穆銀玉 謝服役

環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的RNA，廣泛存在于真核細(xì)胞中。circRNA屬于非編碼RNA，部分非編碼RNA參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控、剪切和修飾等，在生命活動中發(fā)揮重要的作用。近幾年來，研究的熱點主要集中在微小核糖核酸（microRNA, miRNA）及長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA），它們廣泛參與細(xì)胞分化、發(fā)育、衰老和腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生命過程[1-3]。目前circRNA已成為RNA研究領(lǐng)域的新熱點[4-8]，由于其具有特殊的結(jié)構(gòu)，其在腫瘤診斷、治療及預(yù)后中的潛在臨床價值已受到密切關(guān)注[9-14]。

1 circRNA的來源及特征

20世紀(jì)70年代科學(xué)家在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種環(huán)形RNA分子，命名為circRNA[15]。其后，分別在酵母細(xì)胞和人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了circRNA[16,17]。后續(xù)研究證實，circRNA在細(xì)胞中廣泛存在。circRNA與傳統(tǒng)線性RNA不同，其分子結(jié)構(gòu)呈封閉環(huán)狀，不含5′和3′末端，十分穩(wěn)定，不易被核酸外切酶（RNase R）所降解[18]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了大量無尾巴的circRNA，并逐步揭示它們成環(huán)機制和在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要功能[19-21]。circRNA作為一類新型的RNA分子，具有高度的特異性、保守性和穩(wěn)定性。大部分的circRNA是由外顯子序列構(gòu)成，在不同的物種中具有保守性，同時存在組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性。由于circRNA對核酸酶不敏感，因此比線性RNA分子更為穩(wěn)定，易出膜進(jìn)入體液，使得circRNA在作為新型臨床診斷標(biāo)記物的開發(fā)應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢。

2 circRNA的功能

根據(jù)RNA的構(gòu)成，circRNA主要分為3類：外顯子環(huán)化RNA（exonic circRNA, circRNA）、內(nèi)含子環(huán)化RNA（intronic circRNA, ciRNAs）和外顯子-內(nèi)含子環(huán)化RNA（exon-introncircRNA, EIciRNAs）。外顯子環(huán)化RNA是由外顯子轉(zhuǎn)錄的RNA構(gòu)成，是最常見的circRNA。越來越多的研究表明，circRNA幾乎參與整個生物過程，它們在轉(zhuǎn)錄、翻譯及反轉(zhuǎn)錄等過程中都有潛在的調(diào)控作用。

2.1 circRNA作為內(nèi)源性競爭RNA（endogenous competitive RNA, ceRNA）影響miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能 circRNA是一類長度21 nt-25 nt的小非編碼RNA，與mRNA進(jìn)行堿基互補配對，抑制其翻譯，還可引起靶mRNA降解。有些circRNA具有miRNA應(yīng)答元件，能夠結(jié)合（吸附）游離miRNA，從而阻斷miRNA對基因表達(dá)的抑制。如小腦變性相關(guān)蛋白反義轉(zhuǎn)錄物（CDR1as）可作為miR-7海綿，即ciRS-7。ciRS-7可抑制miR-7活性并與miR-7競爭結(jié)合其他RNA，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[22]。此外，田芳等[23]報道，環(huán)狀RNA CircHIPK3等也具有海綿吸附作用，能夠結(jié)合miR-379，調(diào)控IGF1表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。circRNA上面有多個miRNA結(jié)合位點，而且circRNA對miRNA吸附能力比其他的ceRNAs強大，所以也被稱為"超級海綿"。

2.2 circRNA可與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成RNA蛋白復(fù)合體進(jìn)而影響基因的表達(dá)水平 這種復(fù)合體能夠調(diào)控RNA以及RNA結(jié)合蛋白之間的相互作用，從而影響轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)水平[24]。

2.3 circRNA內(nèi)部包含核糖體進(jìn)入位點可翻譯表達(dá)蛋白質(zhì)天然的circRNA不能和核糖體結(jié)合，也不能翻譯蛋白質(zhì)，但具有翻譯的起始密碼子，人工合成的含有核糖進(jìn)入位點（IRES）的circRNA在體外實驗中能夠翻譯蛋白質(zhì)[25]。最新的研究也證實了circRNA在真核細(xì)胞中具有編碼蛋白質(zhì)功能。Legnini等[26]發(fā)現(xiàn)，circ-ZNF609具有一個開放性的閱讀框（open reading frame, ORF），兩端分別含有終止密碼子和起始密碼子，通過多聚核糖體翻譯合成蛋白質(zhì)。另外，Yang等[27]還發(fā)現(xiàn)，N6-甲基腺嘌呤促進(jìn)circRNA翻譯的啟動。

