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1 前 言

寄生原蟲是危害人類和動(dòng)物健康的主要病原之一，其危害性以食源性寄生原蟲病為主[1]，由于人們生食或半生食習(xí)慣，使得寄生原蟲病的發(fā)病率大幅度升高。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，某些寄生原蟲損壞動(dòng)物的消化系統(tǒng)，使飼料動(dòng)物體內(nèi)的利用率降低，從而使養(yǎng)殖成本提高，對(duì)畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在公共衛(wèi)生學(xué)方面，很多寄生原蟲對(duì)人類有致病性，并且很多是機(jī)會(huì)致病性寄生原蟲，當(dāng)機(jī)體免疫正常時(shí)，這類寄生原蟲感染機(jī)體后通常處于隱性感染狀態(tài)，致病力弱而被忽視。一旦機(jī)體免疫受損，蟲體出現(xiàn)大量繁殖和強(qiáng)致病力，嚴(yán)重危害著人類的健康[2]。

而在寄生原蟲的研究中，組學(xué)的相關(guān)研究方法已廣泛被應(yīng)用。特別是后基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法尤為明顯。但隨著對(duì)寄生蟲組學(xué)研究的深入，遇到的問題也愈顯復(fù)雜，很多問題難以用以上三種組學(xué)研究方法解決，這三種研究方法處在生物系統(tǒng)生化活動(dòng)調(diào)控的起始階段，反映的是正在發(fā)生而非終止的生物學(xué)事件，因此這些分析方法所提供的信息不足以揭示生物體系生理和生化功能狀態(tài)，而且在這些技術(shù)的應(yīng)用過程中需要建立大量的超大序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫，再加上基因和蛋白質(zhì)的種類多，這給寄生蟲的研究帶來了相當(dāng)大的麻煩。因此一種新的寄生蟲研究技術(shù)——代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

本文通過對(duì)代謝組學(xué)技術(shù)，代謝組學(xué)研究方法以及代謝組學(xué)在重要寄生原蟲(主要是弓形蟲、利什曼原蟲、瘧原蟲、錐蟲)領(lǐng)域的應(yīng)用展開綜述，把握當(dāng)前代謝組學(xué)在寄生原蟲研究中的最新動(dòng)態(tài)，為今后寄生原蟲代謝組學(xué)研究提供參考。

2 代謝組學(xué)簡介

代謝組指在一個(gè)細(xì)胞中代謝物的總和[3]，由Nicholson等[4]最早提出，代謝組學(xué)是指研究在生物系統(tǒng)代謝的代謝途徑及其受到刺激產(chǎn)生的所有代謝物變化的科學(xué)，這些代謝物包括不同級(jí)別分子質(zhì)量小于1000的內(nèi)源性小分子化合物[5],它的起源以代謝控制分析、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)光譜學(xué)的發(fā)展為兩個(gè)獨(dú)立的出發(fā)點(diǎn)[6]。

代謝組學(xué)主要借助NMR、色譜(Chromatography)、質(zhì)譜(Mass Spectrometry，MS)，氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF/MS)等技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)研究，各種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，往往單獨(dú)應(yīng)用于不同的研究中。但代謝組具有相當(dāng)復(fù)雜的分子種類及濃度范圍，單一技術(shù)往往難以達(dá)到研究目的，因此代謝組學(xué)研究中往往不局限于選擇單一的技術(shù)，而是通過不同的分析技術(shù)的組合達(dá)到全面把握代謝組內(nèi)容的目的[7]。

代謝組研究的目標(biāo)是能夠提供生物樣品中存在的所有代謝物的復(fù)合譜。在代謝水平的細(xì)胞分析與轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，Janet等[8]總結(jié)了以下四個(gè)方面：1)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的變異可以引起代謝中的變化放大，使檢測(cè)更容易。2)代謝組學(xué)技術(shù)不需要完整的基因組序列或大的EST數(shù)據(jù)庫。3)與基因或蛋白質(zhì)相比，代謝物類型更少：每個(gè)生物體1 000個(gè)數(shù)量級(jí)。4)該技術(shù)更通用，因?yàn)榻o定的代謝物在每個(gè)生物體中是相同。

