余頡+趙述淼

摘要：以螺旋藻為原料，使用畢赤酵母發(fā)酵所產(chǎn)生的蛋白酶對其水解制備了高活性小肽。對酶解工藝條件進行研究，根據(jù)正交試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，以DH和TCA-SNI為指標，對影響螺旋藻水解的各種影響因素：溫度、pH、料水比、酶底比和時間進行了系統(tǒng)研究，得到了最佳工藝條件為：料水比1∶8、酶底比700 U/g、酶解溫度55 ℃、pH值8.5，酶解時間3 h。在最佳條件下制備螺旋藻活性肽的水解度（DH）為11.82%，三氯乙酸-可溶性氮指數(shù)（TCA-SNI）為55.13%。利用凝膠過濾色譜法對酶解產(chǎn)物進行分子量的測定，結果顯示：分子量小于1000 Da的寡肽占55.02%，小肽分子量分布主要集中在260 Da附近，約2個氨基酸殘基，含量為29.07%。制備的螺旋藻肽粗蛋白含量為62.52%，總磷含量為1.00%，鈣含量為0.13%，鐵含量為803 mg/kg。

關鍵詞：螺旋藻；酶解；活性肽

中圖分類號：Q946

文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2017）23-0023-04

1 引言￣

螺旋藻又稱藍細菌，是一種絲狀多細胞螺旋體的原核藻類生物，屬于藍藻門顫藻科。螺旋藻具有很高的營養(yǎng)價值，其蛋白質(zhì)含量高達60%～70%，是目前已知食物中最高的^[1]，而且含有豐富的氨基酸、維生素、脂肪、類胡蘿卜素、多糖以及礦物質(zhì)^[2]，是人類理想的食物及藥物資源。螺旋藻是安全無毒的，早在400年前墨西哥等地已經(jīng)開始食用螺旋藻^[3]，所以螺旋藻具有廣闊的開發(fā)前景。

生物活性肽是由氨基酸組成的具有生物活性的肽類化合物。小分子的活性肽不僅能夠提供機體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有增強免疫力、抑制細菌、抗氧化等功能^[4，5]。與游離氨基酸和蛋白質(zhì)相比，肽能夠更好、更快地被機體吸收^[6]。因此，越來越多的研究者開始關注生物活性肽，小肽的制備及其所具有的生物活性已經(jīng)成為研究的熱點，并且取得不少的成果^[7～9]。近年來，生物活性肽作為一種新型的飼料添加劑日益受到人們的關注，目前酶解螺旋藻制備活性肽的研究較少。筆者以螺旋藻為主要原料，對酶解螺旋藻蛋白制備高活性小肽的工藝進行研究，為蛋白小肽類飼料添加劑的產(chǎn)業(yè)化進程提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料和試劑

螺旋藻：北海生巴達生物科技有限公司；畢赤酵母蛋白酶：華中農(nóng)業(yè)大學生科院發(fā)酵工程室；其余試劑均為分析純。

2.2 主要實驗儀器

PL303電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；FOSS DT208型消化爐：蘇州安創(chuàng)儀器有限公司；Hlanon K9860凱氏定氮儀：濟南海能儀器有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機：香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；722S 可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司制造；Superdex Peptide 10/300 GL 層析柱：美國GE Healthcare公司；KQ3200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限責任公司。

2.3 實驗方法

2.3.1 螺旋藻蛋白含量的測定

參照國家標準GB/T 6432-94《飼料中粗蛋白測定方法》^[10]進行測定。

2.3.2 畢赤酵母蛋白酶活力的測定

采用國家標準GB/T 23527-2009 《蛋白酶制劑》^[11]中的福林法進行測定。

2.3.3 螺旋藻酶解方法

稱取一定量的螺旋藻，按照設計好的比例加入適量的水，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，加入一定量的畢赤酵母蛋白酶在適宜的溫度下進行酶解，反應結束后置于沸水中滅酶活10 min，迅速冷卻，6000 r/min離心10 min，收集上清液測水解度（DH）和三氯乙酸—可溶性氮指數(shù)（TCA-SNI）。

