張玲 郝利平

摘要：利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶對鈣果仁蛋白進(jìn)行三酶復(fù)合分步水解制備活性肽，通過給正常小鼠和模型鼠灌胃不同劑量的鈣果仁活性肽來研究其對試驗(yàn)小鼠的抗氧化作用。結(jié)果表明，經(jīng)三酶水解后的鈣果仁活性肽有較好的清除DPPH·自由基能力，其IC50值為1.06 mg/mL。另外，活性肽高劑量組還能夠顯著提高正常小鼠以及模型鼠血清、肝臟和腎臟中SOD和GSH-PX的活力，同時(shí)可顯著降低其血清和肝臟中MDA的含量，但對降低腎臟中MDA的含量作用不顯著，說明鈣果仁活性肽可清除自由基對機(jī)體的損害，在小鼠體內(nèi)有一定的抗氧化作用。

關(guān)鍵詞：鈣果仁;酶解;DPPH·自由基;抗氧化作用

中圖分類號：R282? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：0439-8114（2018）21-0101-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.025? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Preparation of Cerasus humilis Kernel Peptide and Assessment of

the Antioxidant Activity in vivo

ZHANG Ling1，HAO Li-ping2

（1.Shanxi Agricultural Science Academy， Processing Institute，Taiyuan 030031，China;

2.Shanxi Agricultural University，F(xiàn)ood Science and Engineer College，Taigu 030801，Shanxi，China）

Abstract： Kernel of Cerasus humilis protein were hydrolyzed by three kinds of enzymes including alkaline protease， trypsin and neutral proteinase. Kernel of Cerasus humilis peptide of different concentrations were gaved in the mice. Determined the antioxidant of the normal mice and model mice by analyzing the body weight，the SOD activity，the GSH-PX activity and the MDA concentration in serum，liver and kidney of mice. Results suggest that the kernel of Cerasus Humilis peptides had a relatively high level of DPPH radical scavenging activity with the IC50 value was 1.06 mg/mL. The high dose peptide could significantly increase the SOD and GSH-PX activity in serum，liver and kidney and could significantly reduce the concentration of MDA in serum，liver （P<0.05），but the effect on MDA in kidney was not significantly.

Key words： kernel of Cerasus Humilis; hydrolysis; DPPH free radical; antioxidant activity

鈣果仁為薔薇科櫻桃屬歐李（Cerasus humilis）的種子，歐李是中國特有的一個(gè)古老野生灌木果樹樹種，其果實(shí)富含礦質(zhì)營養(yǎng)，鈣含量較高，故又名鈣果，主要分布在中國遼寧、內(nèi)蒙古、河北等地，是果藥兼用的野生樹種，原產(chǎn)中國三北地區(qū)，其莖葉、果實(shí)、根皮具有很高的經(jīng)濟(jì)利用和藥用價(jià)值[1]。鈣果仁也是中國醫(yī)書中記載的一種常用藥郁李仁，可潤燥滑腸、下氣、利水。用于治療津枯腸燥、食積氣滯、腹脹便秘、水腫、腳氣、小便不利等病癥[2]。近年來人工培育的鈣果果實(shí)的開發(fā)應(yīng)用及深加工多集中于果汁、果脯、紅色素等的制備[3]。果實(shí)加工后會(huì)產(chǎn)生大量的鈣果仁，目前已有對鈣果仁保健油提取分離[4]的研究，但對其蛋白質(zhì)的利用和研究較少[5]，而果仁蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于杏仁、扁桃仁、核桃中蛋白質(zhì)的含量[6]，且蛋白質(zhì)經(jīng)水解可以得到具有多種生物活性功能的肽物質(zhì)。目前，可食性植物源抗氧化肽因其優(yōu)越的抗氧化活性和較高的安全性，有其獨(dú)特的生理功能和廣泛的應(yīng)用前景[7]。本試驗(yàn)以鈣果仁為原料制備活性肽并研究其對小鼠體內(nèi)相關(guān)酶系和脂質(zhì)氧化的影響，為植物蛋白制備活性肽以及活性肽體內(nèi)抗氧化作用的評價(jià)提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)也對天然抗氧化劑的應(yīng)用與開發(fā)，以及蛋白質(zhì)資源的綜合利用提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

