李秀妮 ,喬保民 ,吳 創(chuàng) ,田煜利 ,萬德建 ,時(shí)向東
(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南鄭州450002;2.湖北省煙草公司恩施州公司,湖北恩施445000)
酶促棕色化反應(yīng)是一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng),在晾曬煙的調(diào)制過程中,煙葉因饑餓代謝而消耗大量的內(nèi)含物質(zhì),因此,外觀顏色會(huì)隨調(diào)制的進(jìn)行不斷發(fā)生改變,其顏色的變化為“淡綠—黃綠—淡黃—正黃—深黃—棕色—褐色”[1]。Akaike等[2]對(duì)日本煙草var.Shirodaruma在晾制過程中色素的變化進(jìn)行了研究,在由綠變黃階段,顏色發(fā)生變化的實(shí)質(zhì)原因是在葉綠素的降解作用下發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)所致。適當(dāng)促進(jìn)酶促棕色化反應(yīng)的進(jìn)行,將有利于晾曬煙品質(zhì)的提升,但若環(huán)境溫濕度條件或煙葉失水速率控制不當(dāng),就極易使酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生過度,導(dǎo)致晾曬煙發(fā)黑、霉變、甚至腐爛,嚴(yán)重影響煙葉的外觀質(zhì)量和抽吸品質(zhì)[3]。因此,如何調(diào)控酶促棕色化反應(yīng)的進(jìn)行對(duì)晾曬煙調(diào)制具有重要意義。
國外對(duì)酶促棕色化反應(yīng)的研究始于20世紀(jì)70年代,國內(nèi)開始于20世紀(jì)80年代,目前已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展[4]。酶促棕色化反應(yīng)主要發(fā)生在煙葉變黃末期至調(diào)制結(jié)束這一過程中。當(dāng)調(diào)制進(jìn)行至變黃末期,原本束縛于細(xì)胞內(nèi)的氧化酶類隨著葉肉組織逐漸死亡,細(xì)胞膜系統(tǒng)透性逐漸增大而滲入細(xì)胞間隙中,從而與細(xì)胞間隙內(nèi)的多酚類物質(zhì)發(fā)生直接接觸,生成大量醌類物質(zhì)。同時(shí),細(xì)胞膜系統(tǒng)透性的增大使活性氧能自由進(jìn)出煙葉組織,促使葉片內(nèi)氧化酶(特別是多酚氧化酶PPO)的活性增強(qiáng),從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多酚類物質(zhì)的氧化[5-6],葉片內(nèi)最終物質(zhì)的氧化還原平衡被破壞,醌類物質(zhì)大量生成和聚合使煙葉顏色加深[7]。
Matheis等[8]研究表明,植物組織中的酚、酶一經(jīng)接觸,將會(huì)發(fā)生一系列反應(yīng)。首先一元酚經(jīng)甲酚酶催化生成鄰-二羥基化合物,然后在多酚氧化酶的催化作用下,鄰-二酚被氧化成鄰-本醌,最后鄰-本醌繼續(xù)變化,生成高分子聚合物。此外,氨基酸或蛋白質(zhì)與鄰-苯酚作用生成高分子的絡(luò)合物,這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致褐色素的生成。例如,在晾曬煙調(diào)制和發(fā)酵過程中兒茶酚棕色化反應(yīng)就是煙葉變褐的重要過程[9]。在這個(gè)過程中,首先兒茶酚在多酚氧化酶作用下氧化成鄰醌,隨后鄰醌或沒有氧化的兒茶酚在酚羥化酶催化下進(jìn)行第二次羥基化作用,生成三羥基化合物;鄰醌具有強(qiáng)氧化能力,能將三羥基化合物氧化成羥基對(duì)醌或羥基鄰醌,此反應(yīng)無需酶參加;羥基醌容易聚合,這是主要的褐變反應(yīng),且隨著聚合度的加大,顏色由紅變褐,最終產(chǎn)生褐色的黑色素。所以,酶促棕色化反應(yīng)的實(shí)質(zhì)在于煙葉中的酚類物質(zhì)(如綠原酸、咖啡酸、蕓香苷等)和自身為黃色的黃酮類物質(zhì)在煙葉變黃過程中轉(zhuǎn)化為多酚類物質(zhì),它們經(jīng)過氧化產(chǎn)生淡紅色乃至黑褐色的醌類物質(zhì),最終使煙葉顏色加深[10]。因此,煙葉的酶促褐變本質(zhì)上是多酚氧化酶間接作用的結(jié)果[11]。
