李　捷　陳依春　賀　學　王世華　張景瑜　吳曉軍　張雪偉　姚　歡　巴桑次仁　色里瑪　孫芳云*

(1.西藏民族大學基礎醫(yī)學院生命科學基礎研究實驗室、藏藥篩選實驗室，陜西　咸陽　712082;　2.西藏甘露藏藥股份有限公司，西藏　拉薩　851400)

當歸,藏名當庚,為傘形科植物當歸的干燥根，生長于海拔2800～4900m高寒陰濕的山坡及林緣，《藏醫(yī)百科全書》記載,藥性味辛性涼。據(jù)初步考證西藏當歸分布于林芝、昌都、拉薩、日喀則、那曲等地?！毒е楸静荨酚涊d：當庚清心熱，解毒。藏醫(yī)藥記載，西藏當歸是傳統(tǒng)藏藥，有補血、養(yǎng)血滋補、活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛等作用。

當歸的化學成分主要有多糖類、苯酞類、香豆素類、阿魏酸鈉、黃酮類、揮發(fā)油類化合物及其他成分[1-2]。黃酮類化合物是其主要有效成分之一，黃酮類化合物泛指2個具有酚輕基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物[3]。有研究表明,黃酮類化合物有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、降血脂作用[4]。實驗表明，從當歸中分離到的黃酮類化合物具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌殺菌等作用[5-7]。西藏當歸中是否含有黃酮類物質(zhì)未見報道，我們利用西藏林芝種植當歸根,對其總黃酮含量進行了測定，為進一步研究西藏當歸的藥理作用提供理論依據(jù)。

1　實驗材料

1.1儀器紫外分光光度計(美國PE lambda-25)，電子分析天平(T-214萬分天平)，超聲提取儀(型號HAD-SY-800，長春樂璞科技有限公司)，低溫室不銹鋼藥品柜(SC18CM4門冰箱)。

1.2試劑蘆丁對照品(供UV法含量測定用)：100080-201610，100mg/支，中國食品藥品檢定研究院提供。三氯化鋁：AR，20161008，天津市天力化學試劑有限公司；亞硝酸鈉：分析純，20161020，河南焦作市化工三廠；氫氧化鈉：分析純，西安化學試劑廠；無水乙醇：分析純，20160626，天津市河東區(qū)紅巖試劑廠。

1.3藥材西藏林芝2017年當歸根，由西藏甘露藏藥廠提供。

2　方法與結(jié)果

2.1林芝當歸根總黃酮的提取工藝精密稱取西藏林芝2017年當歸根粗粉1g, 置于500mL圓底燒瓶, 加入75%酒精60mL和玻璃珠少許，浸泡20min后，加熱保持沸騰回流1h，冷卻后抽濾得濾液，濾渣再次加入60mL 75%酒精浸泡20min后沸騰回流1h ，冷卻抽濾，合并兩次濾液。將濾液水浴濃縮至僅剩5mL，轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，用75%酒精稀釋定容至刻度，得樣品提取原液。

2.2對照品溶液的制備精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品28.66mg，置25mL容量瓶中, 用無水乙醇定容。精密量取10.00 mL蘆丁對照品溶液于50mL容量瓶, 用無水乙醇稀釋、定容,搖勻即得蘆丁對照品溶液(0.22928mg/mL)。

2.3測定波長的選擇精密移取對照品溶液2.00mL置25mL容量瓶中,按順序依次加入5%NaNO2溶液1mL，搖勻,放置6min,加10% AlCl3溶液1mL搖勻,放置6min,再加入4% NaOH溶液10mL,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻，放置15min。精密移取蒸餾水2.00mL，同法配制25mL混合溶液作為空白對照,在200～700nm范圍內(nèi)進行掃描,確定蘆丁顯色液的最大吸收波長為509nm。

2.4標準曲線的制備精密移取蘆丁對照品溶液1.00mL， 2.00mL， 3.00mL， 4.00mL，5.00mL， 6.00mL,分別置于25mL容量瓶中，按順序依次加入5%NaNO2溶液1mL，搖勻,放置6min,加10% AlCl3溶液1mL搖勻,放置6 min,再加入4% NaOH溶液10mL,并加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻，放置15min。在波長為509nm處進行檢測，然后以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標繪制標準曲線，最小二乘法直線回歸，得蘆丁回歸方程為:A=13.324·C-0.1253，A 為吸光度，C為質(zhì)量濃度，R2=0.9984，n=5。實驗表明蘆丁在9.17～55.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗精密量取配置好的西藏林芝2017年當歸根樣品溶液2.00mL，其余同2.3項下操作,測定吸光度,重復測定6次,結(jié)果表明,RSD=1.9%,說明該方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗精密量取配置好的西藏林芝2017年當歸根樣品溶液2.00mL，其余同2.3項下操作,每隔15min測定一次吸光度,重復測定6次，結(jié)果表明,樣品吸光度在60min內(nèi)穩(wěn)定，RSD=2.1%，說明該方法穩(wěn)定性良好。

2.7重復性試驗平行取西藏林芝2017年當歸根藥材粉末1g各5份，按2.1項下方法制備樣品原液。精密量取2.00mL，其余同2.3項下操作,測定吸光度,林芝根RSD=2.37%，表明該方法重復性良好。

2.8回收率試驗精密吸取對照品溶液(濃度為0.1mg/mL)0.2mL,0.3mL各2份,置25mL容量瓶中，分別加入已知含量的西藏林芝根(已測得其總黃酮含量為2.53mg/mL)樣品溶液2.00mL,其余按2.3項下進行測定回收率為101.5%，RSD=0.8%，表明該方法科學合理。

3　樣品含量測定結(jié)果

取西藏林芝2017年當歸根藥材粉末1g，按2.1項下方法制備樣品溶液。精密移取林芝根樣品原液2.00mL，其余按2.3項下方法測定吸光度,代入回歸方程中。

樣品中總黃酮含量計算公式：由線性方程A=13.324·C-0.1253得出。西藏林芝2017年當歸根莖中總黃酮的含量測定分別為2.653 mg/g 、2.668 mg/g、2.534 mg/g、2.530 mg/g、2.633 mg/g ，總黃酮均值計算為2.604mg/g。

4　討論

有文獻報道當歸總黃酮提取工藝中，乙醇回流法為當歸總黃酮的最適提取方法[8]。本人利用現(xiàn)有的實驗室條件，以蘆丁標準品為對照，經(jīng)全波長掃描確定最大吸收波長分別為509 nm，在9.17～55.0μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為: A=13.324·C-0.1253, R2=0.9984,n=5, A為吸光度，C為質(zhì)量濃度，總黃酮回收率為101.5%，在該工藝條件下提取林芝當歸總黃酮，得當歸總黃酮含量為2.604mg/g。

本研究采用紫外分光光度法回對西藏林芝當歸根中總黃酮進行測定，方法學考察顯示，該方法顯色穩(wěn)定，重復性、精密度及回收率均達到定量分析的要求，且簡便易行，數(shù)據(jù)較為合理可靠，可用于當歸藥材的日常檢驗和質(zhì)量控制。