王璐 孫小虎 白靜慧 萬(wàn)義增 陳素賢

【摘要】目的 旨在探討髓系細(xì)胞觸發(fā)受體（TREM-1）和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）在結(jié)腸癌（CRC）組織及癌旁組織（TAC）中的表達(dá)情況及與臨床病理特征的關(guān)系。方法 收集手術(shù)切除的CRC組織標(biāo)本68例，采用免疫組化方法及Western blot方法檢測(cè)TREM-1及EGFR在CRC組織及TAC組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 TREM-1及EGFR在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且兩者呈正相關(guān)性。TREM-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，EGFR的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 TREM-1和EGFR在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，高于TAC組織（P<0.05），且二者正相關(guān)。提示二者與腫瘤的發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸癌；髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1；表皮生長(zhǎng)因子受體

【中圖分類(lèi)號(hào)】R735.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2018.31..04

Expression and Significance of Trem-1 and EGFR

in Colorecal Carcinoma

WANG Lu1，2，SUN Xiao-hu2，BAI Jing-hui2，WAN Yi-zeng1*，CHEN Su-xian1

（1.Jinzhou Medical University，Liaoning Jinzhou 121001，China；

2.Liaoning Cancer Hospital，Liaoning Shenyang 110042，China）

【Abstract】Objective The main aim of this research is to incestigate the expression and clinical significance of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 （Trem-1） and Epidemal growth factor receptor （EGFR） in colorecal carcinoma （CRC） tissues and tissue adjacent to carcinoma （TAC）.Methods The research collected 68 cases of colorecal tissues from CRC patients as control group. The expressions of Trem-1 and EGFR in colorecal carcinoma tissues and the tissue adjacent to carcinoma were detected by immuno-histochemical and Western blot method.Results Compared with TAC group， the expression of Trem-1 and EGFR were significantly increased in CRC group （P<0.05）.There was a positive correlation between the expression of the two.The expression of TREM-1 were related to lymph node metastasis，and expression of EGFR were possitively correlated to depth of invasion， lymph node metastasis and clinical stages.Conclusion The expression of TREM-1 and EGFR were higher in colorecal carcinoma tissues than in the tissue adjacent to carcinoma，and have positive relations.It suggested that both of EGFR and Trem-1 are related to tumor development， infiltration

and metastasis.

【Key words】Colon cancer；Triggering receptor -1 of myeloid cells；Epidermal growth factor receptor

結(jié)腸癌（Colorecal Carcinoma，CRC）是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率較高、進(jìn)展迅速等臨床特點(diǎn)[1，2]。尋找新的有效的CRC的治療手段，已經(jīng)成為目前亟待解決的主要問(wèn)題。表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種跨膜受體酪氨酸激酶，是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物；髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1（Triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）是一種新型調(diào)控的炎癥反應(yīng)因子，主要參與急性炎癥反應(yīng)。新近的研究發(fā)現(xiàn)，TREM-1和EGFR可激活多種下游信號(hào)通路，產(chǎn)生多種后續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)，參與細(xì)胞生存、血管形成、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、抗腫瘤免疫、腫瘤化療耐藥性等生理病理活動(dòng)[3] ，在CRC腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中存在密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)TREM-1和EGFR在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，分析二者的相關(guān)性，進(jìn)一步探討TREM-1與EGFR的表達(dá)與CRC的臨床病理特征的關(guān)系，為后續(xù)藥物治療提供新的靶點(diǎn)

信息。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織標(biāo)本

選取我院2016年11月～2017年12月在遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)腸癌的患者68例，選取受試患者病理蠟塊標(biāo)本及其臨床病理資料作為疾病模型組；同時(shí)選取其相應(yīng)癌旁組織（結(jié)腸癌邊緣外≥5 cm）共68例作為對(duì)照組。所有病例經(jīng)核實(shí)患者無(wú)重復(fù)，臨床病理資料完整。

1.1.2 試劑及耗材

兔抗TREM-1抗人單克隆抗體（ab214202）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗人表皮生長(zhǎng)因子（即用型）（GT209307）購(gòu)自基因科技有限公司；檸檬酸抗原修復(fù)液購(gòu)自：長(zhǎng)島抗體診斷試劑有限公司；EDTA抗原修復(fù)液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器

石蠟切片機(jī)（LEICA-RM213）購(gòu)自德國(guó)萊卡公司；臺(tái)式水浴恒溫振蕩器（TSHZ-A）購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（SIEMENS Advia Centaur XP）購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子公司；Olympus光學(xué)顯微鏡（H-600）購(gòu)自日本Olympus公司；德國(guó)生物信號(hào)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Carl Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和標(biāo)本處理