代謝組學(xué)在生物學(xué)研究中已經(jīng)進(jìn)入到一個(gè)新穎的多學(xué)科領(lǐng)域，它為許多研究人員提供了一個(gè)將生物化學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)與深入研究生物學(xué)與疾病有力結(jié)合的平臺(tái)[9]。代謝組學(xué)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物開發(fā)、微生物代謝以及動(dòng)植物代謝等研究中[10]。

3 代謝組學(xué)研究方法

代謝組學(xué)的終極目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)全面、定量分析生物系統(tǒng)中的所有代謝產(chǎn)物，使其與生理特征更為相似。但樣品中代謝物具有非常不同的生化特性，并且以不同的豐度水平存在[11]，因此，代謝組學(xué)技術(shù)在不同的研究對(duì)象中研究目的和方法會(huì)有所不同[12]，但其研究方法流程大體可包括三個(gè)過程：代謝物的提取、樣品分析以及數(shù)據(jù)分析[13]。

3.1代謝物的提取 代謝物的提取包括代謝物的制備以及預(yù)處理。從一個(gè)生物樣品中提取最完整的代謝產(chǎn)物也許需要不同的制備方法[14]。對(duì)于微生物而言，至少需要順序和同步兩種的萃取過程。前者需要單獨(dú)與連續(xù)淬火和代謝物提取步驟，而在后者淬火和提取都是在單個(gè)步驟中執(zhí)行。代謝物提取效率高低取決于所使用的微生物和提取程序，微生物的性質(zhì)似乎決定了提取的最佳方法[15]，所使用的萃取試劑會(huì)決定提取效率和提取到的代謝物的品質(zhì)，例如，Mehta等[16]研究者使用皂苷使紅細(xì)胞釋放寄生蟲，從而能特異性地分析寄生蟲代謝物。

由于小分子可通過快速改變應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化，這就很難保障樣品的完整性，而適當(dāng)?shù)臉悠奉A(yù)處理方法也許可以解決這一問題。比如，快速淬火以捕捉代謝活動(dòng)，通常涉及溫度迅速降低或增加，捕捉酶活性代謝物之后隨之而來的是提取物與提取溶劑的混合。最理想的淬火方法是使用冷甲醇或水組合，但其他幾個(gè)試劑組合也會(huì)被使用[16]，例如Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)采用的甲醇比-80 ℃的生理鹽水猝滅大腸桿菌更能引起細(xì)胞膜破壞，由此證明-80 ℃的生理鹽水猝滅大腸桿菌更加保留了代謝物的完成性。

3.2代謝物樣品分析 代謝物的分析，主要借助于各種先進(jìn)的分析技術(shù)，比如NMR，色譜，MS及其三者之間的聯(lián)用等。

色譜分離技術(shù)是一個(gè)代謝物分離的關(guān)鍵技術(shù)，可在極其復(fù)雜的整體分析中，將混合物小分子分離開來。目前用于分離的色譜分離技術(shù)主要包括氣相色譜法，液體色譜法和毛細(xì)管電泳[18]。憑借其高效分離率、設(shè)備簡單、選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)廣泛用于代謝組學(xué)研究的各領(lǐng)域中，袁凱龍等[19]利用氣相色譜技術(shù)分析服用洛沙坦后的糖尿病人尿樣，發(fā)現(xiàn)葡萄糖醇和肌醇等代謝物發(fā)生變化，并且證實(shí)了藥物療效的發(fā)展過程能夠用機(jī)體不同時(shí)間點(diǎn)的代謝物變化軌跡進(jìn)行描繪。S cubbon等[20]使用LC-MS分析人類尿液樣品，證實(shí)了反相分離與親水相互作用色譜是增加LC-MS代謝組學(xué)研究指紋覆蓋率的合適方法。

MS技術(shù)是一種鑒定技術(shù)，在有機(jī)分子的鑒定方面發(fā)揮著重要作用，能夠快速準(zhǔn)確地測(cè)定生物分子的分子量。質(zhì)譜通常與色譜聯(lián)用[21]具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離鑒定同時(shí)進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)[22]，是代謝組學(xué)領(lǐng)域重要分析技術(shù)之一。Yang 等[23]將高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)應(yīng)用于慢性乙型肝炎的肝功能急性惡化的調(diào)查以找到潛在的生物標(biāo)志物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果鑒定了幾種慢性乙型肝炎急性惡化時(shí)潛在的生物標(biāo)志物：溶血磷脂酰膽堿(LPC)和甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)或其異構(gòu)體甘油脫氧膽酸(GDCA)。

