肖紅慶 李曉薇 Jameel Aysha 劉偉燦 章婷婷 王一帆 李海燕

（吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春130118）

啟動子在基因轉(zhuǎn)錄的起始和調(diào)節(jié)中發(fā)揮非常重要的作用，在基因工程中是重要的組成構(gòu)件[1]。天然啟動子很難實現(xiàn)連續(xù)的、有目的性的調(diào)控。對于組成型啟動子，一般啟動子的序列都比較固定，所以啟動子的活性一般也都無法實現(xiàn)更多的調(diào)控。而對于誘導型啟動子，經(jīng)過誘導物的誘導之后，通過改變濃度可以在一定的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)啟動子的活性，但超出這個范圍啟動子的活性是不可以調(diào)節(jié)的。因此，為了獲得更多在不同條件下具有不同強度、不同功能的啟動子，更為精細的調(diào)節(jié)基因的表達，近年來，人工合成啟動子的研究受到越來越多人的關(guān)注。

近年來，生物技術(shù)與生物信息學的不斷發(fā)展，具有特定功能的調(diào)控元件在顯示出巨大的應(yīng)用潛力[2]。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控直接影響基因的表達水平，而啟動子是轉(zhuǎn)錄水平的重要調(diào)節(jié)者，因此，啟動子是生物學中的重要調(diào)控元件之一[3，4]。人工合成啟動子是指按照實踐需求合成一段啟動子序列，人工合成啟動子能夠?qū)崿F(xiàn)對基因進行更為精細和定量的調(diào)控，使調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中各個基因的表達強度實現(xiàn)最佳組合[5]。人工合成啟動子對于植物生物技術(shù)、基因治療和生命科學基本原理研究具有重要價值。本文具體闡述了人工合成啟動子工業(yè)生產(chǎn)、基因治療及農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，并且分析了人工合成啟動子的發(fā)展趨勢。

1 在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用

合成啟動子可以通過調(diào)節(jié)代謝途徑生產(chǎn)生物和化學產(chǎn)品，用于工業(yè)上大規(guī)模的生產(chǎn)過程[6]。在綜合的生物系統(tǒng)中啟動子存在的遺傳不穩(wěn)定性，是大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中最重要的限制條件[7]。因此，在這些系統(tǒng)中使用合成啟動子有助于基因的低水平表達，可以提高遺傳穩(wěn)定性，所以在解決這類問題時設(shè)計的合成啟動子應(yīng)該避免重復序列以防止序列重組，另一種解決方法是使用可誘導的啟動子。總之，在復雜的基因工程中使用合成啟動子技術(shù)有利于增加基因的穩(wěn)定性和提高對調(diào)控元件調(diào)節(jié)效率的控制。例如，在原核生物體內(nèi)設(shè)計表達兩種或者更多的酶基因，突變體在幾代內(nèi)會連續(xù)增加最終導致基因表達的終止，這是因為突變體在幾代內(nèi)的積累導致基因失活，有研究報道，通過使用不同強度的雙啟動子對N-乙酰葡糖胺合成路徑中Liu 等利用雙啟動子系統(tǒng)對N-乙酰葡糖胺合成路徑中2 個關(guān)鍵酶基因的組合進行優(yōu)化，使其產(chǎn)量提高了32.4%[8]，說明可以利用合成啟動子技術(shù)提高某些工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量。

2 合成啟動子用于基因治療

合成啟動子技術(shù)的又一重大應(yīng)用是在疾病治療上的應(yīng)用。實際上腫瘤的病毒療法作為潛在的治療方法已經(jīng)有幾十年的研究歷史，通過產(chǎn)生一類可復制的病毒使其在腫瘤細胞中特異性的復制使腫瘤細胞特異性死亡。有研究報道，應(yīng)用一個復制的有活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠選擇性殺死腫瘤細胞[9]，其原理在于通過在逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復序列上結(jié)合前列腺特異啟動子，在前列腺特異啟動子的基礎(chǔ)上設(shè)計更多在前列腺癌細胞中有活性的合成啟動子，其結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒只在癌細胞中有效的轉(zhuǎn)導和復制，這是一個令人關(guān)注的治療癌癥的療法。

