徐學(xué)中 汪 婷 萬 旺 李思慧 朱國輝

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水稻ABA生物合成基因響應(yīng)干旱脅迫

徐學(xué)中 汪 婷 萬 旺 李思慧 朱國輝*

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東廣州 510642

9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是植物內(nèi)源脫落酸(ABA)生物合成的限速酶, 由基因家族編碼, 水稻中響應(yīng)干旱脅迫并以此調(diào)節(jié)ABA水平的基因尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)在水稻已報道的5個基因中,的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo), 復(fù)水處理后其表達(dá)快速下調(diào), 其表達(dá)模式與此過程中內(nèi)源ABA含量變化趨勢一致。的RNAi轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為干旱敏感, 且生物量下降; 而過量表達(dá)基因增加了水稻的抗旱性。干旱脅迫下過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系有較高的ABA水平, 同時其抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性, 以及逆境響應(yīng)基因脫水素蛋白(Dehydrin)和胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(LEA)轉(zhuǎn)錄表達(dá)均高于野生型。下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系則呈現(xiàn)相反的變化趨勢。因此,是水稻干旱脅迫響應(yīng)基因, 調(diào)節(jié)了干旱環(huán)境下ABA水平和抗逆性。

基因; 干旱脅迫; 脫落酸; 水稻

干旱脅迫是作物生產(chǎn)的主要限制因素之一, 生殖期的干旱可使作物減產(chǎn)50%以上[1]。干旱對植物生長的危害是多方面的, 植物對干旱脅迫的響應(yīng)機理也極其復(fù)雜, 包括逆境信號識別、信號傳導(dǎo)以及在形態(tài)、生理和分子水平的適應(yīng)(通過根系變化、積累滲透保護物、抗氧化物質(zhì)和活性氧清除劑等)[1-2]。在這個過程中, 大量信號分子(IP3、Ca2+、ABA等)和蛋白質(zhì)(包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶和各種逆境相關(guān)蛋白)參與其中, 信號途徑交叉互作, 形成了錯綜復(fù)雜的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)[3]。脫落酸(ABA)作為調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一種激素, 不僅在植物發(fā)育的各個階段發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用, 還能介導(dǎo)植物對一些逆境脅迫的生理反應(yīng), 比如干旱脅迫導(dǎo)致的氣孔關(guān)閉, 以增加植物的抗逆性等[3-4]。通過基因工程等手段調(diào)節(jié)作物ABA水平, 是提高干旱條件下作物產(chǎn)量的有效手段, 有重要的應(yīng)用前景[1]。

多數(shù)高等植物的ABA通過C40間接途徑由類胡蘿卜素合成, 9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-- epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)催化的反應(yīng)為ABA合成途徑中的限速步驟[5]。水稻NCED由基因家族編碼, 包括等5個基因[6]。不同的基因通過調(diào)節(jié)內(nèi)源ABA水平, 在不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。Zhu等[7]報道參與水稻籽粒灌漿過程中ABA水平的調(diào)控, Hwang等[8]報道在擬南芥中異源表達(dá)增加了擬南芥ABA水平, 改變了葉片形態(tài)。本研究綜合分析水稻基因的組織特異性和干旱逆境下的表達(dá), 同時通過轉(zhuǎn)基因的方法證明在干旱脅迫下調(diào)控ABA的生物合成, 以此響應(yīng)逆境脅迫。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

野生型和轉(zhuǎn)基因型水稻品種均為中花11 (L., Zhonghua 11)。于大田種植組織特異性表達(dá)材料, 四葉期取野生型水稻葉片、葉鞘和根, 用于基因幼苗期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析; 灌漿15 d后取水稻葉片、葉鞘、莖和穗, 用于生殖生長期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。干旱處理材料在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至四葉期, 于營養(yǎng)液中加入20% (w/v) PEG-6000模擬干旱脅迫, 分別取處理0、1、2、4 h以及復(fù)水0.5、1、2、4 h水稻葉片, 用于干旱脅迫下基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析, 其中干旱處理4 h水稻葉片用于ABA含量、MDA含量、抗氧化酶活性測定和干旱響應(yīng)基因表達(dá)分析。在水稻四葉期以20% PEG連續(xù)處理15 d, 取整株材料測定鮮重和干重。土壤干旱脅迫處理時在水稻長至五葉期時停止灌溉, 10 d后復(fù)水4 d。以上實驗均進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 基因定量表達(dá)分析