NMR是研究高分子鏈結(jié)構(gòu)的重要手段，是鑒定有機(jī)物結(jié)構(gòu)和研究化學(xué)動(dòng)力學(xué)的重要方法，既可用于定性分析，又可用于定量分析[24]。NMR樣品預(yù)處理過程相對(duì)簡單;且對(duì)樣品的損傷小,可在更接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)，利用NMR譜中信號(hào)強(qiáng)度與樣品濃度的關(guān)系, 可對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析[25]，這就使得NMR在代謝組學(xué)研究領(lǐng)域中不可或缺。Carrola等[26]利用NMR技術(shù)調(diào)查肺癌患者的尿液代謝標(biāo)志，證實(shí)了馬尿酸鹽、β-羥基異戊酸鹽、肌酐等是促進(jìn)這種肺癌鑒定的主要代謝物。

這三種分析技術(shù)在代謝組學(xué)的應(yīng)用中必不可少，根據(jù)各自的優(yōu)點(diǎn)，都實(shí)現(xiàn)了其在代謝組學(xué)研究中的重要價(jià)值。三種技術(shù)之間聯(lián)合應(yīng)用，不僅實(shí)現(xiàn)三種技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)的互補(bǔ)更是讓各自的優(yōu)點(diǎn)得到最大化的發(fā)揮，使代謝組學(xué)能解決研究中更多的疑難問題。

3.3數(shù)據(jù)分析 代謝組學(xué)分析技術(shù)分析樣本，最終都會(huì)得到?jīng)Q定樣品的特征定量數(shù)據(jù)集。然而這些數(shù)據(jù)龐大，一般的統(tǒng)計(jì)分析方法很難發(fā)現(xiàn)樣品間的差異及其造成這些差異的原因[27]。因此，就出現(xiàn)了針對(duì)代謝組學(xué)研究的分析方法，主要包括兩大類，無監(jiān)督模式和有監(jiān)督模式識(shí)別方法，前者主要包括聚類分析法、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)分析法、主成分分析法等，后者主要包括偏最小二乘法判別分析(PLS-DA),正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等[28]。根據(jù)研究目的和研究方法的不同，合理選擇對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)分析方法。朱曉陽等[29]綜合應(yīng)用LS-DA、OPLS-DA、主成分分析等分析方法分析數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌在共感染小鼠中發(fā)揮了作用，并且降低了日本血吸蟲病對(duì)小鼠的影響。而Sengupta等[30]利用主成分分析(MPCA)方法，對(duì)雌雄小鼠的肝、腦、血清代謝分布進(jìn)行多途徑分析，分析表明了在疾病早期有明顯的性別二態(tài)性，而在腦血清相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)了兩性的能量代謝發(fā)生改變，進(jìn)一步證實(shí)疾病進(jìn)展期間的差異細(xì)胞器反應(yīng)對(duì)瘧疾操縱有影響。

4 代謝組學(xué)在重要寄生原蟲研究領(lǐng)域的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)在寄生原蟲研究中的應(yīng)用相對(duì)較少，主要應(yīng)用在公共衛(wèi)生影響較大的寄生原蟲，相關(guān)研究已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，本文通過大量的文獻(xiàn)檢索，總結(jié)了寄生蟲代謝組學(xué)在重要寄生原蟲研究中的應(yīng)用，主要包括弓形蟲、錐蟲、利什曼原蟲和瘧原蟲。

