張健飛，管 靜，趙 丹，楊曉琴，周 英，俸婷婷

(1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；5.貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025；6.貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開發(fā)工程實驗室，貴州 貴陽 550025)

前 言

肉蓯蓉又名疆蕓、寸蕓、蓯蓉、查干告亞，為列當(dāng)科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk) Wight的干燥帶鱗葉肉質(zhì)莖[1]。具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效，傳統(tǒng)用于腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘，為歷代使用頻度最高的補腎陽藥物。H2O2作為一種活性氧形式，具有強烈引發(fā)脂質(zhì)過氧化的作用，幾乎可與任何細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，引起鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞的凋亡和功能失調(diào)[2，3]。實驗主要通過研究肉蓯蓉提取物對H2O2致兔腎小管上皮細(xì)胞增殖抑制和損傷的影響，初步探討其對腎小管上皮細(xì)胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

肉蓯蓉購自四川省川南藥業(yè)有限公司(批號151201)。

1.2 動物

新西蘭大白兔，雄性，20日齡，購自貴州省畜牧研究所實驗基地，動物許可證號：SCXK(黔)2012-001。

1.3 試劑

DMEM/F-12(1：1)，Gbico公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；二甲亞砜(DMSO)，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；H2O2，四川金山制藥有限公司；胰蛋白酶，Amresco公司；噻唑藍(MTT)，Genview公司；非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒，Promega公司；無水乙醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱，3111型，Thermo Fisher Scientific；酶標(biāo)儀，1510型，Thermo Fisher Scientific；超凈工作臺，SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置熒光顯微鏡，寧波舜宇；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機，LGJ-12，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.5 方法

1.5.1肉蓯蓉提取物的制備 取肉蓯蓉干藥材粉碎，精密稱取兩份藥粉各100 g，分別加入10倍量蒸餾水和75%乙醇加熱回流提取3次，第一次3 h，第二次1.5 h，第三次1 h，合并3次濾液，減壓濃縮至浸膏，計算提取物得膏率分別為水提物22.30%，醇提物21.70%，揮去殘醇，冷凍干燥機制得肉蓯蓉水、醇提取物，密封干燥避光保存待用。

1.5.2細(xì)胞培養(yǎng) 參照趙丹等[4]所述方法構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞模型，分離培養(yǎng)20日齡的兔原代腎小管上皮細(xì)胞，待細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)皿90%以上，胰酶消化。用含1%胎牛血清的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基以每孔1.2×104個細(xì)胞接種于96孔板，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.5.3H2O2致兔腎小管上皮細(xì)胞損傷模型的建立 參照1.5.2接種細(xì)胞，待細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)48h后，采用H2O2進行損傷。設(shè)置實驗組和空白對照組，每組設(shè)置4個復(fù)孔，重復(fù)三次。實驗組：更換含有不同濃度H2O2的完全培養(yǎng)基，H2O2的濃度分別為550、500、450、400、350 μmol·L-1，空白對照組：更換完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，鏡檢，采集圖片。采用MTT[5]法測定H2O2作用后細(xì)胞的增殖情況，于490 nm處測定吸光度值(OD值)。采用非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定H2O2作用后細(xì)胞LDH釋放量的變化，LDH釋放量(%)=上清液LDH量/(上清液LDH量+裂解液LDH量)×100%。

AO/EB熒光染色[6]：分別取100 μg/mL AO溶液和100 μg/mL EB溶液各100 μL，混勻后每孔加入10 μL，立即置于倒置相差熒光顯微鏡上觀察，5 min內(nèi)保持觀察視野不變，分別在450±10 nm的藍光和532±10 nm的綠光下采集圖片，采用熒光采集系統(tǒng)進行熒光合成，獲得熒光染色圖片。

1.5.4肉蓯蓉提取物對H2O2致兔腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響 按照1.5.2接種細(xì)胞，待細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)24 h后，每孔加入含肉蓯蓉提取物完全培養(yǎng)基200 ul對細(xì)胞進行預(yù)保護培養(yǎng)24 h。設(shè)置實驗組，模型組及空白對照組，每組3個復(fù)孔，重復(fù)三次。實驗組和模型組：更換含有400 μmol·L-1H2O2的完全培養(yǎng)基；空白對照組：為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用MTT法測定細(xì)胞增殖情況，采用非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定細(xì)胞LDH釋放量的改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間的多重比較采用LSD法，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2致兔腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)的改變

