陳祥和 楊康 趙仁清 孫開宏 蔡先鋒

1. 揚州大學體育學院，江蘇 揚州 225127 2. 揚州職業(yè)大學體育學院，江蘇 揚州 225127 3. 淮陰工學院體育教學部，江蘇 淮安 223001

G蛋白偶聯受體48(G protein coupled receptor 48, GPR48/LGR4)作為膜上的七次跨膜受體，其LRR結構域通過與配體R-spondin1(Rspo1)FU-CBD位點或Norrin作用發(fā)揮多級生物學效能[1]。當敲除GPR48后，腎臟形態(tài)、生殖細胞(精子)形成、能量代謝、紅細胞生成等發(fā)生紊亂。且GPR48基因敲除后的低表達，使得成骨細胞(osteoblast, OB)分化、成熟及其骨形成能力被抑制而破骨細胞(osteoclast, OC)分化、融核及骨吸收能力顯著升高，骨生長發(fā)育被顯著抑制，導致骨質疏松及骨折發(fā)生[2-3]。Wnt、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/ATF4、骨保護素(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)/核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor κB, RANK)等是運動訓練影響骨組織代謝的關鍵信號途徑。并且，研究證實GPR48與以上信號途徑的級聯反應，調控多種生物學效能[4]。運動可顯著改善骨代謝，8周下坡跑上調GPR48表達后抑制2型糖尿病(type 2 diabetic melitus, T2DM)小鼠OC分化，改善骨代謝[5]。綜上，既然運動通過調控GPR48或相關信號途徑可改善骨代謝，且GPR48與Wnt、cAMP/PKA/ATF4和OPG/RANKL/RANK等信號途徑存在密切調控關系。那么，運動改善骨代謝是否通過GPR48及其介導的下游信號途徑進行調控呢？基于此問題，本研究將對GPR48在運動調控骨代謝中的作用及分子機制進行綜述，為運動調控骨代謝的分子機制信號網絡做一重要補充。

1 GPR48生物學作用

G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors, GPRs或LGRs)是具有多種功能的膜上受體，可識別來自神經、激素和旁分泌器官等特異性配體，通過配體(Rspo1、Norrin等)-受體(即富亮氨酸的大量細胞外N端結構域)之間的相互調控來作用于胞內G蛋白(α亞基)引起相應的級聯反應，調控細胞生長、增殖和分化。GPCRs擴展家族包含三類糖蛋白受體家族：①LGR1、LGR2和LGR3；②LGR7和LGR9；③LGR4(GPR48)、LGR5和LGR6。其中，GPR48在骨骼、生殖、泌尿等組織器官大量表達[6]。從最初發(fā)現GPR48作為一膜上孤兒受體，到后來證實其配體Rspo1、Rspo3和Norrin，Rspo1、Rspo3和Norrin等可通過靜電和疏水之間的相互作用，使其分子的平坦β折疊架構GPR48表面凹面(即一扭曲的馬蹄狀結構)相結合[7]，通過G蛋白介導來調控多條信號途徑，從而在生殖系統(tǒng)發(fā)育及生殖細胞形成、骨骼肌能量代謝、癌細胞增殖、先天免疫應答、阿爾茨海默病等多生物學過程中發(fā)揮不可或缺的調控作用[8]，并且，GPR48在骨生長發(fā)育、骨形成和骨吸收代謝過程中亦扮演重要角色。GPR48基因缺失導致小鼠骨形成降低且骨吸收顯著增強，骨生長發(fā)育被顯著抑制[2]。且人體研究發(fā)現，該基因發(fā)生突變使得機體股骨頸和第五腰椎骨量下降且伴有常發(fā)性的骨質疏松甚至骨折等癥狀[3]。

適宜運動作為影響骨代謝的重要干預手段，其通過促進骨形成并抑制骨吸收來改善骨代謝的作用已被很多研究所證實并廣為認可。研究發(fā)現，Wnt、cAMP/PKA/環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)、轉換生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)/骨形成蛋白(bone morphogenic protein, BMPs)、OPG/RANKL/RANK等關鍵信號途徑是介導骨形成或骨吸收代謝的重要調控媒介[9]。GPR48與以上調控骨代謝關鍵途徑之間的相互協(xié)同或拮抗是多種生理學作用發(fā)揮的關鍵分子調控機制。并且，骨作為力學刺激敏感組織，運動通過以上信號途徑或關鍵分子的調控作用，可顯著改善骨新陳代謝[10]。研究證實，運動亦可顯著上調骨中GPR48表達進而改善骨代謝[11]。近年來，隨著細胞分子信號調控理論的逐漸豐富與完善，以往的初淺認識已不能充分揭示運動影響骨代謝的分子調控機制。GPR48與介導骨代謝關鍵信號途徑相互之間的信號偶聯機制可能是探究運動改善骨代謝分子機制的新思路或新靶向。

