曹 林， 沈繼錄

隱球菌是廣泛存在于自然界中的一種真菌，其中包括新生隱球菌、格特隱球菌等變種。新生隱球菌可引起條件致病性感染，其感染主要發(fā)生在免疫力低下的人群，如AIDS患者、器官移植后患者或長期使用糖皮質激素的患者等。新生隱球菌是一種類酵母樣真菌，廣泛存在于鴿子的糞便、灰塵中等，可經呼吸道、消化道等途徑進入人體引起隱球菌病。新生隱球菌菌體周圍有一圈寬厚的莢膜，是其重要的致病物質，有抑制人體內免疫細胞吞噬、促使和誘導動物免疫無應答、降低人體對病原菌抵抗力的作用，而菌體外無莢膜的隱球菌則一般不引起隱球菌病。近年來，隱球菌屬的實驗室檢查方法不斷改進完善，除了傳統(tǒng)的檢查方法包括印度墨汁染色、真菌培養(yǎng)、血培養(yǎng)以及莢膜多糖抗原抗體免疫反應，還開展了特定基因的檢測，利用特定基因片段的基因序列可用于鑒定、分型和種群遺傳學研究。特定的基因組區(qū)域，通過PCR進行擴增測序，對非常見的隱球菌引起的隱球菌病的診斷分型尤其重要。

1 常規(guī)病原體檢查和生化檢查

1.1 墨汁染色法

取新鮮標本（如腦脊液）少許，置于載玻片上，滴加印度墨汁或優(yōu)質國產墨汁并覆以蓋玻片，顯微鏡暗視野下找見圓球形菌體，菌體周圍有一圈透明的肥厚莢膜，折光性強，即為陽性，多次查找可提高陽性率。但該法受實驗者經驗、主觀臆斷、墨汁質量等影響，陽性率不高，但該法可操作性強，方法簡便，仍為實驗室檢驗隱球菌首選方法。

1.2 真菌培養(yǎng)

將新鮮標本接種于沙保弱培養(yǎng)基中，在適宜溫度下培養(yǎng)3～4 d可形成肉眼可見的菌落。該法受標本取材、運送過程的影響，培養(yǎng)的陽性率并不高，且操作繁瑣，耗時長，易受環(huán)境污染，但受目前實驗室檢驗方法限制，真菌培養(yǎng)仍是確診隱球菌感染的“金標準”。

1.3 生化檢查

利用新生隱球菌可產生尿素酶這一特點，常用尿素瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，尿素酶分解尿素使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。

2 血清學檢查

利用乳膠凝集反應檢測血清或體液中的莢膜多糖抗原是目前最常用的血清學方法，但試劑檢測的敏感度和特異度會因不同標本類型、試劑廠家來源不同而有所差別。

2.1 乳膠凝集試驗

以人工合成的聚苯乙烯乳膠顆粒作為載體直接吸附抗體（或抗原）形成致敏乳膠顆粒，可與特異性抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應產生肉眼可見的白色沉淀，即為乳膠凝集反應。美國IMMY公司進口原裝真菌檢測系統(tǒng)，可對隱球菌的莢膜多糖抗原進行定量或半定量檢測，此法可檢測血清、腦脊液及其他體液標本中新生隱球菌莢膜多糖（抗原），可運用于快速診斷[1-2]。在隱球菌感染的早期快速診斷中，乳膠凝集法明顯優(yōu)于墨汁染色和標本真菌培養(yǎng)，且陽性率高，有利于早期發(fā)現(xiàn)感染者，防止漏診。