本實(shí)驗(yàn)共分CRC模型組及TAC對(duì)照組2組。 CRC模型組（CRC組）：選取結(jié)腸癌的患者，68例，經(jīng)患者簽署知情同意書(shū)后，受試患者病理蠟塊標(biāo)本及其臨床病理資料作為模型組。TAC對(duì)照組（TAC組）：選取相應(yīng)癌旁組織（結(jié)腸癌邊緣外≥5 cm），68例，作為對(duì)照組。

上述標(biāo)本離體30 min內(nèi)進(jìn)行處理，按照分組要求切取面積約1.0 cm×1.0 cm的結(jié)腸組織作為受試組織。取出的結(jié)腸組織采用生理鹽水漂洗，放入10%甲醛進(jìn)行固定，標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋，進(jìn)行SP免疫組化。

1.2.2 SP免疫組化

（1）將組織切片置于梯度酒精中。（2）采用高壓修復(fù)。（3）滴加血清封閉非特異性位點(diǎn)。（4）甩掉多余血清，滴加配置好適當(dāng)比例的一抗。（5）取出切片，PBS沖洗，吸水紙擦掉多余水分，滴加二抗。（6）滴加即用型SABC復(fù)合物，置于37℃孵育箱中后PBS沖洗。（7）每張切片分別滴加1滴新鮮配制的DAB液，適時(shí)用PBS沖洗終止反應(yīng)。（8）視蘇木素濃度復(fù)染一定時(shí)間，以鹽酸酒精分化，自來(lái)水下沖洗（返藍(lán)）。（9）脫水、透明。

1.2.3 結(jié)果判定

在400倍光鏡下，每張組織切片隨機(jī)選取10個(gè)視野；細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)染色評(píng)分：染色面積評(píng)估：隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)染色面積測(cè)定。0分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1分：≤25%；2分：26～50%；3分：51%～100%。染色強(qiáng)度評(píng)分：指多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性：0分：無(wú)著色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。表達(dá)水平通過(guò)細(xì)胞染色比例及染色強(qiáng)度得分乘積判定。細(xì)胞膜評(píng)分：0分：無(wú)反應(yīng)或少于10%的細(xì)胞膜染色；1分：≥10%的細(xì)胞膜出現(xiàn)微弱染色；2分：≥10%的細(xì)胞側(cè)膜、基底側(cè)膜或完全膜出現(xiàn)中度染色；3分：≥10%細(xì)胞強(qiáng)染色出現(xiàn)在側(cè)膜、基底膜或全部染色；上述分?jǐn)?shù)之和用來(lái)判斷Trem-1和EGFR結(jié)果，>2分者為陽(yáng)性，≤2分者為陰性。

1.2.4 Western blot檢測(cè)

取5 mg組織加裂解液及蛋白酶抑制劑，對(duì)樣品行BCA蛋白測(cè)定；制備樣品，制膠后上樣、電泳電壓105 V；采用半干法轉(zhuǎn)膜，取出含有目標(biāo)蛋白的膠置于轉(zhuǎn)膜液中，裁取與膠相匹配的PVDF膜，置于甲醇中約1分鐘，而后置于轉(zhuǎn)膜液中；接通轉(zhuǎn)膜儀，取出PVDF膜將其與膠相鄰面朝上置于BSA封閉液中，室溫置于搖床2小時(shí)；從封閉液中取出膜，TBST洗膜3次，而后置于配置好比例的一抗中，搖床4℃過(guò)夜；次日取出膜，TBST洗3次，室溫置于二抗孵育2小時(shí)；二抗反應(yīng)完畢后TBST洗3次，將ECL試劑盒中A液與

B液混合，置于分析儀中進(jìn)行圖像采集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間計(jì)數(shù)資料比較時(shí)使用x2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。Western Blot結(jié)果用Image Quant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)獲得掃描圖像后采用Image J軟件分析灰度值，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 TREM-1在結(jié)腸癌及癌旁組織中表達(dá)

免疫組化顯示，在結(jié)腸癌組織中，TREM-1陽(yáng)性定位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿，在癌旁組織中，TREM-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，兩者的TREM-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.1%及32.4%。兩者比較；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（見(jiàn)圖1A，1B）。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中TREM-1的