煙葉調(diào)制時(shí)誘導(dǎo)酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的外部環(huán)境因素主要有兩個(gè),一是調(diào)制溫度,二是環(huán)境相對(duì)濕度,兩者共同影響煙葉內(nèi)的水分含量和煙葉內(nèi)酶的活性,進(jìn)而影響棕色化反應(yīng)的發(fā)生[12]。一般來說,當(dāng)調(diào)制環(huán)境的相對(duì)濕度高于60%,溫度在45~46℃且煙葉失水量少于50%時(shí),將導(dǎo)致酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生。但是,即使水分含量較高的新鮮煙葉,在此溫度范圍內(nèi),只要環(huán)境相對(duì)濕度控制在60%以下,煙葉在變黃末期的失水量大于50%,則棕色化反應(yīng)就不易發(fā)生[11]。
2.2.1 變黃后期煙葉組織含水量 煙葉的生命活動(dòng)狀態(tài)是保證酶促棕色化反應(yīng)進(jìn)行的必要條件[13],而煙葉生命活動(dòng)的強(qiáng)弱是由葉片水分狀況決定的[14]。因此,當(dāng)葉片處于變黃末期時(shí),煙葉中的含水量直接決定了能否發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)[15]。若變黃階段失水量過少,則煙葉黃而僵硬,在后期調(diào)制階段隨著溫度的上升,極易發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)。若失水量適當(dāng),則酶活性得到抑制,酶促棕色化反應(yīng)即可得到有效控制[16]。
2.2.2 煙葉組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性 隨著調(diào)制過程的不斷進(jìn)行,組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞[17]。細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)與酶類混合在一起相互作用,促使酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生。細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞使氧分子能自由進(jìn)出細(xì)胞,氧化酶類活性增強(qiáng),酶促棕色化反應(yīng)速度加快[18]。所以,細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的速度和程度直接影響了酶促棕色化反應(yīng)進(jìn)行的速度和進(jìn)程。
2.2.3 煙葉組織細(xì)胞多酚氧化酶(PPO) 活性多酚氧化酶(PPO)作為酶促棕色化反應(yīng)的介導(dǎo)物,其活性的大小直接影響該反應(yīng)的速度[11]。酶活性大小與細(xì)胞內(nèi)能自由進(jìn)出氧分子量的多少成正相關(guān),也與溫度有直接關(guān)系。一般溫度低時(shí),多酚氧化酶(PPO)活性較低,但隨著溫度升高,活性有上升趨勢(shì)。若在溫度升高的同時(shí),配合相對(duì)濕度的降低,則多酚氧化酶活性會(huì)隨著調(diào)制時(shí)間的延長而逐漸降低[19]。
3.1.1 溫度與相對(duì)濕度 一般來說,溫度對(duì)多酚氧化酶(PPO)的活性影響主要在以下兩個(gè)方面:一方面當(dāng)溫度在45~50℃、相對(duì)濕度60%以上時(shí)隨著溫度的升高,酶活性降低;另一方面在溫度55℃、相對(duì)濕度60%以下時(shí)隨著溫度的升高,活性酶的比例下降[20]。因此,多酚氧化酶(PPO)最終的活性大小是由這兩方面綜合作用決定的。除溫度外,煙葉內(nèi)水分含量對(duì)多酚氧化酶(PPO)活性大小也是至關(guān)重要的。在變褐期調(diào)制房內(nèi)溫度為16~32℃,濕度控制為65%~75%條件下進(jìn)行調(diào)制可獲得較理想的效果[21]。雷東鋒等[22]通過對(duì)煙葉水分含量與多酚氧化酶(PPO)活性關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn),煙葉水勢(shì)條件為-872.78 kPa時(shí),多酚氧化酶(PPO)活性最高。因此,要想進(jìn)行適宜的酶促棕色化反應(yīng)就應(yīng)該在煙葉調(diào)制過程中對(duì)其環(huán)境溫度和相對(duì)濕度進(jìn)行相應(yīng)的技術(shù)調(diào)控。
