李臻　王慶國(guó)　潘教文　劉煒

摘要：本研究以水稻中花11為材料克隆了一個(gè)P450家族基因，命名為OsDWARF48。該基因在水稻中為組成型表達(dá)，在幼胚中的表達(dá)量最高；并且其表達(dá)受到BR的抑制。進(jìn)一步以獲得的基因過(guò)表達(dá)及反義轉(zhuǎn)基因植株為材料，對(duì)株高進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示，OsDWARF48反義轉(zhuǎn)基因株系株高明顯矮于對(duì)照，而過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE3株高明顯高于對(duì)照。通過(guò)對(duì)水稻內(nèi)源生長(zhǎng)素、油菜素內(nèi)酯和赤霉素的含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3種激素在反義轉(zhuǎn)基因株系中含量均下降，在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE3中含量均上升，表明OsDWARF48通過(guò)調(diào)控BR合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而與GA和IAA協(xié)同作用調(diào)控水稻株高。

關(guān)鍵詞：水稻；細(xì)胞色素P450基因OsDWARF48；株高；油菜素內(nèi)酯

中圖分類號(hào)：S511.3+2：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）11-0001-09

Abstract In this research， a P450 family gene named as OsDWARF48 was cloned from rice variety Zhonghua 11. OsDWARF48 was constitutively expressed in various rice tissues and the highest expression was found in immature embryos， and its expression could be inhibited by BR. After the rice lines with over- and anti-sense expression of OsDWARF48 were obtained， the plant height was measured. The height of anti-sense transgenic lines was shorter while that of over-sense transgeinic line OE3 was higher compared to the control. The detection of endogenous BR， IAA and GA in different rice lines showed that their contents decreased in anti-sense transgenic lines with shorter height， but increased in the OE3 line with higher height. The results above indicated that OsDWARF48 might control the plant height of rice by regulating the synthesis and signal transduction pathways of BR and further synergy with GA and IAA.

Keywords Rice； Cytochrome P450 gene OsDWARF48； Plant height； BR

株高是水稻株型的主要決定因素，同時(shí)也是重要的農(nóng)藝性狀，直接關(guān)系到水稻的收獲指數(shù)和增產(chǎn)潛力，過(guò)高易引起莖稈的倒伏造成減產(chǎn)。20世紀(jì)50年代研究者們發(fā)現(xiàn)水稻半矮稈基因sd1并進(jìn)行廣泛應(yīng)用，其通過(guò)降低株高使水稻單產(chǎn)提高20%～30%，被稱為“第一次綠色革命”，如今仍作為株高重要的調(diào)控基因被應(yīng)用于育種中[1]。但是攜帶sd1的材料具有抗旱性差、光合效率低等缺點(diǎn)，也成為制約水稻新品種選育的瓶頸[2]。因此繼續(xù)挖掘水稻矮化新品種，開(kāi)展株高相關(guān)基因定位及功能研究，對(duì)水稻育種和生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

水稻莖稈的生長(zhǎng)發(fā)育受多種因素影響，其中植物激素、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期、微管及微絲的排列、細(xì)胞壁合成、光合產(chǎn)物合成及轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因都具有重要作用[3-5]。對(duì)水稻中調(diào)控株高相關(guān)基因的功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)與赤霉素（gibberellin， GA）、油菜素內(nèi)酯（brassinolide， BR）及生長(zhǎng)素（auxin， IAA）的代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)：除了直接參與激素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因，如GA合成及信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因d18、d35、OsGA20ox1、OsKS1、SLR1，BR合成及信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因D2、d11、brd2、OsBRI1等[6，7]；還有部分基因能夠通過(guò)調(diào)控激素的合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響水稻株高，如NAC轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2通過(guò)調(diào)控水稻GA信號(hào)通路關(guān)鍵基因OsSEATB和OsKAO的表達(dá)，影響GA的積累從而負(fù)調(diào)控水稻株高[8]；受體激酶LRK1基因下調(diào)OsKO2的表達(dá)，通過(guò)限制GA的合成調(diào)控水稻節(jié)間伸長(zhǎng)[9]。以上研究顯示激素在調(diào)節(jié)水稻株高中起主導(dǎo)作用。

