李超

（四川省新獸藥工程技術(shù)研究中心，四川 溫江 611130）

猴耳環(huán)為含羞草科猴耳環(huán)屬植物，又名落地三錢、蛟龍木、雞三樹、圍涎樹，其葉、果實(shí)、種子均可入藥，主要分布于我國華南、西南地區(qū)，民間用于燒傷、燙傷的治療。現(xiàn)代臨床主要用于治療上呼吸道感染、急性胃腸炎、急性咽喉炎、急性扁桃體炎，亦可用于細(xì)菌性痢疾[1]。本文對猴耳環(huán)的提取和抑菌效果進(jìn)行了研究，旨在為新獸藥產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SWCJ-1F型超凈工作臺，HH-B11型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器。

1.2 藥材 猴耳環(huán)，購自成都荷花池中藥材專業(yè)市場。

1.3 試驗(yàn)菌株 細(xì)菌包括大腸桿菌、金色葡萄球菌、沙門氏桿菌，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 猴耳環(huán)的提取

2.1.1 正交試驗(yàn) 以提取液中沒食子酸含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方案（表1），選取加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為考察因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，對猴耳環(huán)的提取工藝進(jìn)行篩選。

表1 因素水平表

2.1.2 猴耳環(huán)提取方法 根據(jù)正交試驗(yàn)所確定的最佳提取工藝，將猴耳環(huán)放入粉碎機(jī)中粉碎，精密稱取100g，加入適量的蒸餾水，回流提取，將水煮液進(jìn)行抽濾，濾液濃縮至100mL，即得樣品液。

2.2 體外抑菌試驗(yàn)

2.2.1 菌懸液制備 將供試菌（大腸桿菌、沙門氏桿菌、金色葡萄球菌）菌種接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，挑取單個(gè)菌落接種于新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法，用肉湯稀釋菌懸液濃度至含菌體約 1×105～1×106CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 體外抑菌活性測定 采用管碟法進(jìn)行測定。取制備的菌懸液0.1mL分別放入營養(yǎng)瓊脂平板，用L棒涂布均勻，放入牛津杯，使其與培養(yǎng)基接觸良好，以無菌生理鹽水作陰性對照。每個(gè)牛津杯加入藥液0.1mL，然后將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，取出，測定抑菌圈大小并記錄結(jié)果。

抑菌效果判定：抑菌圈直徑＞20mm為極敏感，15～20mm為高度敏感，10～15mm之間為中度敏感，抑菌圈直徑＜10mm為低度敏感。

2.2.3 MIC值測定 取已編號的滅菌試管5支，分別在1～5號試管中各加營養(yǎng)肉湯2mL，然后吸猴耳環(huán)提取液2mL于1號試管，采用倍比稀釋法稀釋至5號管（將藥液依次稀釋成1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的不同濃度），搖勻后棄去2 mL，各管最終體積為2 mL，其生藥含量分別為 500、250、125、62.5、31.25mg/mL。然后在各試管中加入細(xì)菌菌懸液0.05mL，于37℃培養(yǎng)18～24h，肉眼觀察未渾濁的試管記為MIC值。

3 結(jié)果

3.1 最佳提取工藝 由表2可知，加水量為主要影響因素，次數(shù)和時(shí)間為次要影響因素，最佳組合為A2B3C3，即加水量30倍，提取2h，提取2次。

3.2 體外抑菌活性測定 結(jié)果見表3。

3.3 MIC值測定結(jié)果 猴耳環(huán)提取物對大腸桿菌的MIC值為500 mg/mL，對金色葡萄球菌的MIC值為125mg/mL，對沙門氏桿菌的MIC值為250mg/mL（見表 4）。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 猴耳環(huán)提取液的體外抑菌活性 mm

表4 猴耳環(huán)提取液對細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC值）mg/mL

4 小結(jié)

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，猴耳環(huán)的有效成分和指標(biāo)性成分已基本明確，沒食子酸含量可作為藥材和制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)，經(jīng)過反復(fù)預(yù)試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)、加水量、提取時(shí)間是主要影響因素，因此將這3個(gè)主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，猴耳環(huán)最佳提取工藝為加水量30倍，提取2h，提取2次，該提取工藝簡單，值得推薦。

猴耳環(huán)提取液對常見的金色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏桿菌均有較強(qiáng)的抑殺作用，然而限于實(shí)驗(yàn)室條件，沒有對其抗菌譜進(jìn)行全面研究。本試驗(yàn)證明，猴耳環(huán)具有較好的抑菌作用，有作為藥物開發(fā)的應(yīng)用前景。

[1] 李藥蘭，李克明，蘇妙賢，等.猴耳環(huán)抗病毒有效成分研究[J].中國中藥雜志，2006，31（5）：397-399.

[2] 張志堅(jiān)，李鏡友，李國強(qiáng).猴耳環(huán)研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2010，19（18）：82-83.

[3] 陳軍，羅德珍，李鏡友，等.高效液相色譜雙波長法同時(shí)測定猴耳環(huán)消炎片中沒食子酸和槲皮苷含量[J].中國藥業(yè)，2015，24（21）：129-130.