4.1弓形蟲 弓形蟲是一種最常見的寄生蟲，危害性極大，幾乎能感染所有的脊椎動(dòng)物物種，包括人類[31]。弓形蟲是寄生蟲研究領(lǐng)域最熱門的寄生蟲之一。各種生物學(xué)研究方法幾乎都有所涉及，逐漸興起的代謝組學(xué)技術(shù)也應(yīng)用在弓形蟲的研究中。Srinivasan等[32]使用聯(lián)合遺傳、生化和代謝組學(xué)方法描繪了脂肪酸生物合成的兩種途徑在弓形蟲的分子活性，并證實(shí)了質(zhì)膜是脂肪酸的重要來源，其產(chǎn)物在寄生蟲內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)一步修飾。Zhou[33]等研究者對(duì)弓形蟲感染后的小鼠腦進(jìn)行全代謝組學(xué)分析，對(duì)剛地弓形蟲感染的小鼠代謝組學(xué)分析變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其腦碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝和脂肪酸氧化代謝組學(xué)途徑發(fā)生改變。利用LC-MS分析技術(shù)，主成分分析等分析方法鑒定了與感染引起的疾病的身體恢復(fù)相關(guān)的八種代謝物，并且檢測(cè)到的干擾代謝物和干擾途徑可為發(fā)現(xiàn)新的治療和診斷應(yīng)用的新靶標(biāo)提供有價(jià)值的信息。Zhou等[34]在另一研究中使用液相色譜-質(zhì)譜法在弓形蟲病發(fā)病期間小鼠血清的代謝組學(xué)分析，確定了與氨基酸代謝和能量代謝相關(guān)的19種失調(diào)的代謝物，為未來研究提供了推定的代謝物生物標(biāo)志物。

4.2錐蟲 錐蟲分為兩大類涎源性錐蟲和糞源性錐蟲，前者包括岡比亞錐蟲與羅得西亞錐蟲是非洲錐蟲病的病原體[35]，全球約有一千萬人感染克氏錐蟲(Trypanosomecruzi)，約四千萬人存在被感染的風(fēng)險(xiǎn)[36-37]。研究錐蟲病，以病原的研究為主要思路，而錐蟲代謝組學(xué)研究是一個(gè)新的出發(fā)點(diǎn)，相關(guān)研究已被大量報(bào)道。Vincent等[38]使用代謝組學(xué)技術(shù)在不同疾病階段探測(cè)來自感染了布氏錐蟲患者的腦脊髓液(CSF)，血漿和尿液樣品，發(fā)現(xiàn)新蝶呤和5-羥色氨酸在階段1和階段2晚期之間顯示出100%的特異性和靈敏度；5-羥色氨酸是5-羥色胺合成途徑中的重要代謝物，決定嗜睡的關(guān)鍵途徑；并且從血漿分析發(fā)現(xiàn)存在疾病階段的幾種生物標(biāo)志物。Li等[39]使用基于1H NMR光譜的代謝分析研究了NMRI小鼠對(duì)布氏錐蟲的代謝反應(yīng),發(fā)現(xiàn)感染布氏錐蟲后2-氧代異己酸鹽、D-3-羥基丁酸鹽、乳酸鹽、4-羥基苯基乙酸鹽、苯基丙酮酸鹽和4-羥基苯基丙酮酸鹽的濃度增加，并且馬尿酸鹽水平降低，證實(shí)了丙酮酸鹽，苯丙酮酸鹽和馬尿酸鹽與寄生蟲血癥相關(guān)。Almutairi等[40]利用代謝組學(xué)分析蜂膠抗布氏錐蟲的效應(yīng)，揭示了新的蜂膠抗布氏錐蟲的活性成分，并證實(shí)在蜂膠中存在一些潛在的治療化合物，可用作新的藥物開發(fā)。

4.3利什曼原蟲 利什曼病是一種熱帶地區(qū)的致衰弱疾病[41]，約20種利什曼原蟲屬引起人類感染[42]。對(duì)于利什曼原蟲的研究中，代謝組學(xué)研究是重要的研究方法之一。Canuto等[43]研究人員應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)探究利什曼原蟲對(duì)米替福星作用和耐藥機(jī)制，利用GC、LC、和CE耦合到MS獲得了寄生蟲代謝變化的圖片，并發(fā)現(xiàn)氨基酸水平的增加是抗性寄生蟲最突出的特征，證實(shí)了銻和MT部分交叉抗性的可行性，因此可找到新的多胺途徑抑制劑與米替福新藥物組合，甚至用作抗性的逆轉(zhuǎn)劑，開啟新的替代方案，以減少對(duì)利什曼原蟲的用藥。Vincent等[44]運(yùn)用非目標(biāo)代謝組學(xué)描述涉及米替福新作用的代謝變化，檢測(cè)到超過800種代謝物，并發(fā)現(xiàn)抗銻細(xì)胞具有與野生型細(xì)胞相似的內(nèi)部代謝物水平。詳細(xì)了解米替福新作用模式對(duì)于指導(dǎo)聯(lián)合治療來防治利什曼病至關(guān)重要。Santos等[45]用兩種不同的兩性霉素B(AmB)制劑，負(fù)載AmB和常規(guī)制劑(C-AmB)的納米乳劑(NE)處理觀察小鼠的代謝變化，鑒定出約30種代謝物與早期C-AmB誘導(dǎo)的腎毒性有潛在的相關(guān)性。在C-AmB處理的小鼠中觀察到花生四烯酸，甘油磷脂，酰基肉堿和多不飽和脂肪酸(PUFA)途徑的干擾。在裝載了AmB的NE組中，觀察到代謝變化較少，包括皮質(zhì)醇和吡喃糖等離子體水平的變化。該研究發(fā)現(xiàn)的候選生物標(biāo)志物可用于檢測(cè)AmB制劑誘導(dǎo)的腎損傷的發(fā)病和嚴(yán)重程度。