2.3.4 水解度（DH）的測定

采用茚三酮比色法^[12]。

DH（%）=A1000×W×V1×100V2×100%

式中：A為查表得蛋白質(zhì)的毫克數(shù)（mg）；W為稱樣重（g）；V1為水解夜的總體積（mL）；V2為顯色時所用稀釋液的體積（mL）。

2.3.5 三氯乙酸——可溶性氮指數(shù)（TCA-SNI）

TCA-SNI（%）=三氯乙酸中可溶性氮含量/原料中總氮含量×100%

2.3.6 凝膠過濾色譜法

將Superdex Peptide 10/300 GL層析柱用0.05 mol/L，pH 4.5的醋酸鹽緩沖液平衡過夜。酶解液于10000 r/min離心10 min，取上清液過0.2 μm的微孔濾膜，然后取500 μL上樣測定，洗脫液為0.05 mol/L的醋酸鹽緩沖液，洗脫速度為0.5 mL/min。肽標準品為Angiotensin II Acetate（Mr 1046.2），Methionine Enkephalin Acetate（Mr573.7），Val-Tyr-Val（Mr379.5），Gly-Tyr（Mr238.2）^[13]。

2.3.7 營養(yǎng)成分的測定

參考國家標準GB/T 14924.9-2001《實驗動物配合飼料常規(guī)營養(yǎng)成分的測定》^[14]進行測定。

3 結果與分析

3.1 螺旋藻酶解條件的研究

3.1.1 蛋白酶的篩選endprint

酶解法制備生物活性肽的關鍵是蛋白酶的選擇，本實驗選取了5種常見的商業(yè)化酶制劑和一種實驗室自制的畢赤酵母蛋白酶，根據(jù)各自說明書上的最適溫度和pH值進行酶解實驗，DH和TCA-SNI的變化如圖1所示。

由圖1可見，酶解相同的時間，不同蛋白酶的水解效率是不同的，糜蛋白酶水解效果最好，胰蛋白酶和中性蛋白酶次之，畢赤酵母蛋白酶水解效果處于中等水平。糜蛋白酶酶切位點較少，如果選用它作用于蛋白，酶解片段一般較大，而且糜蛋白酶保存困難易分解。雖然中性蛋白酶和胰蛋白酶水解效果較好，但是成本較高，所以從經(jīng)濟成本和實驗條件考慮，選用實驗室自制的畢赤酵母蛋白酶作為最適蛋白酶進行酶解實驗。

3.1.2 料水比對酶解反應的影響

料水比直接決定著底物濃度和反應體系，并且間接地影響酶濃度和酶與底物的結合機率。由圖2可見，隨著料水比的增加，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI都迅速上升，但后期上升速度逐漸減緩，最高點在1∶12的水平。在工業(yè)生產(chǎn)中，料水比過高不僅蛋白濃度低不利于后期處理，而且極易染菌，增加生產(chǎn)成本；而料水比過低則溶液過度粘稠，會阻礙底物與酶的結合，不利于小肽的生成，所以綜合考慮選用1∶10的料水比進行后續(xù)試驗。

3.1.3 酶用量對酶解反應的影響

由圖3可見，隨著酶量的增加，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI都迅速上升，并且上升幅度基本沒有變化。這表明在底物濃度一定的情況下，酶沒有達到飽和狀態(tài)，所以加入的酶越多，樣品水解的越徹底，產(chǎn)生的可溶性蛋白含量就越高。而在工業(yè)大批量生產(chǎn)中，所用酶量越高則會使生產(chǎn)成本大幅升高；而所用酶量太低則會使樣品水解不徹底，不利于小片段肽的生成，所以綜合考慮，選取600 U/g為最適加酶量。

3.1.4 溫度對酶解反應的影響

由圖4可見，在溫度達到50 ℃之前，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI隨著溫度的升高迅速上升，在50 ℃時DH和TCA-SNI到達最大值。當溫度達到50 ℃以后，隨著溫度的升高，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI都逐漸下降。這是因為在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，反應體系內(nèi)分子運動更加劇烈，酶與底物結合機率增加，酶解反應速度加快，水解能力提高。但是當反應溫度超過酶的最適溫度以后，隨著溫度的升高，會破壞酶的三維結構從而使酶逐漸失活直至失去活性，因此50 ℃是畢赤酵母蛋白酶水解螺旋藻泥的最適溫度。

