胡瑞云，沈石妍，王智能，楊柳，李艷芳，郭家文，應(yīng)雄美

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南 開遠661699）

甘蔗是我國最主要的糖料作物之一，含有豐富的營養(yǎng)成分。蔗莖含有15%～25%蔗糖分（對蔗汁），蔗汁中含有0．20%～0．32%（對蔗汁干固物）蛋白質(zhì)（有蛋白質(zhì)、氨基酸及酰胺等）總含量，主要以谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸等存在；其中還含有多達30多種的無機物元素，主要是鉀、鈉、鎂、鈣、硅、磷、硫、氯等；總有機酸含量0．05%～0．15%（占甘蔗總量）的烏頭酸、蘋果酸、草酸、檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸等無氮有機酸；色素類主要有：葉綠素、蔗黃素、胡蘿卜素及花青苷等色素，約0．17%。甘蔗中的多酚類物質(zhì)主要是蔗節(jié)中的花青苷中的酚羥、甘蔗纖維中的蔗黃素以及原兒茶酸衍生出來的單寧[1-2]。

甘蔗中已被鑒定的酚類物質(zhì)有20多種低分子量的酚酸、黃酮類物質(zhì)以及一些高分子量的聚合物（如單寧）。近年來天然抗氧化劑—多酚類化合物的抗氧活性得到多方的關(guān)注，這類物質(zhì)既可用作為食品添加劑使用，又對人體有良好的保健功能，如能夠預(yù)防心腦血管疾病，消除人體過多的自由基、抗癌、抗衰老、提高機體的免疫力[3]。Tesfaye等[4]研究發(fā)現(xiàn)甘蔗原汁中的非糖提取物具有較高的抗氧化活性，抗氧化活性成分主要是一些多酚類物質(zhì)。涂斌等[5]研究表明，多酚以大量的酚羥基作為氫供體，對多種活性氧起消除作用，使其具有抗氧化能力。鄭鳳錦等[2]研究認為：甘蔗果酒和甘蔗原醋對DPPH·、·OH、O2·均有較強的清除作用，且隨樣品體積的增加而逐漸增強，清除率均高于Vc和沒食子酸，同時對NO2-也有一定的清除作用，對金屬離子有良好的螯合作用，可作為新型保健產(chǎn)品進行開發(fā)。

目前測定多酚的常用方法有分光光度法、液相色譜法、滴定法、紅外吸收光譜法、電化學(xué)分析法和分光光度法（包括紫外分光光度法、原子吸收分光光度法等）。其中，高錳酸鉀滴定法的滴定終點較難觀察，測定靈敏度較低；香草醛法和鐵氰化鉀可見分光光度法對測定條件要求嚴格，穩(wěn)定性較差，干擾因素較多，易出現(xiàn)沉淀；液相色譜法通常是對單個或多個具體組分進行定性和定量，對復(fù)雜多酚組成的總酚含量無法測定[6-8]。

本實驗擬采用Folin-Ciocalteu比色法（F-C法）、Folin-Denis比色法（F-D法）及紫外分光光度法3種測定方法[3，8-14]進行比較，考察最適宜的測定方法，為甘蔗果酒多酚測定方法的準確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

甘蔗果酒，云南省農(nóng)科院甘蔗研究所開發(fā)產(chǎn)品；沒食子酸、磷鉬酸、茶多酚，山東亞西化學(xué)股份有限公司；無水碳酸鈉，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；鎢酸鈉，天津市化學(xué)試劑四廠；磷酸，天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；UV-5800 PC紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；F-C顯色劑，上海源葉生物科技有限公司。