不同濃度的H2O2作用兔腎小管上皮細(xì)胞24h后，顯微鏡下觀察兔腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)，如圖1，隨著H2O2濃度的增加，形態(tài)改變的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，部分細(xì)胞變長，細(xì)胞光澤度減小，體積縮小，H2O2濃度達550 μmol·L-1，軸突消失，胞膜破裂，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間隙增大，成片細(xì)胞間出現(xiàn)空白。

空白對照組350μmol·L-1400μmol·L-1450μmol·L-1500μmol·L-1550μmol·L-1圖1 不同濃度H2O2對兔腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)的影響(100×)Fig1 EffectofH2O2concentrationonmorphologyofrabbitRTECs(100×)

2.2 H2O2對兔腎小管上皮細(xì)胞增殖作用的影響

分別使用350、400、450、500、550 μmol·L-1H2O2作用兔腎小管上皮細(xì)胞24 h，采用MTT法測定吸光度，結(jié)果為不同濃度的H2O2對兔腎小管上皮細(xì)胞的增殖均有抑制作用，IC50值為439.07 μmol·L-1，500 μmol·L-1的H2O2作用24h對細(xì)胞增殖的抑制作用可達到50%以上，因此選用該濃度作于后續(xù)研究。

2.3 H2O2對兔腎小管上皮細(xì)胞LDH的釋放量的影響

H2O2作用兔腎小管上皮細(xì)胞24 h后，采用非放射性細(xì)胞毒性檢測方法測定細(xì)胞上清液及細(xì)胞裂解液中LDH反應(yīng)的OD值，計算細(xì)胞LDH釋放量，結(jié)果見表1。不同濃度的H2O2會引起兔腎小管上皮細(xì)胞LDH釋放量的增加，且H2O2濃度越高，LDH釋放量越大，呈濃度依賴性。H2O2在濃度400 mmol·L-1時引起細(xì)胞LDH釋放量超過空白組50%以上，造成細(xì)胞重度損傷。

表1 H2O2對兔腎小管上皮細(xì)胞LDH釋放量的影響(x±s，n=4)Tab.1 Effects of H2O2 on LDH release from rabbit RTECs

注：與空白對照組比較*P<0.05；**P<0.01

2.4 H2O2作用兔腎小管上皮細(xì)胞后AO/EB熒光染色結(jié)果

H2O2作用兔腎小管上皮細(xì)胞24 h后，對細(xì)胞進行AO/EB熒光染色，如圖2，初步判斷H2O2對兔腎小管上皮細(xì)胞的作用機制以引起細(xì)胞壞死為主。不同濃度的H2O2會引起兔腎小管上皮細(xì)胞不同程度的壞死，H2O2濃度小于400 μmol·L-1時，核染色質(zhì)著綠色收縮成圓形，判斷主要以細(xì)胞早期凋亡為主，隨著H2O2濃度升高，大于450 μmol·L-1時，呈橘紅非圓珠狀，壞死細(xì)胞數(shù)量增多，呈濃度依賴性。

2.5 肉蓯蓉對H2O2致兔腎小管上皮細(xì)胞增殖作用的影響

空白對照組350μmol·L-1400μmol·L-1450μmol·L-1500μmol·L-1550μmol·L-1圖2 不同濃度H2O2作用兔腎小管上皮細(xì)胞AO/EB染色(100×)Fig2 AO/EBstainingofrabbitRTECstreatedbydifferentconcentrationsofH2O2(100×)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.6 肉蓯蓉對H2O2致兔腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響

對細(xì)胞LDH釋放量的影響結(jié)果如圖4，肉蓯蓉醇提物和水提物的高、中、低濃度組均使得H2O2作用后兔腎小管上皮細(xì)胞LDH釋放量極顯著低于模型組LDH的釋放量(P<0.01)，結(jié)果呈濃度依賴性，濃度越高，細(xì)胞LDH釋放量越低。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

有“沙漠人參”之美譽的肉蓯蓉具有極高的藥用價值，是中國著名的補益中藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》[7]將上品藥描述為：“上藥……主養(yǎng)命以應(yīng)天，無毒，多服，久服不傷人……”肉蓯蓉即被列為上品藥，味甘，微溫?！睹t(yī)別錄》[8]指出肉蓯蓉“味酸、咸，無毒”。之后歷代本草對肉蓯蓉性味歸經(jīng)的記載基本一致，其性微溫，味甘、酸、咸，歸腎、大腸經(jīng)。傳統(tǒng)用于腎陽不足、腰膝酸軟、筋骨無力等，其藥理作用及機制一直是研究重點。現(xiàn)代藥理研究表明，肉蓯蓉具有抗衰老、提高學(xué)習(xí)記憶能力、調(diào)節(jié)免疫功能。廣泛用于中醫(yī)臨床處方、中成藥和保健產(chǎn)品。

