， ， ，

(內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014010)

基因表達(dá)的成功完成是由mRNA合成蛋白質(zhì)時(shí)有效準(zhǔn)確的翻譯過(guò)程所決定的，這個(gè)過(guò)程是由核糖體催化的。 mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)的保真度和遺傳信息表達(dá)的準(zhǔn)確性高度依賴于氨?；鵷RNA合成酶(aaRS)對(duì)氨基酸t(yī)RNA的特異性附著。精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)是第一類氨酰tRNA合成酶中較為特殊的一種，且多數(shù)不同來(lái)源的 ArgRS 缺乏保守的 KMSK 序列。ArgRS在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中發(fā)揮著重要功能，它催化tRNA氨酰化過(guò)程的高度專一性，是遺傳信息能夠從mRNA精確地傳遞到蛋白質(zhì)的重要原因。它的3個(gè)作用物是ATP、L-arginineh和tRNA(Arg)，它的3個(gè)產(chǎn)物是AMP、二磷酸和L-Arginyl-tRNA[1]。這種酶屬于連接酶家族，特殊之處在于它在氨酰tRNA和相關(guān)化合物中形成碳氧化合物。它的系統(tǒng)命名是L-精氨酸：tRNA精氨酸連接酶(AMP-形成)，其他廣泛的名字有：精氨酰tRNA合成酶、精氨酰轉(zhuǎn)移核糖核苷酸合成酶，精氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶，精氨酰轉(zhuǎn)移核糖核酸酶，精氨酰tRNA合成酶和精氨酸t(yī)RNA合成酶。它參與精氨酸和脯氨酸的新陳代謝和氨酰生物合成。此外，在它的N末端含有一段叫作精氨酰tRNA合成酶N終止區(qū)域或者額外區(qū)1(ADD-1)的保守區(qū)域，這段區(qū)域大約含140個(gè)氨基酸殘基，而且有研究表明它參與tRNA的識(shí)別。一般認(rèn)為氨酰tRNA合成酶催化反應(yīng)按兩步反應(yīng)進(jìn)行[2]:

1) 氨基酸+ATP→ AMP-氨基酸+PPi

2) AMP-氨基酸+tRNA→氨基酞-Trna+AMP

精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)的特殊之處是：它所催化的氨基?；磻?yīng)是由tRNA的參與一步進(jìn)行的。ArgRS 對(duì) L-Arg 的識(shí)別結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是由法國(guó) Cavarelli 等以酵母ArgRS 與 L-Arg 形成的共晶所闡明的[3]。

1 不同生物體的精氨酰tRNA合成酶

1.1 微生物精氨酰tRNA合成酶

以大腸桿菌為例，大腸桿菌精氨酰tRNA合成酶是第一類氨酰tRNA合成酶，是一種由577個(gè)氨基酸殘基組成、分子量為64.8 KD的單鏈酶，在大腸桿菌氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)中ArgRS與谷氨酰胺酰tRNA合成酶和谷氨酰tRNA合成酶具有獨(dú)特性質(zhì)，即都需要相應(yīng)的tRNA才能進(jìn)行它所催化的第一步氨基酸活化反應(yīng)；在它的一級(jí)結(jié)構(gòu)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)KMSKS這個(gè)第一類aaRS的特征序列。目前對(duì)其研究較多的還是其結(jié)構(gòu)和序列。針對(duì)其在大腸桿菌中的含量少的限制因素，黃意巍等[5]在ri-ani G.等克隆的高表達(dá)基因的基礎(chǔ)上優(yōu)化了表達(dá)條件，進(jìn)一步使該基因表達(dá)提高，提高了550倍，為以后的研究打下基礎(chǔ)。伍金富等[4]也通過(guò)對(duì)大腸桿菌精氨酰tRNA合成酶基因定點(diǎn)突變重組，重組過(guò)程中ArgRS第二位氨基酸殘基由天冬酰胺變?yōu)樘於彼幔a(chǎn)生了變種酶，利用該酶在體內(nèi)積累的時(shí)間相對(duì)較短的特性，降低了其被宿主蛋白水解酶的水解，進(jìn)而減少對(duì)宿主菌的毒性作用，達(dá)到利于分離、純化變種酶的目的，證實(shí)了進(jìn)一步研究ArgRS的結(jié)構(gòu)和功能的可用ArgRS 2 ND代替ArgRS。大腸桿菌的三級(jí)結(jié)構(gòu)表明，其精氨酸結(jié)合位點(diǎn)對(duì)精氨酸的類似物刀豆酸有較好的結(jié)合能力[6]。

