雷國風(fēng)， 李至敏， 王小琴， 李志敏

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045； 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江西南昌 330045)

柑橘是蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Aurantioideae)柑橘族(Citreae)柑橘亞族(Citrinae)真正的柑橘果樹類植物的總稱。我國是世界上最早栽培柑橘，也是最重要的栽培國家之一，有甜橙、柚、柑、橘、葡萄柚、檸檬等重要栽培類型。柑橘果實外形美觀，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是世界上最重要的水果之一，在國際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中占有非常重要的地位[1]。柑橘類果實采后極易感染腐敗菌，導(dǎo)致果實腐爛變質(zhì)，造成嚴重的經(jīng)濟損失而阻礙柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。柑橘果實在貯藏期間由于腐爛造成的經(jīng)濟損失非常嚴重，以青霉菌屬(Penicillium)真菌引起的病害最為嚴重，該病害在貯藏期造成的損失一般為10%左右，有的甚至超過30%，引起柑橘采后腐爛的青霉菌主要為意大利青霉(P.italicumWehmer)和指狀青霉(P.digitatumSace.)[2]。指狀青霉可以導(dǎo)致柑橘采后綠霉病，綠霉病是一種主要的柑橘采后疾病，可造成嚴重的經(jīng)濟損失，一般采用抑霉唑、噻苯唑、鄰苯基苯酚鈉等化學(xué)殺菌劑來控制[3-4]。化學(xué)殺菌劑的使用不僅會造成抗藥性，還會導(dǎo)致一定的化學(xué)殘留和環(huán)境污染，從而對人體有潛在的風(fēng)險，因此各國研究人員努力研究相應(yīng)的替代方法來控制柑橘綠霉病，并取得了一定的成果。柑橘采后綠霉病的替代防治研究主要包括植物源提取物、微生物保鮮劑、天然化合物、食品添加劑、公認安全(generally recognized as safe，簡稱GRAS)化合物等5個方面及其聯(lián)合使用的策略。本文對上述方法進行歸納分析，并對柑橘綠霉病防治的研究發(fā)展趨勢進行展望。

1 植物源提取物

植物是自然界最豐富的生物資源之一，超過1 340種植物被認為是抗菌化合物的潛在來源，大約10 000種植物的次級代謝物被定義為抗菌劑[5-6]，且植物源提取物被認為對動物是安全的。利用植物源提取物來進行柑橘采后疾病的防治具有較大的潛力。目前，用于柑橘采后防治的植物源提取物主要包括精油和植物粗提物。

精油也被稱為揮發(fā)油，是存在于植物體中的一類可隨水蒸氣蒸餾、在常溫下能揮發(fā)，且具有一定香味的揮發(fā)性油狀液體的總稱。許多植物精油殺菌譜廣，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、病原真菌等均有一定的殺菌活性[7]。關(guān)于植物精油的抑菌機制說法多種多樣，且目前沒有定論，普遍認為植物精油的抑菌活性與其結(jié)構(gòu)中的特殊官能團、衍生或嵌入的各種基團有著密切關(guān)系，主要是通過破壞細胞膜或影響能量代謝途徑達到抑菌作用[2]。植物精油和植物粗提物含有許多生物活性物質(zhì)，比如茉莉酸。茉莉酸可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性從而抵御病原菌[8]。解淑慧等運用丁香(EugeniacargophyllataThunb.)精油對柑橘綠霉病病原菌指狀青霉進行體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)丁香精油對指狀青霉有較好的抑制效果，抑制中濃度(EC50)為2.51 mL/L，最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，簡稱MIC)為6 mL/L[9]。Musto等研究發(fā)現(xiàn)，龍葵(Solanumnigrum)葉片粗提物含有生物堿、單寧等生物活性物質(zhì)，在體外試驗中對指狀青霉表現(xiàn)出顯著的抑制活性，且在4 ℃保存60 d的粗提物仍然有體外抑制作用；在檸檬體內(nèi)試驗中，7 d內(nèi)對指狀青霉的抑制活性仍然可以達到100%[10]。鄧利珍等研究了川芎提取液在離體和活體條件下對采后臍橙的主要致病菌指狀青霉和意大利青霉的抑制作用，結(jié)果顯示在離體條件下，川芎(LigusticumchuanxiongHort.)提取液對2種供試菌種有顯著的抑制作用(P<0.05)，最低抑菌質(zhì)量濃度均為 25.00 mg/mL；在活體條件下，川芎提取液能有效抑制2種病原菌在臍橙上的生長，且質(zhì)量分數(shù)為4%時效果較好[11]。戴素明等為篩選能應(yīng)用于柑橘保鮮的藥用植物提取物，測定了博落回(Macleayacordata)和虎杖(Polygonumcuspidatum)提取物對柑橘綠霉菌的抑菌活性以及對柑橘保鮮的效果，結(jié)果表明博落回和虎杖提取物均能抑制柑橘綠霉菌的生長，二者的有效中質(zhì)量濃度分別為184.32、538.48 mg/L，博落回的抑菌效果比虎杖好；與清水對照相比，2種提取物處理柑橘的腐爛率均顯著降低[12]。由以上結(jié)論可以看出，植物精油及植物粗提物確實對綠霉病有較好的防治效果，可以通過對中藥材粗提物的研究獲取更多用于柑橘綠霉病防治的植物精油及植物粗提物。