氧化應(yīng)激是某些重大疾病的關(guān)鍵誘因，是由于體內(nèi)活性氧在形成和清除之間出現(xiàn)失衡，造成組織細(xì)胞面臨一定程度的氧化損傷。因而對應(yīng)激反應(yīng)機制進行深入研究，能夠探尋有效預(yù)防、改善甚至完全消除應(yīng)激性疾病的合理途徑。氧化應(yīng)激能夠?qū)е麦w內(nèi)多種細(xì)胞及蛋白質(zhì)過氧化[9]，研究選用H2O2作為損傷的外源物之一。具有強烈引發(fā)脂質(zhì)過氧化的作用，引起鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞的凋亡和功能失調(diào)。目前研究這種外源物的腎毒性及拮抗其腎毒性作用主要是通過建立動物模型，建立體外模型進行相關(guān)研究的文獻報道相對較少。與腎毒性動物模型比較，體外腎毒性細(xì)胞模型具有作用靶點明確，用藥周期短，用藥量少等優(yōu)點。

通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變、外源物對細(xì)胞增殖的抑制作用及細(xì)胞LDH釋放量的改變對外源物誘導(dǎo)的體外腎毒性細(xì)胞模型進行研究。不同濃度的H2O2對細(xì)胞的形態(tài)改變均有明顯的影響，隨著外源物濃度的增加，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變形的數(shù)量增多。MTT實驗是檢測活細(xì)胞數(shù)量的常用方法，在不同濃度肉蓯蓉保護兔腎小管上皮細(xì)胞免受 H2O2損傷的實驗中，不同濃度的肉蓯蓉明顯降低了H2O2對兔腎小管上皮細(xì)胞的抑制率，且具有濃度依賴性，當(dāng)細(xì)胞胞膜損傷時，胞內(nèi)的LDH會釋放到培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量是檢測細(xì)胞死亡的一個重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2致兔腎小管上皮細(xì)胞損傷的模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平明顯增加，而經(jīng)不同濃度肉蓯蓉處理之后的實驗組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平明顯減少，且存在濃度依賴性。研究結(jié)果提示，通過建立H2O2致兔腎小管上皮細(xì)胞損傷模型，初步探討肉蓯蓉提取物對腎小管上皮細(xì)胞的保護作用，不僅為氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，也為肉蓯蓉的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1] Ch.P(2015)Vol Ⅰ(中國藥典2015年版.一部)[S]. 2015：135.

[2] Kim JH， Choi W， Lee JH，etal. Astaxanthin inhibits H2O2-mediated apoptotic cell death in mouse neural progenitor cells via modulation of p38 and MEK signaling pathways[J].MicrobiolBiotechnol， 2009， 19(11)：1355-1363.

[3] Siu PM， Wang Y， Alway SE.Apoptotic signaling induced by H2O2-mediated oxidative stress in differentiated C2Cl2myotubes[J].LifeSci， 2009， 84(13)：468-481.

[4] 趙 丹，張 雪，管 靜，等.幾種中藥材對兔原代腎小管上皮細(xì)胞增殖作用影響的研究[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2017，36(4)：76-79.

[5] 陳麗珍，俸婷婷，黃俊飛，等.依普黃酮對破骨細(xì)胞活性及成骨細(xì)胞增殖分化作用的研究[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2015，34(3)：042-047.

[6] 陳 萌，李華濤，李 響，等.AO/EB雙重染色法檢測紫杉醇體外誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技，2011，36(1)：39-42.

[7] Gu G G， Yang P J.Shen Nong Ben Cao Jing[M]. Beijing：XueyuanPress， 2013：73.

[8] Tao H J， Shang Z J.Ming Yi Bie Lu[M]. Beijing：People’s Medical Publishing House， 1986：51.

[9] Cash T P， Pan Y， Simon M C.Reactive oxygen species and cellular oxygen sensing[J].FreeRadicBiolMed， 2007， 43(9)：1219-1225．