1.2 植物精氨酰tRNA合成酶

目前酵母和大腸桿菌的精氨酸系統(tǒng)的研究已經(jīng)完成。 然而，高等真核生物的酶的信息是有限的，并且植物氨?；鵷RNA合成酶在這方面已經(jīng)很大程度地被忽略。在植物中，蛋白質(zhì)合成發(fā)生在3個(gè)不同細(xì)胞間隔：細(xì)胞質(zhì)，線粒體和葉綠體。所有氨酰-tRNA合成酶的編碼都在核基因組中，并且在擬南芥中已經(jīng)顯示有雙重靶向發(fā)生[7]。就植物精氨酰tRNA合成酶而言，苔蘚、小立碗蘚，具有單一的精氨酰tRNA合成酶基因，其產(chǎn)物包括85個(gè)氨基酸的前導(dǎo)物。在植物中，精氨酰-tRNA合成酶和脯氨酰-tRNA合成酶是僅有的兩種特殊的酶，他們的細(xì)胞器靶向性是由密切相關(guān)的胞質(zhì)酶通過(guò)推定的基因復(fù)制過(guò)程，然后獲取信號(hào)結(jié)構(gòu)[8]。因此，在催化過(guò)程中，單一的精氨酰-tRNA合成酶不僅必須識(shí)別核編碼的同源tRNA，而且還必須認(rèn)識(shí)到原核生物體編碼的tRNA，并且在一些植物中必須識(shí)別不同的線粒體編碼的tRNAArg異構(gòu)體。目前，在植物中，除了其與對(duì)應(yīng)tRNA的個(gè)性元件互相作用的研究外，關(guān)于植物氨酰tRNA合成酶的酶學(xué)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)知識(shí)仍然匱乏。

1.3 動(dòng)物精氨酰tRNA合成酶

作為AARS之一的精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)由大鼠中的Rars基因編碼。研究表明，在大鼠的動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型中可以觀察到ArgRS表達(dá)水平的升高[9]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有兩種形式的胞質(zhì)精氨酰-tRNA 合成酶 ArgRS，一種與氨基酰-tRNA 合成酶(aaRS)復(fù)合物的形成有關(guān)，另外一種是游離形式的 ArgRS ，命名為 ΔNArgRS，參與復(fù)合物形成的 ArgRS 命名為 cArgRS，且在其 N 端有 72 個(gè)氨基酸的延伸肽段是多余的, 且N-端 72 個(gè)氨基酸殘基對(duì)酶的催化活性沒(méi)有貢獻(xiàn)。研究表明，復(fù)合物對(duì)于細(xì)胞的存活和分化不是必需的[9]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制精氨酰-tRNA合成酶基因的表達(dá)也可增加動(dòng)物對(duì)缺氧缺血海景的耐受[10]。

2 精氨酰tRNA合成酶基因表達(dá)的遺傳調(diào)控研究

2.1 啟動(dòng)子特異性

精氨酰tRNA合成酶基因的調(diào)控是從啟動(dòng)子開始的。啟動(dòng)子是RNApol和基本轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域，他們共同組裝成轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物，其中一些基因家族成員的表達(dá)是器官特異性的，有一些缺乏特異性[11]。因?yàn)榛虻奶禺愋赞D(zhuǎn)錄是由酶與啟動(dòng)子是否能有效地形成二元復(fù)合物所決定，故轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中的首要問(wèn)題是RNA聚合酶如何有效地找到啟動(dòng)子并與之結(jié)合。實(shí)驗(yàn)證明， 許多RNA聚合酶與啟動(dòng)子相結(jié)合的速率比布朗運(yùn)動(dòng)的隨機(jī)碰撞高。針對(duì)這些基因的啟動(dòng)子的大量研究對(duì)確定特異性表達(dá)式的位置有重要意義，但實(shí)際情況較為復(fù)雜[12]。

2.2 轉(zhuǎn)錄水平

轉(zhuǎn)錄是精氨酰tRNA合成酶基因表達(dá)的必要條件。研究表明，抑制氨?；?tRNA合成酶基因可導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生變化，如ATP消耗減少等，主要原因是抑制氨酰基-tRNA基因轉(zhuǎn)錄可減少能量消耗。作為氨酰基-tRNA合成酶之一的精氨酰tRNA合成酶基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制也可改變細(xì)胞的生物學(xué)行為。臨床研究顯示，基因轉(zhuǎn)錄受到抑制后導(dǎo)致能量消耗急劇下降，這是在長(zhǎng)期缺氧環(huán)境下存活的的生物，如冬眠動(dòng)物生存的一種行之有效的內(nèi)在機(jī)制。從轉(zhuǎn)錄水平來(lái)看，減少氧耗降低新陳代謝對(duì)生物適應(yīng)低氧環(huán)境有重要意義。此外，有研究表明，缺血預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)作用與缺血預(yù)處理后參與氨基酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的氨基酰-tRNA合成酶和基因轉(zhuǎn)錄減少有關(guān)，繼而證明氨基酰-tRNA合成酶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制和功能降低是保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞的一種有效機(jī)制[13]。