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）是一類血紅素蛋白，屬于單加氧酶超家族，其主要功能是催化有機(jī)化合物的氧化還原反應(yīng)，因其最低能量吸收峰在450 nm處而得名。1958年，Kligenberg 和 Gerfinkel 首次在大鼠肝微粒體中報(bào)道了該基因，現(xiàn)已證明其存在于細(xì)菌以及動(dòng)植物的各個(gè)組織中[10]。CYP450通過(guò)N端的疏水序列錨定在膜上，屬于膜定位蛋白，在真核細(xì)胞中主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上。作為一種末端加氧酶參與包括植物激素、信號(hào)分子、黃酮類、甾醇類、萜類等多種初級(jí)和次級(jí)合成及代謝反應(yīng)[11，12]，同時(shí)在植物響應(yīng)生物、非生物脅迫[13，14]及植物除草劑抗性[15，16]等方面具有重要作用。水稻中含有47個(gè)CYP450家族，其中部分基因的功能獲得解析，如DSS1編碼細(xì)胞色素氧化酶CYP96B4家族成員，通過(guò)協(xié)調(diào)GA和ABA平衡，介導(dǎo)水稻生長(zhǎng)以及脅迫應(yīng)答，同時(shí)可能還在脂類代謝中發(fā)揮作用[17]；CYP78A13能促進(jìn)細(xì)胞增殖，有增加株高并提高籽粒產(chǎn)量的潛力[18]；過(guò)表達(dá)CYP71Z2能夠持續(xù)且穩(wěn)定提高水稻對(duì)白葉枯病菌（Xoo）的抗性，而CYP71Z2-RNAi株系與野生型一致，對(duì)Xoo的抗性沒(méi)有明顯差異[19]。截至目前，大部分CYP450的基因功能還沒(méi)有獲得研究。

本課題組前期在水稻黑條矮縮病相關(guān)基因數(shù)字表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，鑒定到一個(gè)表達(dá)明顯上調(diào)的基因，功能注釋為CYP450基因， KEGG預(yù)測(cè)其參與油菜素內(nèi)酯合成過(guò)程。本研究克隆了該基因，并將其命名為OsDWARF48（LOC_Os04g48200），BLAST分析顯示，該基因編碼蛋白為CYP450家族CYP87A3樣蛋白，其表達(dá)受油菜素內(nèi)酯的抑制，推測(cè)其可能參與油菜素內(nèi)酯的合成或代謝過(guò)程。其反義及過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中，部分水稻株高發(fā)生變化，并與轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)源油菜素內(nèi)酯含量及相關(guān)基因的變化呈一定相關(guān)性。本研究結(jié)果對(duì)于水稻株型改造及品質(zhì)改良具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水稻中花11種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

大腸桿菌DH5ɑ購(gòu)自Transgen公司（山東濟(jì)南雨同生物科技有限公司）；農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa（日本）公司；植物雙元表達(dá)載體p1301-bar-UBI由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫孚江教授惠贈(zèng)，該載體是以pCAMBIA1301為骨架改造而成，含有除草劑Basta抗性基因bar和單子葉植物Ubiqutin啟動(dòng)子。

1.2 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照TransZol Plant 試劑盒（Code： ET101-01，購(gòu)自Transgen公司）說(shuō)明書(shū)提取水稻組織總RNA，并參照TaKaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A） 試劑盒說(shuō)明書(shū)將檢測(cè)合格的RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3 OsDWARF48基因克隆及生物信息學(xué)分析