3.1.2 環(huán)境pH值 酸堿度是酶賴以生存的環(huán)境條件,每種酶只有在其適宜的pH值范圍內(nèi)才表現(xiàn)出應(yīng)有的活性。戴亞等[23]研究指出,引起酶促褐變的適宜pH值范圍在4~7之間,降低或提高介質(zhì)中的pH值,可以控制多酚氧化酶(PPO)活性。韓富根等[24]研究表明,在18~20℃條件下,煙葉中多酚氧化酶(PPO)在pH值為6.0時(shí)活性較強(qiáng),在偏堿條件下,酶活性下降較快。在煙葉晾制過程中,若在調(diào)制房內(nèi)放置具有一定酸堿度的Ca、K、Mg鹽溶液即可調(diào)節(jié)pH值。
3.1.3 激活劑和抑制劑 CuCl2對(duì)多酚氧化酶(PPO)具有激活作用。銅離子有增強(qiáng)酶活性的功能,是煙草多酚氧化酶的良好激活劑。雷東鋒等[22]研究表明,當(dāng)銅離子濃度在 0.1~1.0 mmol·L-1濃度范圍內(nèi),多酚氧化酶(PPO)活性凈增長百分率隨Cu2+濃度增加而增加,但增長幅度逐漸趨于平緩。李榮林等[25]對(duì)該酶性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究時(shí)發(fā)現(xiàn),將該酶的最適溫度上升至40℃,最適pH值上移至7.0,酶對(duì)金屬離子的適應(yīng)性增強(qiáng),對(duì)抑制劑敏感性下降。多個(gè)試驗(yàn)表明,在相同濃度下CuSO4對(duì)多酚氧化酶抑制作用最強(qiáng),其次是EDTA、對(duì)苯二酚、巰基乙醇和硫脲[26-28]。
煙葉酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的一個(gè)重要條件是氧氣的參與[29],通過對(duì)調(diào)制房氧氣濃度的控制可有效調(diào)控該反應(yīng)進(jìn)行的速度。有研究指出,在煙葉調(diào)制過程中,當(dāng)環(huán)境氧氣體積分?jǐn)?shù)(濃度)高于5 000×106時(shí),隨著氧氣濃度的增加煙葉褐變程度逐漸加重[30]。但當(dāng)環(huán)境氧氣體積分?jǐn)?shù)(濃度)在100×106時(shí),酶促褐變基本上不會(huì)發(fā)生。因此,降低調(diào)制環(huán)境中氧氣的濃度可有效減少棕色化反應(yīng)的發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn),如果人為改變調(diào)制環(huán)境中氣相成分的組成比例(比如人工填充氮?dú)夂投趸迹?,降低煙葉周圍氧氣濃度,則能抑制多酚氧化酶(PPO)的活性[31]。范堅(jiān)強(qiáng)等[32]通過對(duì)密封煙垛進(jìn)行降氧處理,在一定程度上抑制了酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生。
目前,酶促棕色化反應(yīng)對(duì)煙葉感官質(zhì)量和外觀質(zhì)量的意義已被廣泛認(rèn)可[11],而非酶促棕色化反應(yīng)理論則常應(yīng)用于白肋煙的高溫處理和煙絲加香加料中以改善煙葉品質(zhì)[33]。因此,如何合理地進(jìn)行調(diào)控是煙草科技工作者不懈努力和關(guān)注的問題?,F(xiàn)階段,調(diào)制過程中的調(diào)控方法一般都從控制氧氣濃度、調(diào)節(jié)多酚氧化酶(PPO)活性兩方面來進(jìn)行。雖已取得了較好的效果,但都還存在一定的局限性。僅從這兩方面入手,一方面資源投入量較大,經(jīng)濟(jì)成本較高,另一方面,需要消耗大量的人力勞動(dòng)。因此,如何探索出更加簡單高效且經(jīng)濟(jì)的調(diào)控方法是所有煙草研究者共同努力的目標(biāo)。
有研究表明,植物自身存在某些可打破多酚氧化酶(PPO)潛伏狀態(tài)的激活劑,如菠菜中的亞麻酸、蠶豆中的游離脂肪酸等[34]。同樣,多酚氧化酶(PPO)的天然抑制劑也存在,如茶葉中的白花青素、橡黃素、菠菜葉中的草酸鹽等[35]。筆者認(rèn)為,煙葉自身也很有可能存在多酚氧化酶(PPO)激活劑和抑制劑,在調(diào)制過程中通過對(duì)環(huán)境的適當(dāng)調(diào)控使激活劑和抑制劑適當(dāng)表達(dá),或者通過基因調(diào)控手段對(duì)多酚氧化酶(PPO)表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,將會(huì)對(duì)酶促棕色化反應(yīng)起到調(diào)控作用,有利于晾曬煙品質(zhì)的提升。因此,探索晾曬煙自身多酚氧化酶(PPO)表達(dá)以及采用天然激活劑和抑制劑的調(diào)控方法,是進(jìn)一步調(diào)控酶促棕色化反應(yīng)提高煙葉質(zhì)量的方法,并且也將是今后探索的方向。
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