2.3 翻譯水平

在哺乳動(dòng)物中含有2種形式的精氨酰-tRNA合成酶，研究表明，這2種形式的酶是由同一條mRNA通過(guò)不同的翻譯起始得到的。真核生物普遍存在的現(xiàn)象，是由同一條 mRNA 選擇不同的翻譯起始位點(diǎn)，翻譯得到2條或2條以上翻譯產(chǎn)物[14]。對(duì)于精氨酰-tRNA合成酶，研究結(jié)果證實(shí)，就是通過(guò)“漏篩”和“再起始”2種機(jī)制翻譯得到的。精氨酰-tRNA合成酶除了在蛋白質(zhì)合成中的重要作用外，還是三向細(xì)胞連接處的關(guān)鍵中間體，一方面是針對(duì)蛋白質(zhì)生物合成，同時(shí)它也是泛素介導(dǎo)的通過(guò)N端規(guī)則途徑的蛋白質(zhì)降解和蛋白質(zhì)的翻譯后精氨化作用所必需的，故對(duì)其的研究是至關(guān)重要的[15]。

tRNAArg是 ArgRS 的作用底物， tRNAArg與精氨酰tRNA合成酶之間的準(zhǔn)確識(shí)別是由個(gè)性元件決定的。在細(xì)菌tRNA中，主要的精氨酸決定簇限于兩三個(gè)核苷酸不同區(qū)域。反密碼子中的C 35和GU 36以及D環(huán)中高度保守的A 20。雖然在D環(huán)沒(méi)有主要的精氨酸決定簇，但tRNAIGG的識(shí)別在某種程度上依賴于位置20的核苷酸。

3 精氨酰tRNA合成酶基因在其他方面的研究

精氨酰tRNA合成酶作為參與蛋白質(zhì)合成的重要酶，對(duì)其研究也是熱點(diǎn)。對(duì)其反應(yīng)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)分析表明，ArgRS的特殊動(dòng)力學(xué)特征是tRNAArg對(duì)ATP-PPi交換反應(yīng)的要求。由于類似于tRNA的要求，以前已將Arg RS與谷氨酰-tRNA合成酶一起分類為亞類Ic。然而，如果強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)性質(zhì)，則將其與用于中性氨基酸的氨酰-tRNA合成酶一起置于亞類Ia中。許多關(guān)于Arg RS的動(dòng)力學(xué)研究已經(jīng)使用雙底物動(dòng)力學(xué)來(lái)解決3種底物的結(jié)合順序，特別是是否需要 tRNA以形成精氨酸或ATP的正確結(jié)合位點(diǎn)。此外，對(duì)其研究也表明在沒(méi)有PPi和AMP的情況下，速率限制不會(huì)發(fā)生在一個(gè)單一步驟中，而是分為4個(gè)步驟[16]。自然條件下，在低濃度的PPi和AMP存在下，速率限制發(fā)生在總反應(yīng)的后期步驟。

精氨酸系統(tǒng)也是種間差異明顯的一個(gè)例子，tRNA的種間氨基?；难芯恳呀?jīng)得出結(jié)論，真核氨酰-tRNA合成酶常常能夠利用大腸桿菌tRNA作為底物，這對(duì)于后續(xù)精氨酰tRNA合成酶的研究有重要意義。

實(shí)際應(yīng)用方面，刀豆氨酸與精氨酸的分子結(jié)構(gòu)僅僅是一個(gè)氧原子的差別，故它代替精氨酸作為 ArgRS 的一個(gè)底物，被催化連接到 tRNAArg上從而參與蛋白質(zhì)合成過(guò)程 。刀豆氨酸可摻入新合成的蛋白質(zhì)里，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變和功能喪失，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[16]。在關(guān)于刀豆氨酸對(duì)大腸桿菌、酵母和人胞質(zhì)精氨酰-tRNA合成酶的抑制動(dòng)力學(xué)中，發(fā)現(xiàn)刀豆氨酸對(duì)細(xì)菌精氨酰-tRNA合成酶的抑制作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對(duì)人的抑制作用[1]，可被進(jìn)一步作為抗菌藥物開發(fā)。