以反轉(zhuǎn)錄的水稻葉片單鏈cDNA為模板，根據(jù)OsDWARF48核苷酸序列（NCBI登陸號(hào)：XP_015635235.1），設(shè)計(jì)并合成特異性引物L(fēng)DWARF48，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：94℃ 10 min；94℃ 45 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將獲得的DNA片段連入克隆載體pMD-18T中，經(jīng)酶切鑒定后，陽(yáng)性質(zhì)粒由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測(cè)序室進(jìn)行序列測(cè)定。利用水稻基因組注釋網(wǎng)站Rice Genome Annotation Project （http：//rice.plantbiology.msu.edu）對(duì)OsDWARF48的基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白基本信息進(jìn)行分析。

1.4 OsDWARF48表達(dá)模式分析

分別提取生長(zhǎng)4周水稻幼苗的葉片、莖稈、根以及花、未成熟胚和成熟種子的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsDWARF48基因在不同組織器官中的表達(dá)模式。

用10 μmol/L油菜素內(nèi)酯處理生長(zhǎng)2周的水稻幼苗，在0、2、6、12 h分別取材提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsDWARF48基因?qū)R的響應(yīng)模式，所用引物為qACTIN和qDWARF48，引物序列見(jiàn)表1。

1.5 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

選取測(cè)序正確且正向連接的克隆載體pMD18T-OsDWARF48-O和反向連接的克隆載體pMD18T-OsDWARF48-R，用PstⅠ和SamⅠ分別雙酶切含有目的基因的這兩個(gè)克隆載體以及植物雙元表達(dá)載體p1301-bar-UBI，切膠回收目的基因片段和線性化的植物表達(dá)載體，經(jīng)T4 ligase連接，將酶切鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pCA1301-bar-OsDWARF48-O和pCA1301-bar-OsDWARF48-R。構(gòu)建成功的植物雙元表達(dá)載體用熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，侵染水稻愈傷組織，用10 mg/L的PPT進(jìn)行3次抗性篩選，經(jīng)誘導(dǎo)及分化獲得轉(zhuǎn)基因組培苗。

轉(zhuǎn)基因苗在土中生長(zhǎng)至6葉期，用濃度為0.2%的Basta溶液涂抹葉片進(jìn)行抗性篩選。篩選出的陽(yáng)性苗，提取其葉片DNA，利用LDWARF48上游引物與Nos下游引物組合檢測(cè)正義過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；利用LDWARF48下游引物與Nos下游引物組合檢測(cè)反義轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，引物序列見(jiàn)表1。獲得確定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)多代篩選獲得T3代純合株系。

1.6 株高測(cè)定

水稻幼苗株高測(cè)定是以水培兩周的植株為材料，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為從莖基部到最上面葉片頂端；成熟期水稻株高測(cè)定是以生長(zhǎng)到抽穗期的水稻為材料，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)是從莖基部至穗頂部的長(zhǎng)度；每株重復(fù)測(cè)量3次，取3次平均值為該株的株高，每個(gè)株系測(cè)量15株。結(jié)果用SPSS（23.0）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.7 水稻內(nèi)源油菜素內(nèi)酯、生長(zhǎng)素、赤霉素含量的測(cè)定

取生長(zhǎng)兩周的對(duì)照及轉(zhuǎn)基因水稻葉片材料0.2 g，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）分別測(cè)定水稻葉片中BR、GA、IAA含量。為減少試驗(yàn)誤差，每一個(gè)材料取10株混樣，并設(shè)定3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，該試驗(yàn)委托北京北農(nóng)天一生物技術(shù)有限公司完成。結(jié)果用SPSS（23.0）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)基因D2、D11、OsBR6ox、OsBRI1、OsBZR1和OsBAK1的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，重點(diǎn)對(duì)油菜素內(nèi)脂合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定，基因及引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)在ABI PRISM 7900 HT（Applied Biosystems）熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，方法參照FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及生物信息學(xué)分析

