潘佳亮 姚翰文 耿征 葛康康 郝昕 張平 李朝陽(yáng) 馬玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

山核桃(Caryacathayensis)是一種廣泛分布于浙江省的經(jīng)濟(jì)樹種，由于其果實(shí)富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在市場(chǎng)上廣受歡迎，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)前景[1-3]。山核桃干腐病(Botryosphaeriadothidea)是山核桃樹的重要病害之一，導(dǎo)致山核桃的減產(chǎn)(10%～50%)并嚴(yán)重影響樹勢(shì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。當(dāng)前對(duì)于山核桃干腐病的田間防治主要依賴于化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、病原菌產(chǎn)生抗藥性及環(huán)境污染等問題[6-7]。目前，隨著人們對(duì)于綠色食品的關(guān)注度越來(lái)越高，具有低毒，低殘留等特點(diǎn)的植物源農(nóng)藥越來(lái)越受到人們的關(guān)注，然而植物源農(nóng)藥用量大，成本高等問題也制約著其廣泛應(yīng)用，將植物源農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配提高藥效并減少化學(xué)農(nóng)藥的使用也逐漸成為了科學(xué)界研究的重點(diǎn)。目前將植物源農(nóng)藥與化學(xué)殺菌劑復(fù)配防治山核桃干腐病尚無(wú)報(bào)道。

苦參堿是由苦參干燥根莖中提取的一種主要活性成分[8-9]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于苦參堿的研究主要集中在其殺蟲效果[10]，也有報(bào)道稱苦參堿具有抑制大腸桿菌、羊毛狀小孢子菌、白色念珠菌等微生物的生物活性[11-12]。近年來(lái)，關(guān)于苦參堿對(duì)植物病原菌抑菌效果的研究也逐漸增多[13-14]。Yang et al.[15]研究了苦參堿對(duì)幾種林木病原真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的抑制效果，發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)楊褐斑病菌(Marssoninabrunnea)和龍竹材霉變菌(Cladosporiumoxysporum)抑菌效果較強(qiáng)。

農(nóng)藥復(fù)配效果評(píng)價(jià)目前主要應(yīng)用的有Bliss法、Finney法、Mansour法[16]、孫云沛法[17]和等效線法等。由于孫云沛法可以定量的計(jì)算復(fù)配增效效果，常應(yīng)用于農(nóng)藥復(fù)配配方篩選中。但孫云沛法操作繁瑣，在多個(gè)藥物復(fù)配中工作量遠(yuǎn)大于Mansour法且浪費(fèi)藥物。Mansour法相對(duì)于孫云沛法省工省力，在大量篩選中應(yīng)用較多，但此方法僅能定性分析增效作用，不能定量。所以，筆者綜合利用不同方法的優(yōu)勢(shì)，先采用Mansour法對(duì)復(fù)配藥劑進(jìn)行定性分析，篩選出復(fù)配效果較好的組合，再用孫云沛法對(duì)這些組合進(jìn)行定量分析，篩選出效果最好的配比進(jìn)行下一步試驗(yàn)，以期獲得理想的復(fù)配農(nóng)藥配方。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試劑：98%苦參堿、99%戊唑醇、95%惡醚唑、99%喹啉銅、98%代森錳鋅、98%嘧菌酯、95%苯醚甲環(huán)唑、98%百菌清、99%甲基托布津均購(gòu)于上海源葉生物有限公司。

菌種：山核桃干腐病菌(Botryosphaeriadothidea)由東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏，所有菌種于冰箱中4 ℃保藏，每3個(gè)月轉(zhuǎn)接活化一次，使用前在馬鈴薯培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)備用。

1.2 方法

1.2.1 單劑對(duì)山核桃干腐病抑菌效果測(cè)定

藥劑配置：將98%苦參堿用無(wú)菌去離子水配置成500 g/L母液；99%戊唑醇、98%代森錳鋅、98%嘧菌酯、95%苯醚甲環(huán)唑、98%百菌清、99%甲基托布津用丙酮配置成20 g/L母液；95%惡醚唑、99%喹啉銅用丙酮配置成10 g/L母液。