用RNA Easy Plant Mini Kit (Qiagen)試劑盒提取RNA, 經(jīng)DNase I處理一次, 去除RNA中的微量DNA, 再以MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用熒光染料 SYBR Green (Bio-Rad)對各種待測的基因進行定量PCR分析, 所有數(shù)據(jù)經(jīng)擴增水稻基因進行均一化處理, 每個基因重復(fù)3次。實驗中所用的引物見表1。

1.3 轉(zhuǎn)基因株系獲得

水稻品種中花11用于轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建。為構(gòu)建過量表達(dá)載體, PCR擴增基因全長, 引物為5￠-TCCCGATATGGCGAC GATCACGAC-3￠(d III)和5￠-GAAAGA AACGTGGAGGTGTTCGAT-3￠(H I), 片段酶切后連接于植物表達(dá)載體pOX (劉耀光提供, 華南農(nóng)業(yè)大學(xué))。為構(gòu)建干涉表達(dá)載體, PCR擴增基因一段569 bp的片段, 引物為5￠-GA AGTGGTGATCGGCTCGTGCATGAC-3￠(H I)和5￠-TCCCCCCAAGAAACGTG GAGGTGTTCG-3￠(d III), 片段酶切后正向連接于RNAi載體(劉耀光提供, 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)); 根據(jù)載體上I和I酶切位點反向組裝片段。構(gòu)建的過量表達(dá)和RNAi干涉載體通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化中花11水稻愈傷, PCR擴增基因篩選T0轉(zhuǎn)化植株, 在含潮霉素的營養(yǎng)液中篩選分離比為3∶1的T1轉(zhuǎn)化植株, 在含潮霉素的營養(yǎng)液中不再分離的T2轉(zhuǎn)化植株用于本實驗。

表1 定量PCR分析的引物序列

1.4 生物量、ABA含量、MDA含量、抗氧化酶活性測定與分析

稱量擦干根部的整株鮮重, 在100℃烘干8 h后于干燥皿中陰涼, 再分別稱取整株、地上部和根干重。ABA含量采用化聯(lián)免疫法測定[6]。0.2 g水稻材料液氮研磨后溶于1 mL去離子水, 4℃振蕩過夜, 離心后其上清液用于測定。采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛含量[9]。用50 mmol L–1pH 7.0磷酸緩沖液研磨水稻葉片, 離心后上清液可用于酶活性測定[9]。以抑制NBT光化還原50%作為一個SOD酶活力單位(U), 以U g–1FW表示; 以H2O2的分解速率衡量CAT活性, 單位以ΔA240min–1g–1FW表示; POD活性單位以ΔA470min–1g–1FW表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsNCED基因家族組織特異性表達(dá)和干旱脅迫反應(yīng)分析

分別對家族的5個基因轉(zhuǎn)錄水平的定量分析表明,主要在水稻葉片中表達(dá);在水稻幼苗期主要在葉鞘表達(dá), 而生殖生長期在莖中表達(dá);和轉(zhuǎn)錄豐度整體低于其他3個,在水稻根中有少量表達(dá);主要在水稻穗中表達(dá)(圖1-A)。

干旱脅迫下水稻葉片ABA水平會快速積累, 以適應(yīng)環(huán)境脅迫。為了解哪個基因?qū)BA積累起關(guān)鍵作用, 以20% PEG模擬干旱處理水稻幼苗4 h, 然后復(fù)水4 h, 分析過程中基因的表達(dá)變化。從圖1-B可見,基因表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo), 在處理4 h達(dá)到最高, 而復(fù)水處理其表達(dá)量迅速下調(diào), 復(fù)水4 h后達(dá)到本底表達(dá)水平。其表達(dá)模式與此過程中ABA含量變化一致(圖1-B, C), 表明是干旱脅迫響應(yīng)基因, 其轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了干旱條件下ABA的變化。有意思的是,基因表達(dá)模式與基因剛好相反, 其可能原因是基因轉(zhuǎn)錄受內(nèi)源ABA水平的反饋抑制。、和基因表達(dá)在此過程中無明顯變化(圖1-B)。

