroscopy for analyses of restricted sulfa drugs [J].SensingandInstrumentationforFoodQualityandSafety, 2011, 5: 91-96.

[9] LIU B, LIN M, LI H. Potential of SERS for rapid detection of melamine and cyanuric acid extracted from milk [J].SensingandInstrumentationforFoodQualityandSafety, 2010, 4(1)：13-19.

[10] CHENG Y, DONG Y. Screening melamine contaminant in eggs with portable surface-enhanced Raman Spectroscopy based on gold nanosubstrate [J].FoodControl, 2011, 22(5)：685-689.

[11] 李春穎, 賴克強, 張源圓, 等. 表面增強拉曼光譜檢測魚肉中禁用和限用藥物研究[J]. 化學學報, 2013, 71(2): 221-226.

LI C Y, LAI K Q, ZHANG Y Y, et al. Use of Surface-enhanced Raman spectroscopy for the test of residuals of prohibited and restricted drugs in fish muscle [J].ActaChimicaSinica, 2013, 7(2): 221-226.

[12] ZHANG Y Y, HUANG Y Q, ZHAI F L, et al. Analyses of enrofloxacin, furazolidone and malachite green in fish products with surface-enhanced Raman spectroscopy [J].FoodChemistry, 2012, 135(2): 845-850.

[13] ZHANG Y Y, LAI K Q, ZHOU J L, et al. A novel approach to determine leucomalachite green and malachite green in fish fillets with surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) and multivariate analyses [J].JournalofRamanSpectroscopy, 2012, 43(9): 1208-1213.

[14] ZHANG Y Y, YU W S, PEI L, et al. Rapid analysis of malachite green and leucomalachite green in fish muscles with surface-enhanced resonance Raman scattering [J].FoodChemistry, 2015, 169：80-84.

[15] LAI K Q, ZHANG Y Y, DU R, et al. Determination of chloramphenicol and crystal violet with surface enhanced Raman spectroscopy [J].SensingandInstrumentationforFoodQualityandSafety, 2011, 5(1): 19-24.

[16] 馬海寬, 韓曉紅, 張財華，等. 魚肉中磺胺類抗生素的表面增強拉曼光譜探測與分析[J]. 激光生物學報, 2014, 23(6): 560-565.

MA H K, HAN X H, ZHANG C H, et al. The study of sulfonamide antibiotics in fish based on surface-enhanced Raman spectroscopy technology [J].ActaLaserBiologySinica, 2014, 23(6): 560-565.

[17] 樊玉霞, 賴克強, 黃軼群. 表面增強拉曼光譜技術在食品中痕量化學危害檢測中的應用[J]. 光譜學與光譜分析, 2014, 34(7):1859-1864.

FAN Y X, LAI K Q, HUANG Y Q. Application of surface-enhanced Raman spectroscopy to the determination of trace chemical hazards in food products [J].SpectroscopyandSpectralAnalysis, 2014, 34(7): 1859-1864.