2.2 膠體金方法

隱球菌莢膜多糖抗原膠體金法試紙條是一種快速和簡便的檢測試劑，該法利用免疫層析技術，用膠體金標記單克隆抗體，檢測特異性隱球菌抗原。若待測標本中存在隱球菌莢膜多糖抗體，則抗原抗體結合，并可在試紙表面遷移層析，檢測線和質控線均顯紅色，則為陽性。據(jù)有關文獻指出，膠體金法檢測結果與乳膠凝集試驗和酶聯(lián)免疫法有很好的一致性，甚至可以檢出有Cgattii引起的感染[3]。膠體金法檢測隱球菌方法簡單，設備要求低，大多數(shù)實驗室都可開展，因此近年來采用膠體金方法檢測隱球菌感染的診斷逐漸得到推廣，值得注意的是有文獻指出膠體金法的靈敏度為73.17%，存在一定程度的假陰性，因此該法通常作為隱球菌病的初篩方法，陰性結果亦不能排除隱球菌感染。相對于乳膠凝集法，膠體金法檢測隱球菌最大的優(yōu)勢在于操作簡單，檢測時間短，結果判定簡單，未來膠體金法可能會取代乳膠凝集法檢測新生隱球菌[1-2]。

2.3 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫吸附測定法，是將抗原、抗體等成分以各類標志物標記之，使抗原抗體反應更為敏感而成為肉眼可檢測的方法。該法是將已知特異性抗體吸附于聚氯乙烯板孔內，加入待檢的含有相應抗原的標本，溫育后抗原抗體結合，再加入酶標特異性抗體，如能結合，最后加入適當基質使酶分解，從酶分解后出現(xiàn)的顏色反應可計算出待檢標本的抗原含量。新生隱球菌莢膜主要成分為多糖，其中最重要的是葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖（GXM）。研究表明，GXM是隱球菌莢膜多糖最主要的組成部分，約占莢膜多糖總質量的90%，在新生隱球菌的A、B、C、D血清型中都可以檢測到，利用雙抗體夾心法，其靶抗原為新生隱球菌的GXM，可用于檢測新生隱球菌[4]。Percival等[5]通過酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測新生隱球菌莢膜多糖的主要成分GXM，設計出單克隆抗體滿足多糖抗原GXM 4種血清型的隱球菌抗原檢測。

2.4 側向層析方法

一種新型檢測方式，借助于雜化傳感技術，可在數(shù)分鐘內完成對核糖體核糖核酸（rRNA）的檢測，側向層析檢測的目的是獲得一條清晰分明的檢測線，這極大依賴于捕獲試劑與硝酸纖維素膜的準確結合。Hansen等[6]通過側向層析方法、酶聯(lián)免疫法和乳膠凝集試驗 3種方法檢測血清、腦脊液中的隱球菌，定性分析結果的一致性為97.7%，表現(xiàn)出較好的一致性。McMullan等[7]利用側向層析方法和乳膠凝集試驗方法檢測隱球菌的結果也達到較好的一致性，但側向層析方法/酶聯(lián)免疫法的效價卻不理想。Williams等[8]通過側向層析方法檢測指尖血清、血漿、全血的隱球菌抗原，結果一致可靠，表明可用于患者隱球菌病的篩查和方便臨床工作。

3 組織病理學檢查

隱球菌在機體內大量繁殖后可引起機體免疫反應，發(fā)生慢性炎性反應，病變早期產生的大量莢膜物質具有抑制中性粒細胞趨化作用和吞噬作用，故浸潤的炎性細胞是單核細胞、淋巴細胞和漿細胞。有的病變則表現(xiàn)為肉芽的形成，主要由單核細胞、上皮細胞和多核巨細胞等構成，此時隱球菌數(shù)目較少，且大部分被吞噬細胞吞入胞漿內。在新鮮的活動性病灶內，菌體大小不等，小的居多，大多處于出芽狀態(tài)，容易見到單芽生孢子。

3.1Masson-Fontana銀染色方法

Masson-Fontana黑色素染色利用黑色素具有將銀氨溶液還原為金屬銀特性即嗜銀反應原理來顯示黑色素，染色后黑色素呈黑色，該法屬于常用的黑色素特殊染色法，效果較其他染色理想。其缺點是浸銀時間太長，銀易析出，不易掌握。該法易受操作人員經驗水平限制，若染色時間掌握不當，易出現(xiàn)過染現(xiàn)象。Bishop等[9]的Masson-Fontana銀染試驗對隱球菌的靈敏度為100%，但出現(xiàn)了假陽性，敏感性和陰性預測值高，特異性較低。