本研究以水稻品種中花11單鏈cDNA為模板，利用引物L(fēng)DWARF48克隆水稻CYP450家族基因OsDWARF48。該基因全長(zhǎng)為1 449 bp，含有9個(gè)外顯子，編碼483個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示：該基因編碼蛋白分子量為55.09 kD，等電點(diǎn)為8.47，負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）52，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）55，不穩(wěn)定系數(shù)41.76，是一種不穩(wěn)定蛋白。該蛋白含有1個(gè)P450保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)跨膜區(qū)，序列前端沒(méi)有信號(hào)肽。與已知功能的水稻（Oryza sativa L.）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的CYP450蛋白進(jìn)行序列比對(duì)顯示OsDWARF48編碼蛋白含有CYP450的典型基序（圖1）。BLAST結(jié)果顯示，OsDWARF48編碼CYP87A3樣蛋白，與谷子（Setaria italica）中CYP87A3蛋白序列相似性較高（圖2）。

2.2 OsDWARF48在水稻不同組織中的表達(dá)模式

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析基因OsDWARF48的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，OsDWARF48為組成型表達(dá)。以該基因在根中的相對(duì)表達(dá)量為參照，其在幼胚中的表達(dá)量相對(duì)較高，約是根中的90倍；其次在種子和莖中的表達(dá)量也較高，分別是根中表達(dá)量的11.22倍及7.73倍；而在花和葉中的表達(dá)量相對(duì)較低（圖3）。

2.3 OsDWARF48誘導(dǎo)表達(dá)模式

水稻幼苗經(jīng)BR處理后，隨著處理時(shí)間增加，OsDWARF48的表達(dá)量逐漸下降，處理2 h的相對(duì)表達(dá)量為0.84；處理6 h時(shí)表達(dá)明顯下調(diào)，為未處理時(shí)的29%，隨處理時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，其相對(duì)表達(dá)量一直維持在較低水平（圖4）。

2.4 轉(zhuǎn)基因株系的獲得

轉(zhuǎn)基因組培苗，經(jīng)繼代、Basta（購(gòu)自日本農(nóng)藥株式會(huì)社公司）抗性篩選及PCR鑒定，最終獲得2個(gè)純合反義株系（AS1、AS2）和3個(gè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（OE1、OE2、OE3）。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系中OsDWARF48基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，反義及正義轉(zhuǎn)基因株系幼苗中該基因的表達(dá)量都有不同程度的提高（圖5），說(shuō)明基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到水稻品種中花11中。

2.5 水稻株高測(cè)定結(jié)果

對(duì)生長(zhǎng)2周的幼苗以及田間灌漿成熟期的水稻株高進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)在幼苗期反義轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)S1、AS2的株高分別為10.29、10.84 cm，分別為對(duì)照株高的73.87%和77.82%；在田間灌漿成熟期AS1、AS2的株高分別為106.88 cm和107.51 cm，分別為對(duì)照株高的92.98%和93.54%。統(tǒng)計(jì)分析顯示在幼苗期和成熟期AS1、AS2株高均與對(duì)照相比差異顯著，幼苗期差異更加明顯。幼苗期過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE3株高為16.66 cm，為對(duì)照的119.60%；田間灌漿成熟期OE3株高為123.6 cm，為對(duì)照的107.53%。統(tǒng)計(jì)分析顯示在幼苗期和成熟期OE3株高均與對(duì)照相比差異顯著，幼苗期差異更加明顯。綜上所述，反義轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)S1、AS2的株高低于對(duì)照且差異顯著，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE3株高高于對(duì)照也差異顯著，而OE1和OE2的株高與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異（圖6）。