2 GPR48在運動調控骨代謝中的作用及機制

2.1 GPR48在運動調控骨形成代謝中的作用機制

2.1.1Wnt信號通路：Wnt信號通路分為β-catenin介導的經典通路和Ca2+、平面細胞極性(planar cell polarity，PCP)分別介導的非經典通路。經典Wnt信號途徑通過非磷酸化后的β-catenin入核并與T細胞因子(T-cell factor，TCF)/淋巴增強結合因子(lymph enhanced binding factor，Lef)形成一轉錄復合基團來調節(jié)靶基因(如細胞周期蛋白(cyclinD1)、軸抑制蛋白2(axin inhibition protein 2, Axin2)、C-myc和過氧化物酶增殖激活受體δ(peroxisome proliferator activates the receptor δ，PPARδ)等)表達，促進骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向OB分化[12]。GPR48可調控骨形成代謝，但有關其調控Wnt/β-catenin信號途徑從而發(fā)揮相應生物學作用的研究目前集中在腫瘤遷移、細胞增殖等方面。近來有研究發(fā)現，GPR48激活Wnt/β-catenin信號途徑后, β-catenin轉位入核并調控Runx2等靶基因，促進從關節(jié)炎患者脛骨平臺下軟骨板中獲得的OB分化及其骨形成能力[13]。適宜運動(尤指可對骨產生直接作用力的運動方式，如下坡跑、跳躍運動等)不僅可上調骨中GPR48表達[11]，亦可通過激活Wnt/β-catenin來上調靶基因c-Myc、Cyclin D1等表達，促進BMSCs向OB分化并抑制向脂肪細胞和軟骨細胞分化，提高骨形成能力增和骨密度(bone mineral density, BMD)[14]。但有關GPR48通過Wnt/β-catenin途徑介導運動促進OB分化和骨形成的相關研究較少。Shi等[15]在研究力學刺激促進MC3T3-E1向OB分化及其骨形成能力時，發(fā)現GPR48與其配體R-Spondin1結合后發(fā)生磷酸化，進而激活Wnt/β-catenin信號途徑。GPR48亦可作用于其另一配體Norrin的N端結構域，促進G蛋白α亞基分離并活化，使得Wnt并下游β-catenin活化。表明，力學刺激促進R-Spondin1和Norrin與GPR48結合并上調其表達，可激活Wnt/β-catenin途徑，促進OB分化及骨形成。體內研究中，OB作為力學刺激敏感細胞，運動訓練促進骨形成的機制與其對骨產生的力學刺激上調GPR48及Wnt/β-catenin途徑密切相關。非經典Wnt信號通路(Wnt/Ca2+和Wnt/PCP通路)分別依靠Ca2+和Dishevelled蛋白(dishevelled protein, Dvl)在背腹側發(fā)育、細胞遷移等以及骨形成代謝、運動性和分裂等過程中均發(fā)揮重要調控作用[16]。骨代謝研究中，非經典Wnt途徑可通過鈣調蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinaseⅡ, CaMKⅡ)- 轉化生長因子激酶1(transforming growth factor kinase 1, TAK1)-TAK1結合蛋白2(TAK1 binding protein 2, TAB2) -Nemo樣蛋白激酶(nemo-like kinase, NLK)轉錄抑制PPARγ蛋白磷酸化，上調Runx2表達，促進BMSCs向OB分化、成熟和骨形成。亦可通過下調RANKL表達，使得RANK失活，抑制OC分化產生及骨吸收代謝[17]。作為GPR48配體的R-Spondins1，通過其Furin結構域與GPR48的C端LRR結構域結合并將其激活，調控下游Wnt/PCP途徑在胚胎形成、干細胞增殖等生物學過程中的作用發(fā)揮[18]。有研究證實，GPR48通過激活Wnt/PCP而不是Wnt/Ca2+信號途徑，可顯著促進C57BL/6小鼠BMSCs向OB分化并提高其骨形成能力[13]。在研究Wnt非經典途徑在運動訓練促進生長期小鼠骨生長發(fā)育時，發(fā)現在此過程中Wnt/PCP途徑的Wnt5a及其下游Ror2、卷曲蛋白受體4(frizzled receptor 4, Frz4)和低密度脂蛋白受體5(low density lipoprotein receptor 5, LRP5)等靶基因表達顯著上調，而Wnt/Ca2+途徑中相關因子表達變化不顯著[19]。以上研究表明，運動促進骨形成的分子機制與Wnt/PCP途徑激活密切相關，而Wnt/Ca2+途徑在此過程中調控作用不顯著。GPR48通過激活Wnt信號途徑(β-catenin和PCP途徑)及下游靶基因c-Myc、LRP5等表達，介導運動訓練促進OB分化、成熟及骨形成代謝的生物學過程。