3.2 瑞氏-姬姆薩染色

取腦脊液0.5 mL，采用粟式FMU-6玻片離心沉淀法收集細胞，運用細胞學瑞氏-姬姆薩染色，在高倍鏡下可直接觀察到隱球菌形態(tài)呈大小不等、相隔距離基本相同的紫藍色圓形茁體[10]。

3.3 麥胚凝集素染色

通過異硫氰酸熒光素結合凝集素，評估伴刀豆球蛋白A、荊豆凝集素、麥胚凝集素、花生凝集素對臨床分離株新生隱球菌變種（Cryptococcus neoformans var. Grubii）的細胞壁染色效果，發(fā)現(xiàn)麥胚凝集素染色的效果最好，提示可用于疑似隱球菌感染檢測[11]。

3.4 其他

HE染色的切片上，新生隱球菌著色較淺，菌體結構不清難以觀察，胞壁淡藍色或淡紅色，莢膜不著色；過碘酸雪夫（PAS）染色和六胺銀（GMS）染色主要是利用莢膜多糖對染料具有強親和力，PAS染色菌體呈淡紅色；GMS染色呈黑色。

4 分子生物學方法

分子生物學方法并不是隱球菌病的常規(guī)診斷方法，但因其具有高靈敏度和高特異度，可以克服傳統(tǒng)診斷的各種缺陷，因此在菌種鑒定、分型、分子流行病學方面應用廣泛。利用分子生物學方法，針對不同隱球菌種的特定基因序列檢測，可對臨床標本或培養(yǎng)物中的隱球菌進行檢測和分型。其中最主要的就是雜交技術，雜交技術是分子鑒定和針對病原體檢測的特異性分子探針的基礎。

4.1DNA–DNA分子雜交

該方法理論基礎是通過堿基互補配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈DNA分子。DNA–DNA雜交的特異性探針的發(fā)展，為隱球菌病的病原種類的先驅研究做出了鋪墊，特別是Southern印跡雜交，經瓊脂糖凝膠電泳分離后檢測特定的DNA片段的分子含量，可作為對新生隱球菌和格特隱球菌特定區(qū)域初始識別的一種主要方法。隨著其他更加快速有效技術的出現(xiàn)，DNA–DNA分子雜交更多的用于科研。目前Luminex xMAP分子技術用到的原理主要是雜交，通過Luminex xMAP特異性的內轉錄間隔區(qū)（ITS）-2探針同時檢測臨床相關真菌，包括隱球菌。有學者通過rDNA IGS的探針對神經隱球菌病的患者腦脊液標本和培養(yǎng)物進行分子雜交，成功分離出病原菌。

4.2 聚合酶鏈反應（PCR）

真核生物的rRNA基因ITS是rDNA上的一個非編碼區(qū)域，它包括ITS-1（位于18S rDNA和5.8S rDNA之間）和ITS-2（位于5.8S rDNA和28S rDNA之間）區(qū)。該區(qū)域受外界環(huán)境的影響較小，與編碼區(qū)相比具有進化速度快的特點。因此ITS是常被用來PCR擴增的基因序列，可分析檢測隱球菌[12]。PCR是隱球菌病病原體研究的主要分子技術。Feng等[13]使用一對引物通過單重PCR對特定糖轉運蛋白基因擴增，可快速鑒別和區(qū)分隱球菌。

4.3PCR-限制性酶切分析

基因組或一段核酸用限制性內切酶消化產生的片段經電泳等方法分離形成獨特的條帶圖譜，對DNA序列的特征進行分析。Cordeiro等[14]通過PCR-限制性酶切分析檢測隱球菌CAP59基因發(fā)現(xiàn)，與通過形態(tài)和生化特征鑒定的手工方法相比，PCR-限制性酶切分析表現(xiàn)更加高效、快捷，且檢測結果與手工法結果一致。

4.4 巢式PCR

巢式PCR是一種變異的PCR，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段，是一種有效而特異性高的分子技術。Putignani等[15]首次使用巢式PCR檢測患者腦脊液標本中的隱球菌rDNA的ITS，發(fā)現(xiàn)具有高靈敏度，真菌細胞為10個/mL就可檢出，標本檢出率100%。雖然比傳統(tǒng)PCR靈敏度高，但也要注意非特性產物的干擾。