2.2 水稻OsNCED3轉(zhuǎn)基因株系干旱抗性分析

為了進一步證明是水稻響應(yīng)干旱脅迫關(guān)鍵基因, 分別構(gòu)建并獲得了基因下調(diào)表達(dá)和過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。下調(diào)表達(dá)采用RNA干涉(RNAi)的方法, 一段485 bp的基因編碼區(qū)域作為干涉片段, 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化至水稻中花11 (WT)。過量表達(dá)以Ubi作為啟動子, 把基因編碼框架轉(zhuǎn)化至水稻中花11; 轉(zhuǎn)基因水稻通過潮霉素篩選2代, 獲得純合株系。分別挑選過量表達(dá)株系OE-1、OE-5和下調(diào)表達(dá)株系RNAi-3、RNAi-5作為下一步研究的材料(圖2-A)。

干涉株系RNAi-3和RNAi-5中基因表達(dá)量分別下調(diào)了57.8%和32.9%, 過量表達(dá)株系OE-1和OE-5中基因表達(dá)量分別增加了3.2倍和9.8倍(圖2-A)。從圖 2-B可看出, 下調(diào)基因表達(dá)顯著降低了水稻幼苗的干旱抗性。五葉期水稻在自然脫水條件下干旱10 d后, 干涉株系RNAi-3和RNAi-5表現(xiàn)出嚴(yán)重的干旱表型, 整株葉片卷曲枯黃, 而野生型株系僅葉尖和老葉上有干旱脅迫表型。復(fù)水處理4 d后, 大部分野生型水稻恢復(fù)生長, 而干涉株系僅20%~30%植株得以存活(圖2-B, C)。與此相反, 過量表達(dá)基因增加了水稻幼苗的干旱抗性。與野生型比較, 過量表達(dá)株系OE-1和OE-5在干旱和復(fù)水條件下都表現(xiàn)出更好的生長情況(圖2-B, C)。這些結(jié)果表明直接參與干旱脅迫反應(yīng), 其轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了水稻對干旱脅迫的適應(yīng)性。

四葉期水稻以20% PEG模擬干旱處理15 d, 與野生型對照相比, 干涉株系RNAi-3和RNAi-5生物量明顯較低, PEG處理前后RNAi-3株系干重分別只為野生型的75.8%和75.4%; 過量表達(dá)株系OE-1和OE-5生物量與野生型無顯著性差異(表2)。與不加PEG處理相比,轉(zhuǎn)基因株系和野生型水稻鮮重、地上部干重及根長均呈下降趨勢, 而地下部根的干重則顯著增加。同時,過量表達(dá)株系根干重增加的比例高于野生型, 而RNAi干涉株系低于野生型(表2), 表明過量表達(dá)株系通過增加內(nèi)源ABA水平, 促進了逆境反應(yīng)物質(zhì)可溶性糖等的積累, 因此增加了干物重和逆境脅迫的耐受性; 下調(diào)基因的RNAi干涉株系則與此相反。

2.3 水稻OsNCED3轉(zhuǎn)基因株系干旱脅迫下ABA含量和抗氧化酶活性分析

水稻基因表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo), 且影響水稻的干旱抗性。正常生長條件下,轉(zhuǎn)基因株系與野生型內(nèi)源ABA水平無明顯差異。20% PEG模擬干旱處理水稻幼苗4 h后, 野生型對照和轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)BA水平都顯著上調(diào)(圖3-A)。與野生型相比, 干旱處理后過量表達(dá)株系OE-5積累了更多的ABA, 達(dá)到301.8 ng g–1FW, 為野生型的1.2倍, 而干涉株系RNAi-3的ABA含量僅為野生型的70% (圖 3-A), 這與轉(zhuǎn)基因株系中基因的表達(dá)水平正相關(guān)。

圖1 水稻OsNCED基因家族組織特異性表達(dá)和幼苗干旱脅迫響應(yīng)分析

A:基因組織特性表達(dá); B:基因干旱脅迫響應(yīng); C: 干旱脅迫下ABA含量變化。

A: expression patterns ofgenes in different tissues; B: expression patterns ofgenes subjecting to drought stress; C: ABA contents under drought stress.