另外，只在循環(huán)內(nèi)皮細胞有活性的啟動子對于癌癥基因療法是一個重要的治療手段。可以使目標新血管在腫瘤中生長以切斷供應(yīng)腫瘤生長的營養(yǎng)，發(fā)展一種癌癥基因療法。有研究采用此種方法，cdc6基因的啟動子只在分裂的細胞中有活性，使啟動子與內(nèi)皮素增強子元件相結(jié)合構(gòu)建一個在內(nèi)皮細胞中有活性的合成啟動子[10]，在體外4個內(nèi)皮素元件結(jié)合到cdc6啟動子上得到了最優(yōu)的啟動子。當將其引入體內(nèi)時，合成啟動子在腫瘤組織中比CMV35S(Cucumber mosaic virus)啟動子具有更高的驅(qū)動基因表達的效率。

合成啟動子在基因治療方面的另一個重要應(yīng)用是構(gòu)建肝臟特異性啟動子，在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中用來治愈糖尿病[11]。通過隨機組合順式作用元件構(gòu)建一個在肝細胞中對胰島素敏感的合成啟動子，注射最高劑量病毒的小鼠在50d內(nèi)未出現(xiàn)高血糖癥狀。注射由CMV啟動子表達胰島素的腺病毒由于血糖過低導致了小鼠的死亡，這說明基因治療中對表達的調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的，同時說明設(shè)計啟動子時對基因表達的控制是不可忽視的[12]。

3 植物抗逆上的應(yīng)用

植物中主要是通過在核心啟動子上游組合順式調(diào)控元件來構(gòu)建脅迫誘導型人工合成啟動子。有研究導報利用W1-box、W2-box、GCC-box、JERE等調(diào)控元件構(gòu)建的四聚體構(gòu)建人工合成啟動子，轉(zhuǎn)化合成啟動子的轉(zhuǎn)基因植物在受到病原菌脅迫時報告基因GUS的表達結(jié)果說明，在受到不同脅迫誘導時，基因的表達水平和啟動子的可誘導成都均有所不同[13]。同樣通過組合來自小麥的ABRE和來自大麥HVA22的ABRC調(diào)控元件，并且與Mini35S啟動子融合構(gòu)建的合成啟動子，轉(zhuǎn)化合成啟動子的轉(zhuǎn)基因煙草在受到高鹽、脫水和脫落酸脅迫時，報告基因GUS的表達水平均有所提高，證明構(gòu)建的人工合成啟動子對某些逆境脅迫有響應(yīng)[14]。Liu等人通過組合對于植物防御病原菌有作用的順式調(diào)控元件構(gòu)建人工合成啟動子，通過在轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草中的功能分析，在轉(zhuǎn)基因植物手病原菌、水楊酸、乙烯和茉莉酸甲酯等脅迫時，構(gòu)建的人工合成啟動子能夠提高報告基因的表達水平[15]。