4 展 望

精氨酰-tRNA 合成酶(ArgRS)催化生成蛋白質(zhì)在核糖體上合成蛋白質(zhì)的原料，即精氨基酰-tRNA，來(lái)精確地識(shí)別對(duì)應(yīng)的氨基酸和 tRNA，確保了蛋白質(zhì)生物合成的高度忠實(shí)性[17]，在蛋白質(zhì)合成中起著至關(guān)重要的作用。作為三向細(xì)胞連接處的關(guān)鍵中間體，精氨基酰-tRNA 合成酶不僅針對(duì)蛋白質(zhì)生物合成，也在泛素介導(dǎo)的通過(guò)N端規(guī)則途徑的蛋白質(zhì)降解和蛋白質(zhì)的翻譯后精氨化作用起著必要作用，是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成不可或缺的酶。目前對(duì)其研究多在細(xì)菌等原核生物中，古細(xì)菌中對(duì)氨基酰-tRNA 合成酶與核糖體的相互作用也做了初步分析，在動(dòng)物方面也有部分研究，但在植物中鮮有報(bào)道。以前的研究提出了tRNA氨基?；透叻肿恿考?xì)胞復(fù)合物如細(xì)胞骨架或核糖體之間的聯(lián)系。然而，這些相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和潛在的機(jī)制尚不清楚。因此，從該基因的基礎(chǔ)功能入手，探索其在植物體中發(fā)揮的重要功能及內(nèi)在機(jī)理，對(duì)今后的研究有重要意義。

參考文獻(xiàn):

[1]Zheng,Y.G.,Wei,H.,Ling,C.,Xu,M.G.,et al.Two forms of human cytoplasmic arginyl-tRNA synthetase produced from two translation initiations by a single mRNA[J].Biochemistry,2006,45:1 338-1 344.

[2]Yang,F.,Xia,X.,Lei,H.Y.,et al.Hemin binds to human cytoplasmic arginyl-tRNA synthetase and inhibits its catalytic activity[J].J.Biol.Chem.,2010,285:39 437-39 446.

[3]李娟.精氨酰-tRNA合成酶和tRNA～(Arg)的相互作用[D].中國(guó)科學(xué)院研究生院(上海生命科學(xué)研究院),2、005.

[4]伍金富,夏憲,王恩多,等.大腸桿菌精氨酰tRNA合成酶基因的誘導(dǎo)高表達(dá)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),1998,30(3):239-240.

[5]黃意巍,王恩多,王應(yīng)睞.大腸桿菌精氨酞-RNA合成酶變種ArgRS 381 KA的基本性質(zhì)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),1995,27(6):11.

[6]McClain WH,Foss K,Jenkins RA & Schneide.Nucleotides that determine Escherichia coli tRNA(Arg) and tRNA(Lys) acceptor identities revealed by analyses of mutant opal and amber suppressor tRNAs[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:9 260-9 264.

[7]Carolin A.Aldinger,Anne-Katrin Leisinger and Gabor L.Igloi.The influence of identity elements on the aminoacylation of tRNAArg by plant and Escherichia coli arginyl-tRNA synthetases[N].FEBS Journal,2012,279:3 622-3 638.

[8]McClain WH,Foss K,Jenkins RA & Schneider J.Nucleotides that determine Escherichia coli tRNA(Arg) and tRNA(Lys) acceptor identities revealed by analyses of mutant opal and amber suppressor tRNAs[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:9 260-9 264.

[9]Nakanishi K,Ogiso Y,Nakama T,Fukai S & NurekiO Structural basis for anticodon recognition bymethionyl-tRNA synthetase.Nat Struct Mol Biol,2005,12:931-932.

(轉(zhuǎn)下頁(yè))

(接上頁(yè))

[10]沈寅,范云智,范宇蔥,等.精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達(dá)及機(jī)制研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志,2016,24(6):54-58.

[11]黃冰艷,高偉,苗利娟,等.谷氨酰胺合成酶基因研究進(jìn)展及其在植物氮代謝調(diào)控中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(23):53-57.

[12]沈寅,范云智,范宇蔥,等.精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達(dá)及機(jī)制研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志,2016,24(6):65-57.

[13]王恩多,鄭勇剛,李勇,等.頭孢菌素?；富蛟诖竽c桿菌中的表達(dá)規(guī)律[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),2002(4):526-531.

[14]Yao,Y.N.,Zhang,Q.S.,Yan,X.Z.,et al.FEBS Lett.,2003,547:197-200.

[15]R.Kalervo Airas. Analysis of the kinetic mechanism of arginyl-tRNA synthetase[J].Biochiica et Biophysica Acta,2006,1 764:307-319.

[16]Bence,A.K.,Crooks,P.A.J.Enzyme. Inhib.Med.Chem.,2003,18:383-394.

[17]Negrutskii,B.S.and Deutscher,M.P.Channeling of aminoacyl-tRNA for protein synthesis in vivo.Proc.Natl Acad.Sci.USA,1991,88:4 991-4 995.