2.6 水稻幼苗內(nèi)源激素含量

利用ELASA方法測(cè)定轉(zhuǎn)基因各株系及對(duì)照植株中內(nèi)源BR、IAA和GA含量。其中BR含量在反義轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)S1、AS2中分別比對(duì)照低2.29 ng/gFW和1.61 ng/gFW；在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中均有升高，且在OE3中比對(duì)照高2.22 ng/gFW；統(tǒng)計(jì)分析顯示AS1、AS2及OE3中的含量與對(duì)照相比差異顯著。而GA和IAA含量除在OE3中略有升高外，其它株系中含量比對(duì)照均有不同程度下降，且含量與對(duì)照相比差異顯著（圖7）。

2.7 不同水稻株系中BR合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)變化分析

以對(duì)照及轉(zhuǎn)基因水稻株系為材料，應(yīng)用熒光定量方法對(duì)BR合成相關(guān)基因D2、D11、OsBR6ox以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因OsBRI1、OsBZR1、OsBAK1的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE3中，D2、D11、OsBR6ox、OsBRI1、OsBZR1及OsBAK1表達(dá)均上調(diào)，分別為對(duì)照植株的3.01、2.28、2.22、3.22、3.65、1.11倍。轉(zhuǎn)基因株系OE1及OE2中BR合成相關(guān)基因OsBR6ox及OsBZR1表達(dá)上調(diào)，OsBR6ox表達(dá)量分別為對(duì)照的2.8倍和5.33倍，OsBZR1表達(dá)量分別為對(duì)照的2倍和1.38倍，其他基因變化不明顯。反義轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)S1和AS2中OsBR6ox表達(dá)上調(diào)，分別為對(duì)照的1.86倍和2.53倍；D2、OsBZR1及OsBAK1表達(dá)下調(diào)，D2表達(dá)量為對(duì)照的63%和41%，OsBZR1為對(duì)照的82%和55%，OsBAK1表達(dá)量為對(duì)照的59%和50%，其他基因變化不明顯（圖8）。

3 討論與結(jié)論

水稻株高作為重要的農(nóng)藝性狀之一，其研究一直備受國(guó)內(nèi)外同行關(guān)注。水稻黑條矮縮病作為病毒性病害，可導(dǎo)致植株極度矮化、結(jié)實(shí)率降低甚至不育，嚴(yán)重影響水稻生產(chǎn)。我們?cè)趯?duì)感病材料進(jìn)行高通量測(cè)序及表達(dá)譜分析基礎(chǔ)上，篩選到一個(gè)表達(dá)差異基因OsDWARF48（LOC_Os04g48200），在感病材料中其表達(dá)明顯上調(diào)（Log2Ratio=8.28），KEGG分析將該基因歸為油菜素內(nèi)酯合成途徑。

OsDWARF48基因編碼蛋白序列分析顯示，其含有典型的CYP450保守序列，包括在C末端含有血紅素結(jié)合區(qū)域（FXXGXRXCXG），這個(gè)區(qū)域在所有CYP450蛋白家族中高度保守并且被作為鑒定CYP450蛋白的主要特征[20，21]；其還有與氧結(jié)合和激活相關(guān)的PXRX區(qū)域以及EXXR區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域?qū)τ诠潭ㄑt素和維持蛋白核心結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是必須的[22]；其N末端含有一個(gè)跨膜區(qū)，顯示該蛋白為膜結(jié)合蛋白，緊鄰此區(qū)域有一段富含脯氨酸（Pro）的區(qū)域，該區(qū)域存在于所有典型的CYP450蛋白中[23]。結(jié)構(gòu)分析表明OsDWARF48基因編碼典型的CYP450蛋白。同源比對(duì)分析顯示，OsDWARF48編碼蛋白與CYP87A3同源性較高，為CYP87A3樣蛋白。