毒力回歸方程和EC50值：將融化后的PDA培養(yǎng)基冷卻至55～60 ℃，加無(wú)菌藥劑母液充分混勻。根據(jù)不同藥劑配置成5個(gè)不同濃度的帶藥培養(yǎng)基，等量溶劑加入PDA培養(yǎng)基中作為對(duì)照組，倒入滅菌培養(yǎng)皿中冷卻至室溫凝固。取活化72 h的山核桃干腐病真菌，用5 mm滅菌打孔器在菌落邊緣打孔，倒放至帶藥平板中央，25 ℃培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，通過計(jì)算菌落直徑平均值，按下面的公式計(jì)算苦參堿對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制率。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

抑制率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-菌柄直徑)×100%。

1.2.2 增效作用評(píng)價(jià)

采用Mansour法[16]測(cè)定苦參堿與8種化學(xué)農(nóng)藥的共毒因子，將供試藥劑用不同溶劑溶解，按照單劑EC50值進(jìn)行六等分法，即假設(shè)A、B兩種藥物的EC50值分別為Ca和Cb，則將A、B兩種藥物母液用PDA培養(yǎng)基稀釋成(Ca/6+5Cb/6)、(Ca/3+2Cb/3)、(Ca/2+Cb/2)、(2Ca/3+Cb/3)、(5Ca/6+Cb/6)，等量溶劑加入培養(yǎng)基中作為對(duì)照組，每組重復(fù)3次。按照各單劑獨(dú)立回歸曲線計(jì)算該濃度的抑菌率，將2種藥劑抑菌率相加與合劑實(shí)際抑菌率相比較，共毒因子大于20為增效作用，小于-20為拮抗作用，在-20～20為相加作用。共毒因子計(jì)算公式如下：

共毒因子=(合劑實(shí)際抑菌率-藥物A理論抑菌率-藥物B理論抑菌率)/(藥物A理論抑菌率+藥物B理論抑菌率)×100。

采用孫云沛法[17]測(cè)定苦參堿與甲基托布津的聯(lián)合毒力。按孫云沛法將供試藥劑用不同溶劑溶解，按照EC50值進(jìn)行十等分(參照六等分法)，用等量溶劑配置成對(duì)照組，每組重復(fù)3次。用下列公式計(jì)算其聯(lián)合毒力：

混合藥劑實(shí)際毒力指數(shù)=(標(biāo)準(zhǔn)藥劑EC50/混合藥劑EC50)×100；

混合藥劑理論毒力指數(shù)=A藥劑毒力指數(shù)×A藥劑在混劑中所占比例+B藥劑毒力指數(shù)×B藥劑在混劑中所占比例；

共毒系數(shù)=(混合藥劑實(shí)際毒力指數(shù)/混合藥劑理論毒力指數(shù))×100；

共毒系數(shù)>120時(shí)為增效作用，共毒系數(shù)<80為拮抗作用，80<共毒系數(shù)<120為相加作用；其中A、B藥劑在混劑中所占比例為質(zhì)量比。

2 結(jié)果與分析

2.1 單劑的毒力回歸方程和EC50值

8種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)山核桃干腐病的毒力回歸方程和EC50值見表1。從表1中可知，惡醚唑和苯醚甲環(huán)唑抑菌效果較好，EC50值分別為0.331、0.601 mg/L，其次為戊唑醇、甲基托布津，其EC50值為1.093、1.653 mg/L，這4種殺菌劑對(duì)山核桃干腐病均具有較好的抑菌效果，而代森錳鋅、喹啉銅和百菌清抑菌效果較差，EC50值為13.310、15.11、19.166 mg/L，嘧菌酯抑菌效果最差，EC50值達(dá)到549.525 mg/L，抑菌效果與其他供試殺菌劑差異顯著。