3.1.5 pH值對酶解反應的影響

pH值是酶解反應的主要條件之一，pH值影響著酶的活性，過酸過堿都會使酶的空間構象發(fā)生改變，使酶活性降低，而且pH值影響著底物與酶的結合。由圖5可見，隨著酶解溶液pH的升高，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI都逐漸上升，在pH值為8.0時DH和TCA-SNI達到最大值。pH值達到8.0以后，隨著pH值的升高，水解度和可溶性氮指數(shù)都逐漸下降，此時pH值高于最適pH值，酶的空間結構被破壞，酶逐漸失活，所以pH值為8.0較合適。

3.1.6 正交試驗結果

在單因素條件實驗的基礎上，以料水比、酶底比、溫度、pH值為考察對象，以水解度DH為指標，進行正交實驗以確定螺旋藻的最優(yōu)水解條件，方案設計見表1，實驗結果見表2。

由極差值分析得出，酶底比、料水比、pH值和溫度4個因素對DH的影響主次順序為：酶底比>料水比>pH值>溫度。螺旋藻泥酶解的最佳組合是A2B3C2D2，即酶解的最佳組合是：料水比1∶8，酶底比700 U/g螺旋藻泥，溫度55 ℃，pH值為8.5。由于該最優(yōu)組合的條件并不在以上9組正交條件實驗的條件中，所以在最佳實驗條件下再次進行了驗證實驗，結果表明螺旋藻酶解后的DH值可達到11.82%，此時TCA-SNI為55.13%。

3.1.7 酶解時間的確定

采用最佳條件分別3 h、6 h和9 h進行酶解，然后產(chǎn)物進行凝膠過濾層析，圖6為在最佳水解條件下酶解3 h、6 h和9 h產(chǎn)物的凝膠過濾圖譜。從圖中可以直觀看出水解3，6，9 h產(chǎn)物的洗脫曲線并無明顯差異。

將凝膠過濾層析圖譜中峰位對應的洗脫體積代入線性回歸方程y=-0.3882x+13.503，R2=0.9893，得到不同水解時間下多肽和氨基酸的峰面積比例，見表3。

由表3可見，隨著時間的延長，分子量小于5000 Da、1000 Da、400 Da的多肽含量逐漸降低，而游離氨基酸含量逐漸增加，說明隨著酶解的持續(xù)進行，部分小肽降解成游離氨基酸；另一方面伴隨著酶解時間的增加，會導致生產(chǎn)周期大幅度加長，生產(chǎn)成本增高、能耗加高，而且水解時間過長會使螺旋藻酶解液染上雜菌，極難控制，不適宜在工廠中進行大批量生產(chǎn)，所以綜合考慮酶解時間為3 h。

3.2 酶解產(chǎn)物分析

3.2.1 酶解產(chǎn)物分子量分布

將圖6酶解3 h產(chǎn)物的凝膠過濾曲線上峰位對應的洗脫體積代入線性回歸方程，得到酶解產(chǎn)物的分子量分布，見表4。因為酶解反應是連續(xù)進行的，所以多肽組分在5848～260 Da范圍內(nèi)呈連續(xù)分布，小肽分子量分布主要集中在260 Da附近，約2個氨基酸殘基，含量為29.07%。

3.2.2 螺旋藻肽的常規(guī)營養(yǎng)成分

由表5可見酶解后的螺旋藻肽的營養(yǎng)成分基本符合飼料添加劑的標準，表明這種螺旋藻肽具有較高的商業(yè)價值和發(fā)展前景。

4 討論

以螺旋藻為原料，通過正交試驗確定了酶解法制備高活性小肽的最佳工藝條件：料水比1∶8、酶底比700 U/g、酶解溫度55 ℃、pH值8.5，酶解時間3 h。在此條件下制備螺旋藻活性肽的水解度（DH）為11.82%，三氯乙酸-可溶性氮指數(shù)（TCA-S NI）為55.13%，小肽分子量分布主要集中在260 Da附近，約2個氨基酸殘基，含量為29.07%。制備的螺旋藻肽粗蛋白含量為62.52%，總磷含量為1.00%，鈣含量為0.13%，鐵含量為803 mg/kg，基本符合飼料添加劑的標準，而且小分子的活性肽更容易被機體吸收，所以產(chǎn)品具有成為安全無公害的新型飼料添加劑的潛力。endprint