2 微生物保鮮劑

近年來，越來越多的拮抗菌及其提取物被發(fā)現(xiàn)可以用于柑橘采后疾病生物防治，主要包括酵母、細菌、真菌等。比如黏紅酵母(Rhodotorulaglutinis)[13]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[14]、寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)[15]。2種生物防治試劑Biosave(Pseudomonassyringae)和Shemer (Metschnikowiafructicola)已經(jīng)商業(yè)化應(yīng)用防治柑橘采后疾病[16]。拮抗菌的作用機制主要包括4種：分泌抗菌物質(zhì)、重寄生作用、營養(yǎng)和空間競爭、誘導(dǎo)果蔬抗性[17]。

王華利等發(fā)現(xiàn)檸檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)菌懸浮液能夠有效抑制溫州蜜柑尾張(CitrusunshiuMarc. cv. ‘Owari’)果實綠霉病病害的發(fā)生[18]。吳勝等發(fā)現(xiàn)了1株具有拮抗青綠霉病菌的祼腳菇屬菌株0612-9，其對意大利青霉和指狀青霉的EC50分別為69.25、56.70 g/L，其最小殺菌濃度250 μg/mL低于陽性對照物抑霉唑的500 μg/mL，并且對病原菌菌絲體有一定的毒害作用[19]。Waewthongrak等發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌及其粗提物在體內(nèi)或體外試驗中均可抑制指狀青霉的生長，發(fā)病率可以降低60%以上[20]。Niu等從指狀青霉中分離出1株真菌病毒PdV1，利用PdV1感染指狀青霉菌株HS-F6獲得菌株HS-F6V，利用HS-F6和HS-F6V進行體內(nèi)和體外試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)試驗中，接種HS-F6V的柑橘傷口直徑比接種HS-F6的小31.4%；在體外試驗中，接種HS-F6V的柑橘菌落面積比接種HS-F6的小30.4%。由此可見，真菌病毒PdV1有望開發(fā)成指狀青霉的生物防治試劑[21]。

3 天然化合物

一些天然化合物具有廣譜抗菌性，對病原細菌、病原真菌均有一定的生物抗性?？拐婢烊换衔镏饕ㄝ祁?、生物堿、皂苷類、環(huán)肽類、甾體類、有機酸類及其他類化合物[22]。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌粗提物中的環(huán)脂肽[20]、丁香酚、百里香酚[23]等均可以抑制青霉菌的生長。殼寡糖又稱寡聚氨基葡萄糖、甲殼低聚糖，它是由2～10個氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖，也是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖[24]。殼寡糖對于芒果、棗、桃、梨等水果均有較好的保鮮作用[2]。Waewthongrak等發(fā)現(xiàn)殼聚糖對指狀青霉具有較好的抑制效果，柑橘綠霉病的發(fā)病率可以降低90%以上[20]。其他的天然化合物也可以抑制綠霉病的發(fā)生。陶能國等采用瓊脂稀釋培養(yǎng)法測定檸檬醛、辛醛以及檸檬醛+辛醛混合物(體積比為4 ∶1)對指狀青霉菌絲體生長的影響，結(jié)果表明，檸檬醛+辛醛混合物能明顯抑制指狀青霉菌絲體生長，其MIC和最小殺菌濃度(minimal fungicidal concentration，簡稱MFC)均為2.50 μL/mL，而檸檬醛的MIC 和 MFC分別為2.50、5.00 μL/mL，辛醛的MIC和MFC分別為0.63、2.50 μL/mL[25]。可見將2種天然化合物聯(lián)合使用均大于單獨使用的效果。一些天然蛋白質(zhì)具有抗指狀青霉活性。Osman等利用主要含β-伴大豆球蛋白的大豆蛋白組分對指狀青霉進行體內(nèi)體外試驗，結(jié)果表明β-伴大豆球蛋白的MIC和MFC分別為50、1900 mg/L；在體內(nèi)試驗中，250 mg/Lβ-伴大豆球蛋白在7 d內(nèi)可以完全抑制指狀青霉在柑橘表面的生長，21 d后的發(fā)病率和嚴重程度分別為22%、25%[3]。Citores等研究表明，來源于甜菜(BetavulgarisL.)葉片的核糖體失活蛋白BE27(8 μg/mL)對指狀青霉生長的抑制率可以達到84%；其具體的作用機制是BE27進入指狀青霉細胞中對其核糖體大亞基中的核糖體RNA進行酶切，使核糖體失活抑制蛋白質(zhì)合成過程從而導(dǎo)致指狀青霉死亡[26]。因此，研究核糖體失活蛋白對指狀青霉的作用可以為開發(fā)其他的柑橘綠霉病的控制方法奠定基礎(chǔ)。

