關(guān)秋竹，張 瓊，孫紅雁，周廣芳，孫清榮

棗(Ziziphus jujube Mill.)組培繁殖通常選擇莖尖、莖段、葉片、胚、花藥等作為外植體，目前已有棗樹品種20個以上以各種類型的外植體建立了無菌離體繁殖體系［1～4］。通過花藥培養(yǎng)獲得愈傷組織和再生植株，可以為遺傳育種研究提供重要材料。棗的花藥培養(yǎng)開始于20世紀90年代，最初僅在金絲小棗上有過報道［5］。隨后研究者們對棗花藥愈傷組織的誘導及分化進行了研究［6，7］，并成功獲得了幾個棗品種花藥再生植株，如‘長紅棗’和‘金絲小棗’再生植株［8］;‘辣椒棗’和‘月光’棗源于花藥壁的再生植株［9］;‘冬棗’單倍體2 株［9］;‘贊皇大棗’單倍體1 株［10］?！敆? 號’和‘魯棗6 號’是由山東省果樹研究所選育的新品種［11，12］，其花藥培養(yǎng)尚未見報道。為了更好地利用、保存和改良這些品種，本次研究以前人報道為基礎(chǔ)，通過正交實驗設(shè)計，旨在建立棗的離體花藥植株再生體系，為棗花藥離體培養(yǎng)研究和單倍體育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

5月底至6月初，在山東省果樹研究所棗樹資源圃采集棗樹新品種‘魯棗2號’和‘魯棗6號’綠色到黃綠色，且花萼尚未張開的幼嫩花蕾作為材料。

1.2 方法

1.2.1 花藥愈傷組織的誘導 幼嫩花蕾置于4℃冰箱中1 d后，用流水沖洗0.5～1.0 h，控凈水后置于超凈工作臺上的無菌燒杯內(nèi)，用體積分數(shù)為0.70的酒精浸泡1 min，再用體積分數(shù)為0.05的次氯酸鈉溶液殺菌15 min，無菌水沖洗3～4次后，剝?nèi)』ㄋ幗臃N在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。愈傷組織誘導培養(yǎng)基采用MS，1/2 MS，1/4 MS培養(yǎng)基，附加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源(質(zhì)量濃度均為30.0 g·L－1)，添加不同量的萘乙酸(NAA)及 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。NAA 設(shè)置 0.1，0.3，0.5 mg·L－13種質(zhì)量濃度;2，4-D 設(shè)置0.5，1.0，1.5 mg·L－13種質(zhì)量濃度。所選因素及其水平具體見表1。按 L9(34)正交試驗表形成9種不同配方的培養(yǎng)基(表2)，所有培養(yǎng)基均添加瓊脂，使其質(zhì)量濃度達到6.0 g·L－1，在滅菌前調(diào)節(jié)pH值為5.8。每個處理接種3皿，每皿接種花藥15～20個，3次重復(fù)。接種后置于(25±2)℃暗培養(yǎng)，5周后統(tǒng)計愈傷組織誘導率，觀察記錄愈傷組織生長狀態(tài)?；ㄋ幱鷤M織誘導率=［產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)/接種總花藥數(shù)］×100%

表1 ‘魯棗2號’和‘魯棗6號’花藥愈傷組織誘導的因素及水平

1.2.2 花藥愈傷組織的分化及不定芽伸長、增殖培養(yǎng) 將生長至0.5～1.0 cm的愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)。分化培養(yǎng)基以MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加噻苯隆(TDZ)，2，4-D，吲哚乙酸(IAA)及赤霉素(GA3)。設(shè)置4種不同培養(yǎng)基處理(表3)，所有培養(yǎng)基均添加麥芽糖，其質(zhì)量濃度達到20.0 g·L－1;瓊脂質(zhì)量濃度達到6.0 g·L－1。在滅菌前調(diào)節(jié)pH值到5.8。培養(yǎng)條件為光周期16 h/8 h(光/暗)，光強40μmol·(m2·s)－1，溫度(25±2)℃。6周后，統(tǒng)計花藥愈傷組織分化率。

選取生長正常、未玻璃化的不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基進行繼代增殖和伸長培養(yǎng)。不定芽的增殖培養(yǎng)基為WPM，6-BA 的質(zhì)量濃度4.0 mg·L－1，TDZ的質(zhì)量濃度1.0 mg·L－1，附加蔗糖的質(zhì)量濃度為30.0 g·L－1，瓊脂的質(zhì)量濃度為 6.0 g·L－1，在滅菌前調(diào)節(jié) pH 值到 5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥愈傷組織的誘導

利用L9(34)正交設(shè)計篩選適宜的棗花藥愈傷組織誘導培養(yǎng)基，5周后統(tǒng)計結(jié)果，并對正交試驗結(jié)果進行直觀分析(表2)。經(jīng)極差分析，4個因素對‘魯棗2號’及‘魯棗6號’花藥愈傷組織誘導均有影響，影響因素由大到小的排列順序均為:C，D，A，B。即碳源因素對愈傷組織誘導影響最大，極差值分別為32.7(‘魯棗2號’)和41.5(‘魯棗6號’)，其次為基本培養(yǎng)基、NAA 和2，4-D。本次試驗采用了 MS，1/2MS，1/4 MS 3種基本培養(yǎng)基，效果最好的是1/4 MS培養(yǎng)基;碳源因素方面，‘魯棗2號’花藥愈傷組織誘導率最高的是葡萄糖，其次是麥芽糖，但兩者K值差異不大;‘魯棗6號’誘導效果最好的是麥芽糖;2種激素中NAA對愈傷組織誘導的影響較大，NAA的質(zhì)量濃度為0.3 mg·L－1的誘導效果較好，2，4-D影響效果較小?；九囵B(yǎng)基、碳源和激素水平的不同，花藥愈傷組織表現(xiàn)為不同的形態(tài)(表2)。可分為3種主要形態(tài)，分別為黃白色致密愈傷組織、褐色疏松愈傷組織和褐色致密愈傷組織。黃白色致密愈傷組織主要發(fā)生在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上;褐色疏松愈傷組織主要發(fā)生在以葡萄糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上;以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上還會產(chǎn)生一些褐色致密愈傷組織。