2.1.2cAMP、CREB和ATF4：cAMP作為胞內重要第二信使，在Ca2+和Mg2+作用下，胞內ATP轉化為cAMP，進而激活下游PKA，并在CREBSer133位點將其磷酸化，活化的CREB通過激活ATF4并進而作用于下游Runx2、Col1等靶基因表達，促進BMSCs向OB分化及骨形成[10]。骨形成調控過程中，GPR48與cAMP/CREB/ATF4途徑存在協(xié)同作用，且該途徑是調控骨生長發(fā)育的重要信號轉導通路。Luo等[2]研究證實，敲除GPR48后，骨中cAMP表達下調，PKA和CREB去磷酸化，使得ATF4蛋白及其靶基因Cyclin D1表達下調，OB分化及骨形成能力降低，骨鈣蛋白(osteocalcin, OCN)、Ⅰ型膠原蛋白等分泌減少，骨量下降，小鼠骨生長發(fā)育被抑制。體外研究亦發(fā)現，cAMP在機械力學刺激促進OB分化和骨形成能力過程中具有重要介導作用[20]。力學刺激通過上調cAMP表達，使得CREB在Ser133位點上磷酸化，進而激活ATF4，促進MC3T3-E1向OB分化[21]。體內研究中，9周跑臺訓練激活C57BL/6小鼠骨中cAMP/CREB/ATF4途徑及其靶基因Runx2、骨鈣素、骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)等表達，促進BMSCs向OB分化并提高其骨形成能力，改善骨組織形態(tài)結構[22]。分析以上研究，發(fā)現cAMP/CREB/ATF4途徑激活是運動促進OB分化產生及其骨形成能力，進而改善骨代謝的關鍵信號通路。體育科學領域內，有關GPR48激活cAMP/CREB/ATF4途徑介導運動促進骨形成代謝的相關研究尚待揭示。但鑒于GPR48與該信號途徑之間的密切調控關系，且運動可顯著上調GPR48和cAMP/CREB/ATF4途徑中相關因子表達。那么，運動改善骨形成的分子機制與激活GPR48及下游cAMP/CREB/ATF4途徑及下游靶基因(Runx2、OCN、BSP等)表達，促進OB分化、成熟及骨形成密切相關。