OsDWARF48具有組成型的表達(dá)模式，顯示該基因在植物生長(zhǎng)各階段，尤其是植物胚的形成及發(fā)育中發(fā)揮作用。結(jié)合OsDWARF48編碼蛋白與水稻中參與生長(zhǎng)素響應(yīng)的OsCYP87A3蛋白具有一定的序列同源性[24]，推測(cè)OsDWARF48可能通過(guò)對(duì)植物激素產(chǎn)生響應(yīng)從而行使功能。BR處理下OsDWARF48的表達(dá)受到明顯抑制，顯示該基因可能受BR的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。以往研究表明，許多BR合成相關(guān)基因如D2、CYP90C1/D11、OsDWARF4等也受到BR的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[25-27]。說(shuō)明BR在植物體內(nèi)存在較精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)BR含量過(guò)高時(shí)，植物一方面通過(guò)代謝途徑降解部分BR，另一方面則通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制降低BR合成速率，從而達(dá)到維系植物體內(nèi)激素含量動(dòng)態(tài)平衡的目的[28]。

以往報(bào)道BR缺失突變體均表現(xiàn)為株高降低，并可通過(guò)外施BR得以部分恢復(fù)。如OsDWARF4參與水稻BR合成，其突變體株高略矮于對(duì)照[27]。OsBR6ox編碼BR-6氧化酶，該酶突變后導(dǎo)致莖稈嚴(yán)重矮化，株高只有10～30 cm[29]。D11編碼BR生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶，其突變會(huì)引起植株矮化，而過(guò)表達(dá)該基因則表現(xiàn)為籽粒變大，產(chǎn)量提高[30]。本研究中，OsDWARF48反義轉(zhuǎn)基因株系株高降低，檢測(cè)顯示OsDWARF48基因表達(dá)下調(diào)，其內(nèi)源BR、GA和IAA含量均降低，水稻莖的伸長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致水稻變矮；但過(guò)表達(dá)株系OE1和OE2的株高并未發(fā)生明顯變化，對(duì)比其內(nèi)源激素含量發(fā)現(xiàn)，OE1和OE2中只有BR含量增加，而GA和IAA含量降低；而在過(guò)表達(dá)株系OE3中BR、GA和IAA含量均增加，株高也顯著高于對(duì)照。綜合以上結(jié)果，顯示轉(zhuǎn)基因水稻株高是由BR、IAA和GA協(xié)同控制的，BR在其中可能起到主導(dǎo)作用。

BR合成及代謝等過(guò)程均對(duì)內(nèi)源BR含量產(chǎn)生影響，而基因的表達(dá)變化對(duì)相應(yīng)生物學(xué)過(guò)程具有重要調(diào)控作用。以往報(bào)道BZR1在BR、IAA和GA的交互反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，BZR1能夠與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控元件ARF結(jié)合，調(diào)控其下游多個(gè)基因的表達(dá)[31]。在擬南芥中的研究證明，BR首先通過(guò)抑制GSK3類激酶負(fù)調(diào)控子部分激活BZR1轉(zhuǎn)錄因子的活性從而刺激GA合成，GA水平升高導(dǎo)致另一負(fù)調(diào)控子DELLA蛋白的降解，從而進(jìn)一步激活BZR1活性調(diào)控基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)；在水稻中BR通過(guò)調(diào)控GA合成和代謝調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)，但是具體機(jī)制還不清楚[32，33]。

本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照中BR合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)分析顯示，OsDWARF48過(guò)表達(dá)水稻中OsBZR1表達(dá)上調(diào)，而在反義轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)略有下降。OsBR6ox在反義和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)均上調(diào)，該基因作為BR合成關(guān)鍵基因，調(diào)控內(nèi)源BR的含量，該基因缺失會(huì)導(dǎo)致植株嚴(yán)重矮化。推測(cè)由于BR合成及代謝相關(guān)OsBZR1、OsBR6ox等基因的變化，導(dǎo)致生長(zhǎng)素、赤霉素信號(hào)途徑發(fā)生改變，從而引起內(nèi)源生長(zhǎng)素、赤霉素含量變化，對(duì)水稻株高產(chǎn)生影響，具體調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步解析。

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