F-D顯色劑配制：依次加入50g鎢酸鈉、10g磷鉬酸、375mL水、85%磷酸25mL于燒瓶中，水浴回流2h，冷卻后定容500mL棕色瓶中保存。

1.2 方法

1.2.1 F-C法測定多酚含量 F-C法是F-D法的改進方法，是基于多酚羥基結(jié)構(gòu)具有較強的還原性，可以通過它還原一些金屬離子，利用金屬離子可與有機試劑發(fā)生絡(luò)合顯色反應(yīng)而間接地測定多酚的含量。是利用顯色劑F-C試劑的鎢鉬酸將多酚化合物定量氧化，自身被還原（W6+變?yōu)閃5+）生成藍色的化合物，反應(yīng)液顏色的深淺與多酚含量呈正相關(guān)的比色測定方法[14]，Na2CO3溶液是顯色的支持介質(zhì)。通過前期的預(yù)實驗得到F-C試劑最佳顯色方案為：吸取樣液適量，加入1．5mL F-C試劑于25mL容量瓶中，加入10%Na2CO3溶液2mL，加純水定容至25mL，放置60min，以試劑空白為參比，在最大吸收波長處測定吸光度，依據(jù)標準曲線計算試樣中的總多酚含量。

1.2.2 F-D法測定多酚含量 F-D法也是基于堿性條件下利用顯色劑F-D試劑與酚類化合物反應(yīng)顯色的比色測定方法，Na2CO3溶液是顯色的支持介質(zhì)。通過預(yù)實驗得到的F-D試劑最佳顯色方案為：吸取樣液適量，加入2．5mL F-D試劑于25mL容量瓶中，加入飽和Na2CO3溶液2mL，50℃水浴10min，加純水定容至25mL，有少許混濁，濾紙過濾，以試劑空白為參比，在最大吸收波長處測定吸光度，依據(jù)標準曲線計算試樣中的總多酚含量。

1.2.3 紫外分光光度法測定多酚含量 紫外分光光度分析法是基于多酚的不飽和結(jié)構(gòu)，在320～380 nm（吸收帶I）和200～270 nm（吸收帶Ⅱ）兩個區(qū)域有深度吸收峰[15]，該吸收峰的峰值與多酚類物質(zhì)的含量正相關(guān)，因此，可通過測定吸光度值來計算多酚類物質(zhì)的含量。測定方法為：吸取樣液適量，加純水定容25mL，以純水空白為參比，在最大吸收波長處測定吸光度，依據(jù)標準曲線計算試樣中的總多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 F-C法測定多酚含量

2.1.1 最大吸收波長確定 分別吸取50μg/mL沒食子酸標準溶液1．5mL和甘蔗果酒0．1mL于兩個25mL容量瓶中，然后按照F-C法最佳顯色方案對試樣進行顯色，在350～1100nm波長區(qū)間掃描，確定最大吸收波長。從圖1可以看出，沒食子酸和甘蔗果酒均在755nm波長附近有最大吸收峰，選擇755nm為測定波長。

2.1.2 建立沒食子酸標準曲線 分別吸取50μg/mL沒食子酸標準溶液0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mL 于 25mL 容量瓶中， 按照 F-C 法最佳顯色方案顯色定容，于755nm下測定吸光度，得到?jīng)]食子酸標準曲線（圖 2），回歸方程為 y=0．1144x+0．015，R2=0．9978，說明在≤8．0μg/mL 范圍內(nèi)多酚濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.3 樣品中多酚含量的測定 重復(fù)性實驗：對甘蔗果酒多酚含量進行6次重復(fù)測定 （表1），6組測定數(shù)據(jù)多酚含量平均值0．6146mg/mL，SD=0．032%，RSD=0．52%，低于 2%，說明分析操作過程準確。

精密度實驗：對一組甘蔗果酒顯色液重復(fù)測定吸光度6次，吸光度值分別為 0．2955、0．2958、0．2956、0．2955、0．2955、0．2954， 測定吸光度穩(wěn)定，說明顯色反應(yīng)穩(wěn)定可行。

加標回收實驗：吸取0．1mL甘蔗果酒樣液共6組，分別加入50μg/mL沒食子酸標樣1mL，顯色測定吸光度，6次加標回收試驗的平均回收率為104．84%（表 2），SD=0．37%，RSD=0．36%， 低于2%，說明分析操作過程穩(wěn)定、準確，具有較高的準確性和精密度。