2.2 花藥愈傷組織的分化

‘魯棗2號’和‘魯棗6號’的黃白色致密愈傷組織在分化培養(yǎng)基上均可以進行正常分化形成不定芽。首先愈傷組織頂部變綠，產(chǎn)生綠色或白色凸起(圖1 A)，形成不定芽(圖1 B，圖1 C)，將不定芽轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基上，表現(xiàn)為既有伸長生長也有增殖生長(圖1 E)。而褐色致密愈傷組織在分化培養(yǎng)過程中，愈傷組織頂部產(chǎn)生綠色、玻璃化的愈傷組織，可進一步分化形成玻璃化芽(圖1 D)，玻璃化芽轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基上，不能進行正常生長及增殖。褐色疏松型愈傷組織在后續(xù)培養(yǎng)的過程逐漸褐化死亡。

‘魯棗2號’黃白色致密愈傷組織在分化培養(yǎng)基①和②上均不能分化，在分化培養(yǎng)基③和④上則能較好的實現(xiàn)分化，分化率分別為80%(分化培養(yǎng)基③)和100%(分化培養(yǎng)基④)(表3)。魯棗6號黃白色致密愈傷組織在分化培養(yǎng)基①，③和④上均能實現(xiàn)分化，分化率最高為50%(分化培養(yǎng)基③)(表3)。

表2 ‘魯棗2號’和‘魯棗6號’花藥愈傷組織誘導的正交試驗結(jié)果直觀分析

圖1 ‘魯棗6號’花藥愈傷組織誘導芽的分化及增殖

表3 不同類型花藥愈傷組織的分化情況

3 結(jié)論與討論

本次試驗利用L9(34)正交設(shè)計篩選獲得了適宜‘魯棗2號’和‘魯棗6號’花藥愈傷組織誘導的培養(yǎng)基。對愈傷組織誘導率，‘魯棗2號’的最優(yōu)組合為:C2D3A2B3;‘魯棗6號’的最優(yōu)組合為:C3D3A2B3。對愈傷組織類型，以蔗糖為碳源時，‘魯棗2號’雖然可獲得較高的花藥愈傷組織誘導率，但得到的愈傷組織多為褐色致密或疏松型愈傷組織，后續(xù)培養(yǎng)過程中或死亡，或轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后進行分化，但多形成玻璃化不定芽，無法正常伸長及增殖。因此，‘魯棗2號’和‘魯棗6號’花藥愈傷組織誘導培養(yǎng)基的最優(yōu)組合均應(yīng)為:C3D3A2B3，即1/4 MS，NAA的質(zhì)量濃度0.3 mg·L－1，2，4-D的質(zhì)量濃度1.5 mg·L－1，麥芽糖的質(zhì)量濃度30.0 g·L－1。正交試驗結(jié)果的直觀分析表明，實驗所選4個影響因素中，碳源的種類對花藥愈傷組織誘導率的影響最大。與前人在冬棗上的研究結(jié)果一致［7～9，13］，本次試驗結(jié)果表明，麥芽糖是‘魯棗2號’和‘魯棗6號’花藥愈傷組織培養(yǎng)的最適碳源。以麥芽糖為碳源，不但獲到較高的愈傷組織誘導率，且愈傷組織形態(tài)好，分化效率高。韓晶等［9］也在‘金絲小棗’和‘長紅棗’花藥培養(yǎng)中，以麥芽糖為碳源，誘導得到了黃白色、致密的愈傷組織。進一步的愈傷組織分化試驗表明，黃白色致密愈傷組織具有較強的分化能力，且能夠分化得到正常不定芽，在分化培養(yǎng)基MS，TDZ的質(zhì)量濃度0.1 mg·L－1，IAA 的質(zhì)量濃度0.1 mg·L－1，GA3的質(zhì)量濃度 1.0 mg·L－1和培養(yǎng)基 WPM，KT 的質(zhì)量濃度 0.2 mg·L－1，IAA 的質(zhì)量濃度0.5 mg·L－1，GA3的質(zhì)量濃度1.0 mg·L－1上分化率均較高且差異不顯著;褐色致密愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后也能進行分化，但多形成玻璃化不定芽;在黃白色致密型愈傷組織分化過程中也有一定比例玻璃化不定芽的出現(xiàn)(數(shù)據(jù)未列出)。武曉紅［13］在對冬棗等5個棗品種的花藥愈傷組織分化的研究中發(fā)現(xiàn)，添加三十烷醇的分化培養(yǎng)基上的愈傷組織分化率較高，但多以玻璃化植株為主。韓晶等［14］對玻璃化苗適宜的繼代培養(yǎng)基和玻璃化苗的復(fù)壯條件進行了研究，認為添加聚乙烯醇、降低培養(yǎng)溫度、使用封口膜等措施都有利于玻璃化苗的復(fù)壯。關(guān)于如何防止棗花藥愈傷組織分化過程中玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生還有待進一步研究。

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