植物中合成啟動子的研究相對較少且大多集中于誘導型合成啟動子，主要利用順式調(diào)控元件融合核心啟動子的方法構(gòu)建。Rushton 等[13]曾利用 W1-box、W2-box、GCC 元件、JERE 元件等組合成多種四聚體人工合成啟動子。不同病原菌處理下的轉(zhuǎn)基因植株 GUS 分析結(jié)果顯示，不同啟動子的誘導因子、本底表達水平和誘導程度均存在明顯差別。通過四拷貝小麥來源的脫落酸應(yīng)答元件(4×ABRE)或者兩拷貝脫落酸應(yīng)答元件連接兩拷貝大麥 HVA22 結(jié)合元件(2×ABRC)分別與 Mini 35S 融合發(fā)現(xiàn)，合成啟動子能夠誘導 GUS報告基因在轉(zhuǎn)基因煙草中對高鹽、脫水和脫落酸應(yīng)答表達，證明它們能夠作為一種有效的脅迫誘導啟動子。Koschmann 等人根據(jù) 生物信息學分析結(jié)果，篩選到PathoPlant 數(shù)據(jù)庫中的擬南芥芯片數(shù)據(jù)，挑選出受病原菌誘導上調(diào)表達的基因，利用 BEST 軟件尋找這些基因啟動子區(qū)的保守序列，然后與 AthaMap、PLACE 和 AGRIS 數(shù)據(jù)庫中的順式調(diào)控元件比對，挑選與已知順式調(diào)控元件的相似度低的保守序列，通過合成啟動子的方法驗證[14]。Liu 等人將一些與病原菌和植物防御信號分子誘導相關(guān)的順式調(diào)控元件與核心啟動子融合并穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，對轉(zhuǎn)基因植株進行病原菌、水楊酸、乙烯和茉莉酸甲酯處理，結(jié)果證實合成的誘導型啟動子在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥中能夠發(fā)揮預期功能[15]。

在農(nóng)業(yè)上，惡劣的環(huán)境例如干旱、高鹽和低溫等條件對作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量都有較大的影響[16]，遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為一種重要的提高作物抗逆性的手段。合成啟動子包含天然啟動子區(qū)域的調(diào)控元件DNA序列，并且它們與天然啟動子極大的不同，因為它們可以提供自然界中不存在的表達譜。合成啟動子還可以對啟動子中某部分序列的功能進行分析驗證，合成啟動子可以通過有規(guī)律的、有目的的組合順式調(diào)控元件來構(gòu)建，合成啟動子中順式元件的排列可以導致非常精確的轉(zhuǎn)基因表達，而避免了在“全長”啟動子序列內(nèi)存在的另外的元件產(chǎn)生的非特異性表達[17，18]。

轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)許多抗逆基因的表達，而且在調(diào)節(jié)植物對脅迫的響應(yīng)方面發(fā)揮重要的作用，例如ABA響應(yīng)元件結(jié)合因子/ABA響應(yīng)元件家族[19]。在某些物種中，在其他脅迫響應(yīng)基因表達的條件下，基本的DREBs/CBFs基因過表達可以對干旱、高鹽、低溫等脅迫產(chǎn)生抗性[20]。同時AtMYC2和AtMYB2 cDNAs基因的過表達可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。然而，在正常條件下轉(zhuǎn)基因過表達會阻礙植物的生長和大幅度降低作物產(chǎn)量[21，22]。有研究報道在脅迫誘導處理的擬南芥rd29A啟動子的作用下，DREBs/CBFs基因的表達對植物的生長可以產(chǎn)生最小的干擾，可以獲得最優(yōu)的抗逆植株[23]。并且在很多不同的轉(zhuǎn)基因植物中也得到了同樣的結(jié)論，例如馬鈴薯[24]、番茄、花生[25]、煙草[21]、大米[26]。通過組合抗逆調(diào)節(jié)序列構(gòu)建人工合成啟動子，實現(xiàn)了在不同逆境脅迫條件下合成啟動子在植物所有的器官和組織中的響應(yīng)，并且誘導基因有效的表達。

另外，合成啟動子在早期檢測植物病原體感染方面也有重要的應(yīng)用價值。在抗病信號傳導途徑中，許多抗病相關(guān)基因的啟動子區(qū)都包含一系列保守的順式作用元件，它們對植物抗病響應(yīng)的精確調(diào)控發(fā)揮著重要作用。隨著對這些順式作用元件功能的了解，可以通過組合這些有功能的元件，產(chǎn)生用于防治植物病害的誘導型啟動子[27]。通過農(nóng)桿菌浸入法轉(zhuǎn)染煙草，啟動子在相應(yīng)的植物激素處理時具有敏感性和可誘導性，通過擬南芥介導的瞬時表達體系證明合成的誘導型啟動子可以對植物病原體的感染進行早期的檢測。在作物防病抗病方面，誘導型啟動子相對于天然啟動子更有優(yōu)勢和利用價值。