2.2 F-D法測定多酚含量

2.2.1 確定最大吸收波長 吸取50μg/mL沒食子酸標準溶液1．5mL，吸取待測樣液甘蔗果酒0．1mL，于兩個25mL容量瓶中，然后按照F-D法最佳顯色方案對試樣進行顯色，在350～1100nm波長區(qū)間掃描，確定最大吸收波長。

從圖3可以看出，沒食子酸和甘蔗果酒均在735nm波長處有最大吸收峰，選擇735nm為測定波長。

2.2.2 建立沒食子酸標準曲線 分別吸取50μg/mL沒食子酸標準溶液0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mL 于 25mL 容量瓶中，按照 F-D 法最佳顯色方案顯色定容，于 735nm 下測定吸光度，得到?jīng)]食子酸標準曲線 （F-D法）如圖4所示，回歸方程為y=0．0896x+0．0148，R2=0．9975， 說明在≤8．0μg/mL 范圍內(nèi)多酚濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.3 樣品中多酚含量的測定 重復(fù)性實驗：對甘蔗果酒多酚含量進行6次重復(fù)測定 （表 3），6組測定數(shù)據(jù)多酚含量平均值 0．5349mg/mL，SD=0．0038%，RSD=0．71%，低于 2%，說明分析操作過程準確。

精密度實驗：對一組甘蔗果酒顯色液重復(fù)測定吸光度6次，吸光度值為 0．2087、0．2085、0．2088、0．2087、0．2091、0．2086，測定吸光度穩(wěn)定，說明顯色反應(yīng)穩(wěn)定可行。

加標回收實驗：吸取0．1mL甘蔗果酒樣液樣共6組，各加入50μg/mL沒食子酸標樣1mL，顯色測定吸光度。6次加標回收試驗的平均回收率為102．50%（表 4），SD=3．42%，RSD=3．34%， 略高于2%，說明分析操作過程尚缺一定的準確性和精密度。

2.3 紫外分光光度法測定多酚含量

2.3.1 確定最大吸收波長 吸取50μg/mL沒食子酸標準溶液1．5mL，待測樣液甘蔗果酒0．1mL，于兩個25mL容量瓶中，加純水定容，在190～400nm波長區(qū)間掃描，確定最大吸收波長。

從圖5可看出：沒食子酸在紫外光區(qū)210nm和260nm處有兩個吸收峰，甘蔗果酒在紫外光區(qū)200nm和265nm處有兩個吸收峰顯現(xiàn)，選擇沒食子酸最大吸收波長210nm為測定波長。

2.3.2 建立沒食子酸標準曲線 分別吸取50μg/mL沒食子酸標準溶液0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mL 于 25mL 容量瓶中， 純水定容 25mL，于210nm下測定吸光度，得到?jīng)]食子酸標準曲線（紫外分光光度法）如圖6所示，回歸方程為 y=0．1504x+0．0119，R2=0．9995，說明在≤8．0μg/mL 范圍內(nèi)多酚濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.3 樣品中多酚含量的測定 重復(fù)性實驗：對甘蔗果酒多酚含量進行6次重復(fù)測定 （表 5），6組測定數(shù)據(jù)多酚含量平均值 1．2040mg/mL，SD=0．0126%，RSD=1．045%，低于 2%，說明分析操作過程準確。

精密度實驗：對一組甘蔗果酒顯色液重復(fù)測定吸光度6次，吸光度值分別為 0．3724、0．3715、0．3733、0．3724、0．3716、0．3720，測定吸光度穩(wěn)定，說明顯色反應(yīng)穩(wěn)定可行。

加標回收實驗：吸取0．05mL甘蔗果酒樣液樣共6組樣，分別加入50μg/mL沒食子酸量標樣1mL，純水定容，測定吸光度，6次加標回收試驗的平均回收率為 103．43%（表 6），SD=0．651%，RSD=0．629%，低于2%，說明分析操作過程穩(wěn)定、準確，具有較高的準確性和精密度。