鈣果仁，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果園提供。鈣果仁蛋白粉，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所果蔬加工實(shí)驗(yàn)室制備。昆明種小鼠，雄性，80只，體重20 g左右，購自山西醫(yī)科大學(xué)。

1.2? 主要試劑與儀器

蛋白酶（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;DPPH·自由基（Sigma公司產(chǎn)品）;總超氧化物歧化酶測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;FSH-I型高速電動(dòng)勻漿機(jī);LD5-10型低速離心機(jī);紫外可見分光光度計(jì)。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1? 鈣果仁活性肽的制備? 鈣果仁蛋白酶酶解條件如表1所示。

1.3.2? 活性肽對DPPH·自由基清除率的比較? 活性肽對DPPH·自由基清除率的比較參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.3.3? 鈣果仁活性肽抗氧化試驗(yàn)? 小鼠購回后先適應(yīng)環(huán)境4 d，免疫低下模型組小鼠：第1天、第2天、第3天每天每鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg。連續(xù)給藥3 d，之后隨機(jī)分為4組，正常小鼠也隨機(jī)分為4組，分別為空白對照組（每天灌胃0.2 mL/只生理鹽水）;鈣果仁肽低劑量組、中劑量組和高劑量組（每天灌胃0.2 mL濃度分別為10、20、30 mg/mL的鈣果仁活性肽）。連續(xù)灌胃14 d，每天自由采食和飲水。

1.4? 試樣采集與制備

灌胃14 d后，小鼠禁食12 h后摘除眼球取血，肝素抗凝，在0～4 ℃ 3 000 r/min 離心15 min制備血清;頸椎脫臼法處死，取肝臟和腎臟稱重用小剪刀將肝臟和腎臟樣品剪碎，在研缽中倒入適量的經(jīng)過冰浴的生理鹽水快速充分研磨，然后用生理鹽水配成10%的組織勻漿液，3 000 r/min離心，取勻漿上清液分別測定有關(guān)生化指標(biāo)。

1.5? 抗氧化功能指標(biāo)的測定

組織蛋白質(zhì)的測定：取肝臟和腎臟勻漿上清液并用生理鹽水稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋每捡R斯亮藍(lán)法[9]測定肝、腎臟蛋白質(zhì)的濃度。超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性、 丙二醛濃度的測定，按照試劑盒進(jìn)行測定。

1.6? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件處理，用單因子方差分析（One-way ANOVN，LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以X±s表示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 鈣果仁活性肽酶解法的篩選

2.1.1? 三酶分步復(fù)合水解對DPPH·自由基清除率的影響? 如圖1所示，由堿性蛋白酶水解30 min后其酶解液對DPPH·自由基的清除率為63.7%，加入胰蛋白酶繼續(xù)水解30 min后的清除率為82.4%，再加入中性蛋白酶繼續(xù)水解30 min后的酶解液對DPPH·自由基的清除率可高達(dá)93.4%，可知三酶分步復(fù)合水解與單酶以及雙酶水解鈣果仁蛋白相比其對DPPH·自由基的清除率最高，故確定鈣果仁蛋白最佳的酶解工藝為三酶復(fù)合水解。其酶解工藝為先讓堿性蛋白酶在最適條件下水解30 min，滅酶后調(diào)pH為8，加入胰蛋白酶在45 ℃下水解30 min滅酶，調(diào)pH為7.5，最后加入中性蛋白酶在40 ℃下繼續(xù)水解30 min后滅酶收集酶解液，經(jīng)離心、濃縮、冷凍干燥得到歐李仁活性肽。