4.4瘧原蟲 感染惡性瘧原蟲對(duì)人類的代謝狀態(tài)具有嚴(yán)重和潛在的致命后果。每年約有300萬人死于瘧疾[46]，世界各大科研機(jī)構(gòu)都會(huì)投入大量的基金研究瘧原蟲，代謝組學(xué)技術(shù)研究是重要的研究方法之一。Sengupta等[47]使用基于1H NMR的代謝組學(xué)技術(shù)在非致死性的伯氏瘧原蟲感染小鼠后，在其體內(nèi)建立自清除瘧疾模型，結(jié)果顯示在寄生蟲血癥峰值以及寄生蟲感染后清除三周，未感染和感染的小鼠之間存在不同代謝狀態(tài)；而且在峰值感染和恢復(fù)的反應(yīng)表現(xiàn)出不同的性別差異；觀察到乙酰膽堿在兩種性別的大腦代謝分布中的積累，這可能對(duì)了解瘧疾后神經(jīng)綜合征的病理生理學(xué)有著重要的暗示作用。Olszewski等[48]描述了基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)分析的寄生蟲在紅細(xì)胞48h內(nèi)發(fā)育周期變化情況，結(jié)果顯示許多代謝物與發(fā)育周期有著對(duì)應(yīng)變化，表明了寄生蟲對(duì)系統(tǒng)精氨酸消耗可能是人類瘧疾低精氨酸血癥與腦瘧疾發(fā)病相關(guān)的一個(gè)重要因素。Li等[49]使用高分辨率1H NMR光譜和多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)表征小鼠感染伯氏瘧原蟲后的代謝變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖酵解上調(diào)和伯氏瘧原蟲感染的能量需求增加有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)了伯氏瘧原蟲感染小鼠后尿中出現(xiàn)了卵清酸，這表明代謝譜可提供瘧原蟲感染的診斷工具。

5 結(jié) 語

代謝組學(xué)目前主要應(yīng)用于藥物研發(fā)、疾病監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，經(jīng)多年的研究探索，研究方法逐漸趨于成熟。但代謝組學(xué)研究中依然有很多技術(shù)有待優(yōu)化，例如將大型儀器的小型化，使其更方便快捷，解決方法學(xué)需要進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)化和程序化，代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫也需要進(jìn)一步完善等。

在重要寄生原蟲代謝組學(xué)的研究方面，對(duì)寄生原蟲與藥物作用的代謝組學(xué)分析、寄生原蟲感染宿主的代謝反應(yīng)、生物診斷標(biāo)志物的鑒定以及宿主與寄生原蟲之間相互作用，已經(jīng)有比較深入的研究。但從整體來看寄生原蟲代謝組學(xué)的相關(guān)研究較少，而且涉及范圍較窄，研究的寄生原蟲較多的是本文綜述的四種與公共衛(wèi)生緊密相關(guān)的寄生原蟲。

相信隨著代謝組學(xué)技術(shù)的逐漸成熟以及新的分析方法的逐步建立，寄生蟲代謝組學(xué)的研究會(huì)更加深入，研究范圍也會(huì)進(jìn)一步加大，研究的寄生蟲也不再局限于只對(duì)公共衛(wèi)生息息相關(guān)的寄生蟲，而對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)影響較大的寄生蟲，比如：球蟲、蠕蟲等及其感染宿主的代謝組學(xué)研究必將得到加強(qiáng)。

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