灰度值高于癌旁組織中TREM-1的灰度值，分別為0.892±0.039與0.773±0.024，具有顯著性差異；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.2 EGFR在結(jié)腸癌及癌旁組織中表達(dá)

EGFR染色結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中，EGFR表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，在癌旁組織中，EGFR表達(dá)于細(xì)胞膜，兩組的EGFR陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.1%及32.4%，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3A，3B。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與TAC組相比，CRC組中灰度值水平明顯升高，分別為0.066±0.002與0.042±0.006，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

2.3 CRC中TREM-1和EGFR的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

TREM-1的表達(dá)與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小及TNM分期無(wú)相關(guān)性；差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TREM-1在有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性率分別為82.1%和51.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。EGFR的表達(dá)與年齡、性別、組織分化程度無(wú)相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期存在相關(guān)性；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 結(jié)腸癌組織中EGFR和TREM-1的表達(dá)相關(guān)性

在CRC組的68例結(jié)腸癌組織中，TREM-1和EGFR共同陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)為36例，共同陰性表達(dá)例數(shù)為8例，經(jīng)x2檢驗(yàn)分析，兩者之間的表達(dá)成正相關(guān)；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.721，P<0.05）。

3 討 論

結(jié)腸癌（CRC）是消化系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移速度較快、侵襲范圍廣范等臨床特點(diǎn)。目前的主要治療手段為手術(shù)治療和放化療的綜合治療。目前，CRC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移依然是CRC患者死亡的主要因素[1，4]。然而，目前臨床上CRC的靶向治療尚處于初級(jí)階段，因此，充分了解CR發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)特征及其生物靶點(diǎn)是探討CRC的發(fā)病機(jī)理是防治CRC的重要環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)選取的受試CRC疾病模型的患者共68例，其中60歲以上占70%，多數(shù)浸潤(rùn)漿膜層，pTNM分期以II期、III期為主，分化程度以中分化為主。該結(jié)果可見(jiàn)，CRC是老年常見(jiàn)疾病之一，并且發(fā)病迅速、侵襲范圍廣泛，且淋巴結(jié)浸潤(rùn)也常見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EGFR在CRC中存在過(guò)度表達(dá)，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度存在相關(guān)性。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)EGFR的免疫組化染色及Western blot結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中，EGFR主要表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿。EGFR是新型的炎癥因子之一，發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等表面[5，6]。另外，新近的研究也發(fā)現(xiàn)，EGFR的信號(hào)通路對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理及病理過(guò)程發(fā)揮重要的作用，同時(shí)與腫瘤、糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）、免疫缺陷性疾病及心血管疾病也密切相關(guān)[7，8]。研究也表明，在結(jié)腸、直腸癌中，基因K-ras突變率達(dá)到35%-45%，已成為EGFR抗體治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（Metastatic colorectal cancer，MCRC）的主要療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，也開(kāi)創(chuàng)了MCRC個(gè)體化治療的第一步[9]。這提示我們，在CRC的治療中，EGFR可作為CRC患者治療效果的指標(biāo)和靶點(diǎn)之一，是現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)到，TREM-1在CRC組織主要定位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿中，在CRC中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與TAC組相比，CRC組中灰度值水平明顯升高。Trem-1是一種炎癥激發(fā)的新型受體，有相關(guān)研究表明，Trem-1參與了多種炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大過(guò)程，某些炎癥成分及炎癥效應(yīng)可以上調(diào)細(xì)胞表面的TREM-1的表達(dá)[10，11]。TREM-1能協(xié)同激活TREM-1的配體，從而引起TREM-1受體向下游傳遞信號(hào)，隨后會(huì)誘導(dǎo)前炎性因子的產(chǎn)生并引起相關(guān)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；在新近的研究中提示，TREM-1可能是腫瘤免疫調(diào)節(jié)的新靶點(diǎn)[12]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TREM-1與CRC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可能成為CRC診斷及治療的新作用靶標(biāo)。

另外，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也證實(shí)，TREM-1和EGFR兩者之間的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，提示兩者在CRC中存在某種協(xié)同作用。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，TREM-1的表達(dá)與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小及TNM分期無(wú)相關(guān)性，與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EGFR的表達(dá)與年齡、性別、組織分化程度無(wú)相關(guān)性，與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期存在相關(guān)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了TREM-1和EGFR在CRC組織中的高表達(dá)，對(duì)結(jié)腸癌的的發(fā)生、發(fā)展起調(diào)節(jié)作用，為臨床防治CRC提供了重要的理論依據(jù)。

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本文編輯：趙小龍