2.1.2? 鈣果仁活性肽的制備及其對DPPH·自由基清除率的影響? 由圖2可知，在1～4 mg/mL濃度范圍內(nèi)，歐李仁活性肽對DPPH·自由基的清除作用隨濃度的增加呈上升趨勢。當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí)，清除率已達(dá)83.3%。當(dāng)濃度繼續(xù)升高時(shí)，歐李仁多肽對DPPH·自由基的清除率接近100%，當(dāng)濃度為8 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)95.5%。多項(xiàng)式回歸分析得到回歸方程為y=-0.014 2x2+0.193 2x+0.311 1，R2=0.972 2，通過回歸方程得出鈣果仁活性肽清除DPPH·自由基的IC50為1.06 mg/mL。

2.2? 鈣果仁活性肽對正常小鼠和模型小鼠內(nèi)抗氧化活性的影響

2.2.1? 鈣果仁活性肽對小鼠體重的影響? 由表2可知，灌胃鈣果仁活性肽14 d后，正常鼠、模型鼠與對照組相比體重都有所增加。正常鼠3個(gè)劑量組與空白對照組相比，分別增重了27.4%、44.0%、49.1%，但各組之間差異都不顯著（P>0.05），模型鼠3個(gè)劑量組與模型對照組相比，分別增重了41.5%、44.2%、60.6%。高、中劑量組顯著高于模型對照組（P<0.05），低劑量組與其他組相比差異都不顯著（P>0.05）。說明鈣果仁活性肽對小鼠的體重增重沒有顯著增加的作用，但隨著鈣果仁活性肽劑量的增加，其體重有增加的趨勢。

2.2.2? 鈣果仁活性肽對小鼠體內(nèi)SOD活性的影響? 由表3可知，與對照組相比，不同劑量組小鼠血清中SOD的活力均有所升高，且劑量越大SOD的活力越高。正常鼠與模型鼠低、中、高劑量組血清中SOD的活力均顯著高于其對照組（P<0.05），正常鼠3個(gè)劑量組之間相比差異不顯著（P>0.05），說明對正常小鼠在提高血清中SOD活力方面，鈣果仁活性肽低劑量組就可達(dá)到較好的效果，而模型鼠在提高血清中SOD活力方面鈣果仁活性肽中劑量組就可達(dá)到較好的效果。

正常鼠肝臟中低、中、高劑量組與對照組相比都有提高，高劑量組SOD的活性顯著高于其他組（P<0.05），模型鼠肝臟中3個(gè)劑量組SOD的活性顯著高于模型對照組（P<0.05），與對照組相比分別提高了28.5%、29.1%和31.7%，但3個(gè)劑量組之間相比差異不顯著（P>0.05），說明在提高模型鼠肝臟中SOD的活力方面，低劑量組就可以達(dá)到較好的效果。正常鼠與模型鼠腎臟中3個(gè)劑量組與對照組相比其SOD的活性都有所提高，且高劑量組SOD的活性均顯著高于其他組（P<0.05）。

2.2.3? 鈣果仁活性肽對小鼠體內(nèi)GSH-PX活性的影響? 由表4可知，正常鼠與模型鼠血清中3個(gè)劑量組的GSH-PX的活性均顯著高于對照組（P<0.05），且在提高正常鼠和免疫抑制小鼠血清中GSH-PX的活性方面，低劑量組就可達(dá)到較好的效果。肝臟中低劑量組與對照組相比差異均不顯著（P>0.05），但中劑量組在提高正常鼠和免疫抑制小鼠肝臟中GSH-PX的活性方面，可達(dá)到較好的效果。正常鼠腎臟中3個(gè)劑量組與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05），但其GSH-PX的活性均有所上升，說明鈣果仁活性肽對提高小鼠血清和肝臟的GSH-PX的活性作用較腎臟中GSH-PX的活性相對較強(qiáng)。模型鼠腎臟中高、中劑量組與低劑量組和模型對照組相比其活力都提高了1倍多，說明高、中劑量組對提高腎臟中GSH-PX的活性有顯著作用（P<0.05），但高、中劑量組之間以及低劑量組和模型對照組之間差異都不顯著（P>0.05）。