4 展望

合成啟動子在過去超過20a的時間里，在識別天然啟動子重要的結(jié)構(gòu)特點、和調(diào)節(jié)基因表達方面發(fā)揮著重要的作用。近年來，生物信息學的發(fā)展和大量實驗方法與實驗儀器的進步，促進了在嚴格的調(diào)控下能夠驅(qū)動基因有效表達的高特異性啟動子的合成。將來可以設(shè)計在病變的細胞、特異組織和感染不同病原體的細胞中有活性的啟動子，在臨床上用于檢測和治療目前無法得到治愈的疾病。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展進步，成功的實現(xiàn)了在生物系統(tǒng)中的模擬實驗。有研究報道目前能夠通過[28]利用計算子模型確定了造血干細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。隨著計算機預測技術(shù)在未來的不斷發(fā)展，實現(xiàn)對啟動子表達強度的預測將會成為可能。在對啟動子的設(shè)計，選擇和利用方面將會更加合理。因此在未來構(gòu)建具有本底活性低、定向表達、啟動表達快、表達易調(diào)節(jié)等特點的人工合成啟動子，仍然是將來研究的重點。隨著對人工合成啟動子研究的不斷深入與發(fā)展，人工合成啟動子在生物制藥、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域和開發(fā)新的基因療法等方面將會有更加廣泛的應(yīng)用前景。

[1] Yan Li,Yan Sun,Qingchuan Yang,et al.Cloning and function analysis of an alfalfa (Medicago sativa L.) zinc finger protein promoter MsZPP[J].Mol Biol Rep,2012(39):8559–8569.

[2]賀飛燕,閆建俊,白云鳳,等.啟動子的類型及應(yīng)用[J].山西農(nóng)業(yè)科學, 2017,01(45):115-120.

[3] Jay D. Keasling.Synthetic biology and the develo pment of tools for metabolic engineering[J].Metab Eng,2012,14(3):189-195.

[4] Eric Young and Hal Alper.Synthetic biology:tools to design,build,and optimize cellular pr-ocesses[J].Journal of Biomedicine and Biotechnology,2010.

[5]王睿,朱夢琳,高方遠,等.水稻組織特異型人工合成啟動子的設(shè)計、構(gòu)建及功能鑒定[J].作物學報,2017,6(43):789-794.

[6] Bingyin Peng, Lars K. Nielsen, Sotirios C.Kampranis,et al. Engineered protein degradation of farnesyl pyrophosphate synthase is an effective regulatory mechanism to increase monoterpene production in Saccharomyces cerevisiae[J]. Metab Eng,2018(19).

[7] Yanfeng Liu, Yanqiu Zhu,Jianghua Li,et al.Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production[J]. Metabolic Engineering,2014(23):42–52.

[8] Sean C Sleight* , Bryan A Bartley, Jane A Lieviant,et al.Designing and engineering evolutionary robust genetic circuits[J].Journal of Biological Engineering,2010,4(11):ISSN 1754-1611.

[9] Shi-He Liu, Juehua Yu, Robbi Sanchez,et al. A novel synthetic human insulin super promoter for targeting PDX-1-expressing pancreatic cancer[J].Cancer Lett,2018(1):75-83.

[10] P. Szymanski,K. Anwer,S. M.Sullivan. Development and characterization of a synthetic promoter for selective expression in proliferating endothelial cells[J].THE JOURNAL OF GENE MEDICINE,2006(8):514–523.

[11] Jaeseok Han,Brienne McLane,Eung-Hwi Kim,et al.Remission of Diabetes by Insulin Gene Therapy Using a Hepatocyte-specific and Glucose-responsive Synthetic Promoter[J]. Molecular Therapy,2010,19(3):470-478.