2.4 circRNA參與調(diào)控選擇性拼接與基因轉(zhuǎn)錄 ciRNAs和EIciRNAs主要位于細(xì)胞核內(nèi)，目前已被證實能夠調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄。Qu等[28]報道，EIciRNAs中的circPAIP2和circEIF3J能夠與U1snRNP結(jié)合形成復(fù)合物，此復(fù)合物與RNA聚合酶II相互作用，促進(jìn)親本基因的轉(zhuǎn)錄。在前體RNA剪接過程中，反向剪接產(chǎn)生的circRNA能夠競爭性調(diào)控可變剪接。Conn等[29]研究發(fā)現(xiàn)，來源于SEP3外顯子6的circRNA可以結(jié)合其同源的DNA形成一個RNA:DNA雜交物或R環(huán)。R回路的形成可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄暫停，這些circRNAs可能有助于提高其同源外顯子的拼接效率，從而競爭性調(diào)控可變剪接。

2.5 其他功能 有些circRNAs參與運輸miRNA，CDR1as作為分子海綿吸附大量miRNA-7，CDR1as被miRNA-671降解，而釋放大量的miRNA-7，相當(dāng)于起到miRNA-7轉(zhuǎn)運載體的作用[30]。

3 circRNA的篩選與驗證

由于沒有3′末端，傳統(tǒng)RNA測序技術(shù)無法檢測出circRNA。研究人員通過分析RNA測序數(shù)據(jù)，在測序結(jié)果中尋找兩個重排外顯子之間的結(jié)點，來識別可能存在的circRNA[31-35]。目前有許多商業(yè)化篩選手段，如高通量測序、基因芯片。高通量測序成本較高，但可以發(fā)現(xiàn)新的circRNA，芯片成本相對較低，但只能檢測已知的circRNA。篩選出的circRNA可以通過熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗證。雖然circRNA篩選技術(shù)有所發(fā)展，但現(xiàn)階段研究circRNA仍然存在一些問題，如標(biāo)本中circRNA表達(dá)量較低，不便于檢測；母源基因表達(dá)和功能之間的關(guān)系還不明確等。

4 circRNA與肺癌的研究

非編碼RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制是目前分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一，關(guān)于miRNA及l(fā)ncRNA與腫瘤的相關(guān)性研究已取得大量成果。而circRNA在腫瘤中的研究也成為RNA領(lǐng)域新的焦點。目前關(guān)于circRNA在肺癌中的研究也還在起步階段。

Zhao等[36]通過高通量測序，研究早期肺腺癌組織中的circRNA表達(dá)譜，通過生物信息學(xué)，分析篩選出差異表達(dá)的circRNA。他們發(fā)現(xiàn)有357個circRNAs表達(dá)失調(diào)，并挑出5個特異性circRNAs進(jìn)行生物學(xué)分析，并預(yù)測了circRNA-miRNA具有潛在的相互作用，這些circRNAs可能為肺癌的早期診斷提供潛在的靶點。

基于circRNA對轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，陳麗劍等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在苯并[a]芘致肺癌中circRNA 001988的表達(dá)下調(diào)，提示該基因可能具有抑癌基因的作用。他們又進(jìn)一步使用生物學(xué)信息軟件RegRNA預(yù)測得到這些microRNA下游的與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)的150多個mRNA，他們選擇了與癌癥相關(guān)性較高的一個mRNA（CCDC6）做了進(jìn)一步的檢測，證明它對細(xì)胞周期具有重要的調(diào)控作用。hsa-miR-382-5p和hsa-miR-583在癌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，可能是由于circRNA 001988下調(diào)之后，對其靶向的miRNA的吸附作用減弱，使得miRNA表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果均表明，circRNA 001988可通過調(diào)節(jié)miRNA活性，從而發(fā)揮抑癌作用。

另外，Wan等[37]研究發(fā)現(xiàn)，cir-ITCH在肺癌組織中的表達(dá)明顯下降。cir-ITCH通過Wnt/Catenin通路抑制肺癌增殖。他們通過細(xì)胞研究證明cir-ITCH也在不同肺癌細(xì)胞株中表達(dá)增強。cir-ITCH的異位表達(dá)，明顯提高了抑制癌基因的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。他們從分子水平研究顯示，cir-ITCH作為miR-7和miR-214海綿，提高ITCH基因的表達(dá)，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。Yao等[38]報道，在非小細(xì)胞肺癌組織中circRNA100876表達(dá)顯著上調(diào)，并與腫瘤分期明顯相關(guān)。這些進(jìn)一步表明circRNA在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程、診斷及治療中具有重大意義。

此外，Zhu等[39]報道，肺腺癌組織中hsa_circ_0013958明顯上調(diào)，并與TNM分期明顯相關(guān)。所以在肺腺癌的不同階段，相關(guān)circRNA表達(dá)量也可能會有所不同。circRNA表達(dá)量的不同可能對肺腺癌的嚴(yán)重程度起預(yù)測作用。因此，肺腺癌患者外周血中的差異表達(dá)的circRNAs可能成為診斷肺腺癌的潛在生物標(biāo)志物。

5 展望

由于circRNA具有多樣性，我們推測還會有更多的circRNA參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展。目前circRNA在肺癌中的研究才剛剛起步。利用新發(fā)展的高通量測序，可以篩選出新的可能與肺癌相關(guān)的circRNA。在細(xì)胞或動物實驗中，通過調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，深入了解其在肺癌發(fā)生和發(fā)展中起到的作用及機制，對于肺癌的診斷、治療可能具有重要的臨床價值。