4.5 多重PCR

多重PCR是在普通PCR的基礎上加以改進，于一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板不同區(qū)域擴增多個目的片段的PCR技術。Zhou等[16]通過與瑞氏-姬姆薩染色相比，多重PCR技術檢測隱球菌腦膜炎患者標本，其敏感度和特異度分別為92%和97.1%，Rhein等[17]的檢測靈敏度和特異度均為100%。多重PCR Luminex技術可同時檢測多種病原體，也表現(xiàn)出潛在的高效率。與常規(guī)PCR相比，多重PCR存在多態(tài)性以及引物競爭目標序列和反應物等缺點。

4.6 實時熒光定量PCR

利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線進行定量分析的方法，成為實驗室快速診斷方法，已廣泛應用于真菌性疾病的診斷，目前也逐漸應用于隱球菌感染的診斷。利用TaqMan探針法熒光定量PCR檢測新生隱球菌基因組DNA，具有良好的敏感性、特異性、重復性，可早期準確地診斷隱球菌性腦膜炎，為臨床診斷和治療提供重要依據(jù)[18-19]。

4.7 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）

MALDI-TOF MS 是一門新興的分子成像技術，對于發(fā)現(xiàn)疾病生物學標志和研究藥物代謝等方面具有重要意義，并具有良好的臨床應用前景。這種技術可以在數(shù)分鐘內鑒定，且能完成菌體多種成分的分析，包括蛋白質、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被離子化的分子。對于隱球菌的分類，傳統(tǒng)的方法是通過菌體的外部形態(tài)特征、生化生理特征，但敏感性和特異性差，結果準確度不高。MALDI-TOF MS可作為隱球菌屬中菌株分類鑒別中有效的分子生物學方法[20]，能可靠地揭示隱球菌屬中各菌種的種間及種內的遺傳進化關系，MALDI-TOF-MS比多位點序列分型（MLST）更為快捷準確[21]。2012年Piractive等[22]利用質譜技術對164株新生隱球菌和格特隱球菌進行鑒定，可以100%鑒定到種，并對8個主要的分子類型進行分類。Tarumoto 等[23]認為MALDI-TOF MS對鑒別播散性隱球菌病是非常有用的手段，他們收集了過去10年醫(yī)院發(fā)生傳播性隱球菌病8例患者的標本，通過使用MALDI-TOF MS和基因測序方法對比檢測，結果MALDI-TOF MS可準確檢測出全部8例隱球菌，而基因測序法將其中的1株鑒定為曲霉。

4.8Luminex xTAG

此技術使用Luminex專有的通用標簽，通過標簽序列與反標簽序列的專一性互補配對，進行核酸實驗優(yōu)化，產品開發(fā)和分子診斷化驗。xTAG技術能保證相同的復性溫度和雜交效率，且有效避免不同檢測物標記的微球之間交叉雜交。Baladaliasat等[24]利用xTAG技術檢測血培養(yǎng)的臨床真菌（包括隱球菌），顯示其靈敏度和特異度分別高達100%和99%。

5 小結

關于微生物的分型，下述方法可用來區(qū)分真菌的血清型和分子分型，如PCR指紋圖譜，PCR-限制性片段長度多態(tài)分析技術、擴增片段長度多態(tài)性和多位點序列分型[25]。通過分子生物學方法，可對耐藥菌株的監(jiān)測和疾病的治療產生積極影響。雖然隱球菌的檢測方法有很多，但快速準確、敏感性高、特異性好的抗原檢測技術和分子鑒定技術的要求較高，需要相應的設備和技術人員以及費用較高等問題，多用于科研，臨床應用少；而目前臨床應用的墨汁染色法、真菌培養(yǎng)等檢測方法陽性率不高、耗時，但成本較低。因此需要解決這方面的問題，有待進一步探索出快捷、方便、準確、費用低的檢測方法。

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