2.4 3種多酚測定方法對茶多酚標準液的回收率

吸取0．069mg/mL茶多酚標準溶液，分別用F-C法、F-D法、紫外分光光度法測定多酚含量。從表7看出：F-C 法和 F-D 法測定茶多酚標準溶液平均含量 0．0420～0．0422mg/mL，平均回收率 60．86%～61．15%；紫外分光光法測得結(jié)果分別為0．0689mg/mL、99．80%；3種測定方法中除F-D法的RSD值（4．56%）高于2%，其余兩種方法的RSD值（0．98%、1．17%）均在2%以內(nèi)，說明分析操作過程穩(wěn)定、可靠。

從表8數(shù)據(jù)對比看出：F-C法、F-D法測定已知含量為0．069mg/mL茶多酚標準溶液時，回收率均在61%左右，紫外分光光度法測定回收率為99．80%；測定未知含量的甘蔗果酒時，F(xiàn)-C 法、F-D 法測定值為 0．6146mg/mL、0．5349mg/mL，紫外分光光度法測定值為1．2040mg/mL。

3 結(jié)論

通過3種多酚測定方法的對比，結(jié)果顯示：⑴測定含量較純的多酚物質(zhì)，可采用紫外分光光度法直接測定法，無須顯色劑顯色，成本低、省時間，回收率可達99%以上；⑵測定組分復(fù)雜的多酚物質(zhì)，宜采用顯色劑將酚類物質(zhì)顯色，在可見光區(qū)測定；⑶Folin-Ciocalteu比色法、Folin-Denis比色法測定茶多酚回收率在61%左右。⑷Folin-Denis比色法測定過程中，使用飽和Na2CO3溶液顯色，濃度較高，有混濁現(xiàn)象產(chǎn)生，需用濾紙濾后測定吸光值，穩(wěn)定性比Folin-Ciocalteu比色法略差。

4 討論

從圖7看出：多酚（以沒食子酸計）在紫外光區(qū)210nm、260nm處有兩個吸收峰值，多酚（以茶多酚計）在紫外光區(qū)205nm、275nm處兩個吸收峰值，黃酮（以蘆丁計）在195nm、255nm、355nm處有3個吸收峰，而甘蔗果酒在紫外光區(qū)雖然也有2個峰值但是峰值不是明顯，應(yīng)該包含有多種成分的物質(zhì)。實驗顯示，福林-酚比色法和紫外分光光度法測定多酚含量的方法準確度、精密度、加標回收率均在可接受范圍內(nèi)，均可用于多酚含量的測定，但福林-酚比色法和紫外分光光度法測定甘蔗果酒多酚含量存在較大差異。鄧剛等、卜彥花等[12-13]均在測定多酚含量的比較研究中發(fā)現(xiàn)兩種方法所測多酚含量具有較大差異。福林-酚比色法檢測成本相對較高，紫外分光光度法檢測成本低、操作簡單、重復(fù)性好、精密度高，但因其他植物的代謝產(chǎn)物在此波段也有紫外吸收，例如酚酸類、木質(zhì)素類等，導(dǎo)致直接紫外光光度法測定專屬性較差[16]。

實驗顯示，直接紫外分光光度法測定回收率最高，這與酚類物質(zhì)在紫外光區(qū)有特征吸收有關(guān)，對于較為純凈的酚類物質(zhì)，該法能較準確地測定含量；對于組分較為復(fù)雜的樣品，在多酚的特征吸收波長處，不排除其它物質(zhì)也有吸收，從而干擾了酚含量的測定，這種干擾的程度是無法預(yù)知的，因此直接紫外分光光度法測定純化過的多酚物質(zhì)會比較適宜，測定雜質(zhì)含量較多的多酚物質(zhì)不太適宜。