圖2 水稻OsNCED3基因轉(zhuǎn)基因株系抗旱性分析

A: 轉(zhuǎn)基因株系基因表達(dá)分析; B:轉(zhuǎn)基因株系抗旱性分析; C:轉(zhuǎn)基因株系干旱處理后存活率。** 差異顯著(<0.01)

A: relative expressions ofgene in RNAi and overexpression lines; B: performance of WT control andtransgenic lines after soil drought stress and re-watering; C: survival rate of rice seedlings after rewatering. ** Significantly different (<0.01).

干旱處理后,過量表達(dá)株系OE-5丙二醛(MDA)含量的增加低于野生型, 而株系高于野生型(圖3-B)。同時,株系提高了水稻的抗氧化酶活性, 干旱脅迫下其SOD、POD和CAT活性均高于野生型對照, 與此相反,株系的POD活性則明顯低于野生型(圖3-C)。這些結(jié)果暗示轉(zhuǎn)基因株系通過內(nèi)源ABA水平的變化, 調(diào)節(jié)了抗氧化酶活性, 影響其對干旱脅迫的耐受性。

2.4 水稻OsNCED3轉(zhuǎn)基因株系干旱脅迫下干旱響應(yīng)基因表達(dá)分析

分析了ABA和干旱響應(yīng)基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá), 包括() (Loc_Os06g03670)、(Loc_Os11g26760、Loc_Os01g50700)和() (Loc_Os01g50910、Loc_Os04g49980、Loc_Os05g46480)。20% PEG模擬干旱處理4 h后, 野生型和轉(zhuǎn)基因株系的干旱響應(yīng)基因表達(dá)量顯著上調(diào)(圖 4)。與野生型對照相比, 過量表達(dá)株系OE-5中基因表達(dá)水平明顯更高, 而干涉株系RNAi-3上調(diào)幅度小于野生型(圖4), 表明轉(zhuǎn)基因株系通過內(nèi)源ABA水平的變化, 影響了下游干旱響應(yīng)基因的表達(dá), 植物細(xì)胞脫水保護蛋白Dehydrin和LEA的積累, 在抵御干旱脅迫中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

在已研究報道的植物中, 絕大多數(shù)NCED均由多基因家族編碼, 每個基因都有特異的組織表達(dá)或者環(huán)境響應(yīng)模式, 對植物正常生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[10]。比如擬南芥有5個基因、、、和[11],基因表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo), 主要負(fù)責(zé)逆境條件下ABA的生物合成[12-13];和9參與種子ABA生物合成, 控制種子的發(fā)育、休眠與萌發(fā)[14];和均具有組織特異性表達(dá), 但其生理功能尚不清楚。水稻亦含有5個基因, 其中在水稻葉片中表達(dá),在葉鞘和莖中表達(dá),在穗中表達(dá)(圖 1-A)。本研究發(fā)現(xiàn), 在5個基因中, 僅基因表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)(圖1-B), 暗示其可能是逆境條件下ABA的生物合成關(guān)鍵基因。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炦M一步證明, 正常水分條件下, 過量表達(dá)株系基因表達(dá)量是野生型的3~10倍, 而ABA含量無顯著提高(圖2-A, 圖3-A), 可能的解釋是基因在一定范圍內(nèi)屬于本底表達(dá), 表達(dá)量的小幅度上調(diào)對NCED酶活性和ABA含量的影響不大。干旱脅迫下, 過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株顯著增加了葉片ABA含量及水稻抗旱性(圖2-B, 圖3-A); 而下調(diào)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下積累的ABA水平低于野生型, 表現(xiàn)為干旱敏感(圖2-B, 圖3-A), 這些數(shù)據(jù)表明基因調(diào)控了干旱條件下ABA含量的變化和水稻抗旱性。