2.1.3TGF-β和BMPs：TGF-β 和BMPs具有高度同源性，均通過R-Smads(Smad2/3和Smad1/5/8，而Smad4均可與以上兩基團結合)磷酸化后形成信號傳導基團并轉位入核，作用于Smad作用蛋白1(Smad interacting protein 1, SIP1)、TG相互作用因子(TG-interacting factor, TGIF)和p300/CBP相關因子(p300/CBP-associated factor, P/CAF)等轉錄或翻譯，調節(jié)細胞增殖、分化、遷移及凋亡[23]。TGF-β在OB中以自分泌方式調節(jié)其增殖、分化及代謝。TGF-β/Smads信號途徑活化后顯著上調Smad7、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)等靶基因表達，促進人間充質干細胞(human mesenchymal stem cells, hMSC)向OB分化產生和成熟[24]。并且，TGF-β途徑激活促進OB分化產生的分子機制還與Smad2/3磷酸化后上調激活素樣激酶5(activin-like kinases5, ALK5)和PKA表達，促進非磷酸化β-catenin轉移入核來調控相關靶基因有關。GPR48與TGF-β/Smad途徑具有密切調控關系。在研究骨骼肌形成過程中GPR48與TGF-β調控關系時，發(fā)現利用Follistatin(Fst)抑制GPR48后，其可通過其配體R-Spondin1下調TGF-β表達[25]。并且，GPR48表達上調可激活TGF-β，促進下游Smad2/3磷酸化及靶基因表達，來調控人類紅細胞終末分化[26]。但有研究卻發(fā)現，當在心肌細胞上特異性敲除GPR48后，TGF-β/Smads通路中相關因子變化并不顯著[27]。以上研究結論差異，表明在心肌細胞中GPR48能否激活TGF-β/Smads通路尚存在一定爭議，可能與該通路在GPR48介導的不同生物學過程中所起作用和不同組織器官中的表達存在較大差異有關。雖然GPR48通過TGF-β/Smads途徑可發(fā)揮多種生物學效應，并且二者均是調控骨形成的重要分子或途徑。但有關GPR48激活TGF-β/Smads進而調控骨形成的相關研究尚待補充。運動作為促進骨形成代謝的重要干預手段，其生物學機制與TGF-β/Smad途徑被激活后，促進OB分化有緊密聯系[28]。那么，GPR48能否通過TGF-β/Smads通路進而在運動促進骨形成中發(fā)揮調控作用呢？鑒于GPR48和TGF-β/Smads途徑在運動促骨形成中的作用及GPR48與TGF-β/Smads途徑之間的調控關系[5]。運動促進骨形成的分子機制可能與GPR48表達上調后激活TGF-β/Smads信號通路，進而促進OB分化、成熟及骨形成能力有關。BMPs與TGF-β具有高度同源性，均通過Smads途徑發(fā)揮作用。Neogenin作為膜上蛋白，在BMP誘導的經典通路即磷酸化Smad1/5/8過程中，通過與脂質筏相結合從而發(fā)揮其介導作用[29]。BMPs信號通路被抑制后，ALK2表達下調導致Smad1/5/8磷酸化異常且不能形成異源三聚體，導致嚴重的骨生長發(fā)育異常[30]。Smad1/5/8被修飾后，其可介導BMPs調控的骨形成并且BMPs信號通路的作用強度可被其膜上受體通過Smad1的C端磷酸化進行調控[31]。BMPs(如BMP-2/3/7等)在調控OB分化和骨形成中均具有重要作用。BMP-2磷酸化后，Smad1/5/8通過與Smad4結合形成磷酸化復合基團，其入核后上調骨鈣素等表達，并且短時間BMP-2表達上調對調控OB分化和骨形成是充足且必不可少的，當敲除BMP-2后對骨施加其他骨形成刺激也不能彌補其缺失對小鼠骨形成產生的影響[32]。作為BMPs亞型的BMP-3和BMP-7分別在成骨細胞前體細胞向成熟OB分化和OB骨形成能力發(fā)揮上具有重要調控作用。研究證實，GPR48與BMPs/Smads途徑存在密切級聯調控關系，其表達上調可顯著激活BMPs/Smads途徑[33]。這與Norrin作為GPR48配體，可上調GPR48表達從而作用于BMP-2的Ser122和Ser132位點并使其磷酸化有關。運動作為促進OB分化和改善骨形成代謝的重要手段，GPR48表達上調不僅可激活BMPs/Smad途徑，并且它們分別在運動促進骨形成代謝中均扮演重要調控角色[34]。那么，運動促進骨形成代謝的分子機制可能與GPR48表達上調并作用于BMPs/Smads信號途徑，進而促進OB分化、成熟及骨形成能力密切相關。

2.2 GPR48在運動調控骨吸收代謝中的作用機制

2.2.1OPG/RANKL/RANK：OPG/RANKL/RANK是調控OC分化和骨吸收的重要分子軸。OC前體細胞在分化過程中巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)必不可少，同時亦需要RANKL來激活RANK，從而將級聯信號信息傳遞給連接蛋白-腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor related factor, TRAF) (尤其是TRAF6)，誘導轉錄因子：C-fos、活化T細胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1, NFATc1)/NFATc2和核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)成員p50及p52等表達。RANK亦可通過激活OC前體細胞中的C-fos和NFATc1/NFATc2來促進OC分化、成熟及骨吸收代謝[35]。GPR48不僅在骨形成中具有重要作用，在OC分化和骨吸收中亦扮演關鍵角色。最近研究發(fā)現，GPR48是RANKL的另一膜上受體(除RANK)，其與RANK競爭性的同RANKL結合，激活Gαq 和糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)信號通路，抑制NFATc1表達，OC分化及骨吸收功能顯著下降[36]。表明，GPR48與OPG/RANKL/RANK分子軸之間的級聯反應是調控OC分化和骨吸收的重要媒介。運動訓練抑制OC分化和骨吸收，但不同運動方式和運動負荷對OC分化和骨吸收造成的影響存在較大差異。與向心運動的上坡跑相比，作為離心運動的下坡跑可顯著抑制去卵巢小鼠骨中OPG/RANKL/RANK分子軸激活，從而抑制OC分化及骨吸收代謝[37]。當運動負荷不同時，骨中OPG、RANKL mRNA表達量及OPG/RANKL比值亦不同，且當負荷較大時OPGmRNA表達下調，而RANKL的mRNA表達和OPG/RANKL比值顯著上升，骨吸收增強[38]。GPR48作為RANK的另一配體，有關運動通過GPR48和OPG/RANKL/RANK分子軸進而調控骨吸收的相關研究尚待揭示。但研究發(fā)現，8周下坡跑可通過上調GPR48表達，進而同RANKL競爭性與RANK結合，下調NFATc2和組織蛋白酶K(cathepsin K, CTSK)表達，抑制OC分化、融核，改善T2DM小鼠骨代謝[5]。鑒于GPR48通過影響OPG/RANKL/RANK分子軸在調控骨吸收及在運動改善骨代謝中的重要生物學作用，運動通過激活GPR48，從而與RANKL競爭性同RANK結合，抑制RANK活性，下調靶基因表達，抑制OC分化產生及其骨吸收能力。