[12] Santilli G.,Almarza E,Brendel C,et al.Biochemical correction of X-CGD by a novel chimeric promoter regulating highlevels of transgene expression in myeloid cells[J]. Molecular Therapy,2011,19(1):122-132.

[13] Jeannette Koschmann, Fabian Machens, Marlies Becker,et al. Integration of Bioinformatics and Synthetic Promoters Leads to the Discovery of Novel Elicitor-Responsive cis-Regulatory Sequences in Arabidopsis[J]. Plant Physiology,2012(160):178–191.

[14]陳佳佳,牟巍,周樹峰,等.玉米HVA22基因啟動子的克隆與功能驗證[J].核農(nóng)學報,2014,28(04):560-568.

[15] Wusheng Liu , Mitra Mazarei , Yanhui Peng,et al.Computational discovery of soybean promoter cisregulatory elements for the construction of soybean cyst nematode-inducible synthetic promoters[J].Plant Biotechnology Journal,2014:1–12.

[16]朱雯雯.植物抗逆性的研究進展[J].種子科技, 2017,7(35):

133,135.

[17] Hernandez-Garcia CM,Finer JJ.Identifi cation and validation of promoters and cis-acting regulatory elements[J]. Plant Sci,2014(217):109–119.

[18] Sahoo DK,Sarkar S,Maiti IB,et al.Novel Synthetic Promoters from the Cestrum Yellow Leaf Curling Virus[J].Methods Mol Biol,2016(1482):111-38.

[19] 徐學中,汪婷,萬旺,等.水稻ABA生物合成基因OsNCED3響應(yīng)干旱脅迫[J].作物學報,2018,44(1):24-31.

[20] Yusuke Ito, Koji Katsura, Kyonoshin Maruyama,et al. Functional Analysis of Rice DREB1/CBF-type Transcription Factors Involved in Cold-responsive Gene Expression in Transgenic Rice[J].Plant Cell Physiol,2006,47(1):141-53.

[21] Xiong Liao, Xiao Guo, Qi Wang,et al.Overexpression of MsDREB6.2 results in cytokinin-deficient developmental phenotypes and enhances drought tolerance in transgenic apple plants[J]. Plant J,2017,89(3):510-526.

[22]Ganguly M,Roychoudhury A,Sarkar SN,et al.Inducibility of three salinity/abscisic acidregulated promoters in transgenic rice with gusA reporter gene[J].Plant Cell Rep,2011(30):1617–1625.

[23] Mie Kasuga,Qiang Liu,Setsuko Miura,et al. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor[J].Nature Biotechnology,1999(17):287-291.

[24] Tsai-Hung Hsieh, Jent-Turn Lee, Pei-Tzu Yang,et al.Heterology Expression of the Ar-abidopsis C-Repeat/Dehydration Response Element Binding Factor 1 Gene Confers Elevated Tolerance to Chilling and Oxidative Stresses in Transgenic Tomato[J]. Plant Physiol,2002,129(3):1086–1094.

[25] Bhatnagar-Mathur P,Devi MJ,Reddy DS,et al.Stressinducible expression of AtDREB1A in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) increases transpiration efficiency under water-limiting conditions[J].Plant Cell Rep,2007(26):2071–2082.

[26] Joseph G. Dubouzet, Yoh Sakuma,Yusuke Ito,et al. OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-,high-salt- and cold-responsive gene expression[J].The Plant Journal,2003(33):751–763.

[27] Niemeyer J, Ruhe J, Machens F, Stahl DJ, Hehl R.Inducible expression of p50 from TMV for increased resistance to bacterial crown gall disease in tobacco[J].Plant Mol Biol,2014(84):111–123.

[28] Park SJ,Umemoto T,Saito-Adachi M,et al.Computational promoter modeling identifies the modes of transcriptional regulation in hematopoietic stem cells[J]. PLoS One,2014,9(4):e93853.