4 食品添加劑和GRAS化合物

食品添加劑是指為改善食品品質(zhì)，保證色、香、味以及為防腐、保鮮、加工工藝等的需要而加入食品中的人工合成或天然的物質(zhì)[27]。其中的防腐劑具有抑制微生物生長的作用，在食品行業(yè)中被大量使用，并被認為在合適劑量內(nèi)對人體是安全的。GRAS化合物是美國食品法律中的一個非常重要、獨特和龐雜的食物/食物成分類別。在美國食品法律和法規(guī)的位階上，GRAS化合物介于常規(guī)食物/食物成分和食品添加劑之間[28]。研究表明，山梨酸鉀[29]、苯甲酸/苯甲酸鈉[30]、丙酸鈉[31]、氯化鈣[32]、碳酸鈉[33]、碳酸氫鈉[34]等均可用于柑橘采后綠霉病的控制。通常認為鹽化合物的作用機制包括對質(zhì)膜的破壞、影響次級代謝、高pH值對霉菌的直接作用等[35]。蓋智星等探討了肉桂酸鉀對柑橘意大利青霉、指狀青霉生長的抑制作用，采用生長速率法測定肉桂酸鉀對致病真菌菌絲生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的抑制作用，結(jié)果表明肉桂酸鉀對2種病原真菌表現(xiàn)出不同程度的生長抑制作用，抑制作用由大至小依次為指狀青霉、意大利青霉；肉桂酸鉀質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，2種病原真菌的菌絲生長抑制率分別為100.00%、53.88%[36]。Duan等研究發(fā)現(xiàn)，脫氫乙酸鈉可以抑制指狀青霉菌菌絲的生長，其MIC和MFC分別為0.20、0.40 g/L[37]。Youssef等研究表明，碳酸鈉和碳酸氫鈉可以誘導(dǎo)柑橘組織中的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶的活性增強和植物抗毒素含量的增加，從而增強柑橘對指狀青霉的抗性，因此碳酸鈉、碳酸氫鈉可以作為柑橘采后綠霉病的控制藥物[38]。

5 綠霉病防治方法聯(lián)合使用

聯(lián)合采用不同的防治指狀青霉方法會比單一的控制策略更有效。Shao等進行了殼聚糖-丁香油聯(lián)合使用防治柑橘綠霉菌的體內(nèi)和體外試驗，結(jié)果表明在體外試驗中，殼聚糖-丁香油聯(lián)合使用防治柑橘綠霉病效果比殼聚糖和丁香油單獨使用要好，而在體內(nèi)試驗中，殼聚糖-丁香油聯(lián)合使用效果和殼聚糖單獨使用差別不大，但都比丁香油單獨使用效果要好[39]。Fan等進行了檸檬醛-蠟涂層聯(lián)合使用控制柑橘采后綠霉病的試驗，結(jié)果表明在體外試驗中，檸檬醛的MIC和MFC均為4 000 μL/L；在體內(nèi)試驗中，蠟涂層聯(lián)合1×MFC檸檬醛并不能顯著抑制指狀青霉在椪柑中的生長，但蠟涂層聯(lián)合10×MFC檸檬醛可以顯著降低椪柑的綠霉病發(fā)病率[40]。打蠟是柑橘保鮮里常見的技術(shù)[41]，殼聚糖和蠟質(zhì)均可覆蓋于柑橘果實的表面，與天然化合物、植物防腐劑或低水平的殺真菌劑聯(lián)合使用可以延長它們的作用時間，對柑橘采后綠霉病的防治效果更加持久。蠟和殼聚糖與拮抗指狀青霉的物質(zhì)聯(lián)合用于柑橘采后綠霉病的防治，將會成為一個重要的研究方向。

6 展望

雖然上述方法對柑橘綠霉病有一定的防治效果，但大部分未實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用且使用時具有一定的局限性。目前，市場上主要使用殺真菌劑對柑橘綠霉病進行防治。研究表明，指狀青霉對脫甲基抑制劑殺真菌劑的抗性是由于其殺真菌劑靶基因(CYP51)的各種基因突變或外排泵基因(如MDR1、CDR1等)上調(diào)導(dǎo)致的。CYP51基因編碼固醇14α-脫甲基酶，在真菌甾醇的合成過程中起重要作用[42]。對抗殺真菌劑菌株抗性機制的研究可為開發(fā)出效果更好的殺真菌劑做鋪墊，且可以指導(dǎo)殺真菌劑的使用?？梢岳蒙鲜龈涕倬G霉病防治方法與殺真菌劑交替使用，從而延緩抗殺真菌劑指狀青霉菌株出現(xiàn)的速率。今后應(yīng)加強對上述柑橘防治方法機制的研究，從而制定出更加合理的柑橘綠霉病控制策略。

從2012年指狀青霉全基因組序列[43]公布以來，從分子水平解釋指狀青霉致病機制的研究越來越多。研究表明，果膠裂合酶基因(Pnl1)[44]、pH信號轉(zhuǎn)錄因子基因(PdpacC)[45]、分裂素激活蛋白激酶基因(PdMpkB)[46]等在指狀青霉致病過程中發(fā)揮著重要作用。對上述基因的深入研究可以為新型殺真菌劑和保鮮劑的開發(fā)提供思路。