2.2.2其他：OPG/RANKL/RANK分子軸借助TRAF6，可調節(jié)下游CN/NFAT和NF-κB信號途徑，從而介導OC分化和骨吸收代謝。CN/NFAT作為調控骨代謝的重要信號通路，該途徑被激活后，CN表達上調促進胞漿中NFATc1磷酸化并入核，激活C-fos、激活蛋白1(activator protein 1, AP-1)等靶基因表達，使得OC數量增加且骨吸收能力增強，骨組織形態(tài)結構退化[39]。而抑制NF-κB信號途徑可下調其靶基因CTSK、C-fos等表達，抑制OC分化及骨吸收[40]。研究發(fā)現，OC上特異性敲除GPR48可激活以上兩條信號途徑，上調CTSK、C-fos等靶基因表達，促進OC分化和骨吸收[41]。運動不僅可抑制OPG/RANKL/RANK分子軸，并且亦可通過CN/NFAT和NF-κB信號途徑失活來抑制OC分化產生及其骨吸收能力，進而改善骨代謝[42]。運動亦可上調GPR48表達，從而與RANKL競爭性同RANK結合，下調NFATc2和CTSK表達，抑制OC分化及骨吸收。CN/NFAT和NF-κB不僅可作為OPG/RANKL/RANK分子軸下游兩關鍵途徑，且NFATc2和CTSK亦是以上兩途徑的關鍵靶基因[43]。那么，運動抑制OC分化和骨吸收進而改善骨代謝的分子生物學機制，與GPR48通過OPG/RANKL/RANK分子軸，進而作用于下游CN/NFAT和NF-κB信號途徑及其靶基因表達密切相關。除以上信號途徑外，PI3K/Akt、JNK/AP-1、p38MAPK、ERK、LPS、CD40等亦可將TRAF6作為媒介，與OPG/RANKL/RANK分子軸相連，從而在OC分化和骨吸收代謝調控上發(fā)揮重要作用[44]。既然，運動抑制OC分化及其骨吸收能力進而改善骨吸收代謝的分子機制是一復雜、相互耦聯的網絡。那么，GPR48能否通過調控以上信號途徑或者GPR48能否通過調控以上信號途徑或關鍵分子從而在運動抑制OC分化和骨吸收代謝中發(fā)揮重要調控作用呢？目前尚待相關研究予以揭示。

3 展望

自2009年首次發(fā)現以來，GPR48在骨形成和骨吸收代謝中的關鍵調節(jié)作用已廣為認可。本研究拓展了GPR48在調控骨形成和骨吸收代謝上的新分子作用機制。在此基礎上，提出經由cAMP/CREB/ATF4、TGF-β/BMPs、OPG/RANKL/RANK等通路可能介導了骨形成和骨吸收代謝的運動干預機制。雖然現有研究文獻支持此結論，但仍有幾個問題尚需澄清；①介導骨代謝的信號途徑或關鍵調控分子較多，且相互之間是彼此耦聯，非線性、單一的調控網絡，GPR48介導骨代謝的網絡調控途徑尚待予以揭示、完善；②GPR48調節(jié)骨代謝運動適應的具體分子機制(即哪些信號途徑或關鍵分子發(fā)揮作用)以及分子機制調控信號網絡尚不明晰；③骨骼肌、炎癥反應、能量代謝、血管再生等與骨組織運動適應之間的“Crosstalk”是目前研究熱點，而GPR48在以上過程中所扮演的生物學角色及其分子調控機制仍待驗證。明確以上問題，將有助于加深對GPR48的了解，有助于闡明其在運動干預調控骨代謝中的分子作用機制，為完善運動干預調控骨代謝的信號網絡以及骨相關疾病診治提供新的靶點和非藥物干預手段。