本課題還需要研究產(chǎn)物的生理活性，探索產(chǎn)物是否具有抗氧化性、抑菌性等生理功能，進一步挖掘產(chǎn)物的發(fā)展?jié)摿Γ岣呗菪咫牡纳虡I(yè)價值，為螺旋藻肽成為新型飼料添加劑打下堅實的理論基礎。

參考文獻：

[1]張學成，信式祥，李清華，等.螺旋藻--最完美的功能食品[M].青島：青島海洋大學出版社，1999：54～83.

[2]Santillan C.Mass production of Spirulina[J].Experientia，1982，38（1）：40～43.

[3]Belay A.The Potential Application of Spirulina （Arthrospira） as a Nutritional and Therapeutic Supplement in Health Management[J].The Journal of the American Nutraceutical Association，2002，5（2）：27～48.

[4]張宇昊，王 強.功能性短肽的研究進展[J].中國油脂，2007，32（2）：69～73.

[5]勵建榮，封 平.功能肽的研究進展[J].食品科學，2004，25（11）：415～419.

[6]Clemente A.Enzymatic Protein Hydrolysates in Human Nutrition[J].Trends Food SciTechnol，2000（11）：254～262.

[7]Theolier J，Hammami R，Labelle P.Isolation and identification of antimicrobial peptides derived by peptic cleavage of whey protein isolate[J].Journal of Functional Foods，2013，5（2）：706～714.

[8]Nazeer R A，Kumar N S，Jai G R.In vitro and in vivo studies on the antioxidant activity of fish peptide isolated from the croaker （Otolithesruber） muscle protein hydrolysate[J].Peptides，2012（35）：261～268.

[9]Picot L，Bordenave S，Didelot S，et al.Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines[J].Process Biochemistry，2006，41（5）：1217～1222.

[10]馬東霞.GB/T 6432-94.飼料中粗蛋白測定方法[S].北京：中國標準出版社，1994.

[11]張晶雪，李永其，張 蔚，等.GB/T 23527-2009.蛋白酶制劑[S].北京：中國標準出版社，2009.

[12]郭興鳳.蛋白質(zhì)水解度的測定[J].中國油脂，2000，25（6）：176～177.

[13]王 梅，戴 軍.高效凝膠過濾色譜法測定玉米蛋白酶解產(chǎn)物寡肽的分子量分布[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，5：25～27.

[14]周瑞華，楊曉莉，王光亞，等.GB/T 14924.9-2001.實驗動物配合飼料常規(guī)營養(yǎng)成分的測定[S].北京：中國標準出版社，2001.

Preparation of Highly Active Peptides From SpirulinaMud Protein Hydrolysate

Yu Jie1，Zhao Shumiao2

（1.HubeiEcologyPolytechnicCollege，Wuhan，Hubei，430200，China； 2.State Key Laboratory of Agricultural

Microbiology，College of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan，

Hubei，430070，China）

Abstract： The preparation of highly active peptides from Spirulina mud by the enzyme which produced by pichiafermentation was studied.The orthogonal experiment was used to study the hydrolysis conditions.The influence factors，including temperature，pH，the ratio of material to water，enzyme dosage and hydrolysis time，were investigated according to DH and TCA-SNI.The optimum hydrolysis conditions were as follows： the ratio of material to water 1：8，enzyme dosage 700 U/g，hydrolysis temperature 55℃，pH 8.5，hydrolysis time 3 h.Under the optimal conditions，the DH of the hydrolysates reached 11.8% and the TCA-SNI of the hydrolysates reached 55.13%.The molecular weight of enzymolysis product was determined by Gel filtration chromatography.The result showed that the oligopeptide which the molecular weight was less than 1000 Da reached 55.02%.And the small peptide mainly with 260 Da molecular weight composed by 2 amino acids reached 29.07%.The hydrolysates had abundant nutrients： protein 62.52%，total phosphorus 1.00%，calcium 0.13% and iron 803 mg/kg.

Key words： Spirulina mud； enzymolysis； active peptidesendprint