ABA是一種重要的逆境響應(yīng)激素, 干旱誘導(dǎo)的ABA積累同時也是觸發(fā)活性氧信號和積累的前提, 微量活性氧產(chǎn)生是植物適應(yīng)逆境的一種手段, 起到信號分子的作用, 誘導(dǎo)植物抗氧化系統(tǒng)的啟動以及逆境響應(yīng)基因的表達(dá), 而過量產(chǎn)生的活性氧則對植物細(xì)胞產(chǎn)生氧化傷害[15]。丙二醛是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一, 可衡量逆境下膜脂過氧化的程度和傷害程度[16]?？寡趸笇η宄蛎{迫產(chǎn)生的過量活性氧、調(diào)節(jié)活性氧的平衡發(fā)揮重要作用[17]。本研究中, 過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系在干旱環(huán)境下其丙二醛含量相對較低, 而抗氧化酶SOD、POD和CAT活性則高于野生型, 對清除干旱脅迫產(chǎn)生的過量活性氧發(fā)揮重要作用(圖4)。脫水素蛋白(Dehydrin)和胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(LEA)是重要的逆境響應(yīng)蛋白, 其過量積累可顯著提高植物抗逆性[18-19]。的過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系中和的大量表達(dá), 提高了轉(zhuǎn)基因株系的干旱抗性(圖5)。

表2 水稻OsNCED3基因轉(zhuǎn)基因株系干旱脅迫下生物量

采用Duncan’s multiple range test方法分析, 同一列不同字母表示顯著性差異(<0.05,=5)。

Means followed by different letters differ significantly at< 0.05 according to Duncan’s multiple range test.

圖3 水稻OsNCED3基因轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)BA、MDA含量和抗氧化酶活性

A: ABA含量分析; B: MDA含量分析; C: 抗氧化酶活性分析。**差異顯著(<0.01)。

A: ABA contents analysis; B: MDA contents analysis; C: Antioxidant enzyme activities analysis.**Significantly different (<0.01).

圖4 水稻OsNCED3基因轉(zhuǎn)基因株系干旱響應(yīng)基因表達(dá)分析

4 結(jié)論

的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo), 且與內(nèi)源ABA含量呈一致變化趨勢。與野生型對照相比, 過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫下有較高的ABA水平, 抗氧化酶SOD、POD、CAT活性以及逆境響應(yīng)蛋白基因和的表達(dá)升高,水稻抗旱性增強。而抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為干旱敏感。因此,是水稻干旱脅迫響應(yīng)基因, 調(diào)節(jié)了干旱環(huán)境下ABA水平和抗逆性。

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ABA Biosynthesis GeneConfers Drought Stress Tolerance in Rice

XU Xue-Zhong, WANG Ting, WAN Wang, LI Si-Hui, and ZHU Guo-Hui*

College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China

NCED (9--epoxycarotenoid dioxygenase), encoded bygene family, is a rate limited enzyme responsible for the ABA biosynthesis in plants. It remains unknown whethergenes are responsible for controlling ABA levels during drought stress in rice. Among the fivegenes, we found thatmRNA level was promptly induced by PEG-mimic drought stress and decreased by re-watering, with a tendency of well consistent with the variation of ABA content. Down-regulating ofgene expression in RNA interference (RNAi)-transgenic plants decreased the total biomass and showed a hypersensitive phenotype subjecting to drought stress, while the overexpression (OE)-transgenic seedlings increased the drought stress tolerance compared with the wild-type (WT). ABA contents in-OE leaves were higher than those in WT, meanwhile,-OE lines also increased the activities of anti-oxidative enzyme including superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT), and expressions of stress/drought-related genes, i.e. dehydrin protein, LEA protein under drought stress.-RNAi lines showed an opposite tendency with the-OE plants. We therefore conclude thatgene plays an important role in controlling ABA level and drought stress resistance in rice.

gene; drought stress; abscisic acid;

2016-11-30;

2017-09-10;

2017-10-27.

10.3724/SP.J.1006.2018.00024

通信作者(Corresponding author):朱國輝, E-mail: ghzhu@scau.edu.cn

E-mail: 2214553605@qq.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31171466, 31570250)和國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2012CB114306)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31171466) and the National Basic Research Program of China (2012CB114306).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171027.1757.020.html