表1 殺菌劑對(duì)山核桃干腐病的毒力回歸方程和EC50值

2.2 最佳復(fù)配組合的篩選

從表2可知，苦參堿與8種化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配效果差異較大，在40個(gè)組合中有8個(gè)組合為增效作用，其中以苦參堿和甲基托布津復(fù)配效果最好，各配比共毒因子均大于20，在1∶1和2∶1復(fù)配時(shí)共毒因子最高，可達(dá)到118.415和87.343，其次是苦參堿與嘧菌酯在1∶2和5∶1復(fù)配時(shí)共毒因子為29.329和25.692。另外，苦參堿與苯醚甲環(huán)唑1∶1復(fù)配時(shí)共毒因子也達(dá)到了24.711，具有增效作用。而苦參堿與代森錳鋅和百菌清復(fù)配時(shí)毒力因子均低于-20，表現(xiàn)為拮抗作用，與戊唑醇、惡醚唑、喹啉銅和苯醚甲環(huán)唑4種化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配呈相加作用。由于嘧菌酯對(duì)山核桃干腐病的抑菌效果最差，且根據(jù)共毒因子，苦參堿與甲基托布津復(fù)配效果要優(yōu)于苦參堿與嘧菌酯復(fù)配效果。因此，選用苦參堿與甲基托布津作為最佳復(fù)配組合進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表2 苦參堿與8種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)山核桃干腐病的毒力因子

2.3 苦參堿與甲基托布津最佳復(fù)配比例的篩選

由表3可知，不同比例苦參堿與甲基托布津復(fù)配均具有抑菌效果，但其結(jié)果與毒力因子測(cè)定結(jié)果的趨勢(shì)相似，其中復(fù)配比例為5∶5時(shí)，共毒系數(shù)最高，為197.605，其EC50值為383.00 mg/L，其次分別是6∶4、4∶6、7∶3和9∶1，它們的共毒系數(shù)分別為186.257、174.254、163.582和159.382，其EC50值分別為327.00、521.00、278.00、95.80 mg/L。

3 討論

山核桃干腐病是山核桃樹主要病害之一，對(duì)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)造成巨大的損失，針對(duì)該病的防治主要以刮除病斑配合涂藥的方法進(jìn)行防控[18-19]，但這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，尋找能夠高效安全的防治山核桃干腐病的方法已經(jīng)成為了亟待解決的問題。張傳清等[7]通過測(cè)定7種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)山核桃干腐病菌絲抑制活性發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇抑菌效果最好，其中甲基托布津?qū)ι胶颂腋筛〉腅C50值為2.66 mg/L，與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，供試8種藥劑的EC50由大到小為惡醚唑、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、甲基托布津、代森錳鋅、喹啉銅、百菌清、嘧菌酯，其中甲基托布津EC50值為1.65 mg/L。

表3 苦參堿與甲基托布津不同配比對(duì)山核桃干腐病病原菌的聯(lián)合毒力

植物源農(nóng)藥是從植物中提取的活性成分，其中很多活性成分具有廣譜的抗真菌效果[20]?？鄥A是一種具有多種生物學(xué)活性的喹嗪生物堿，Yang et al.發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)4種植物病原真菌的抑菌效果，其中對(duì)楊褐斑病菌和龍竹材霉變菌抑菌效果較好，同時(shí)與氧化苦參堿復(fù)配具有一定增效作用[15]，但關(guān)于苦參堿與化學(xué)農(nóng)藥的增效作用目前尚無(wú)報(bào)道。本研究通過Mansour法和孫云沛法測(cè)定苦參堿與8種化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配效果，發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)嘧菌酯和甲基托布津復(fù)配效果最好，與代森錳鋅和百菌清復(fù)配時(shí)表現(xiàn)為拮抗作用，與戊唑醇、惡醚唑、喹啉銅和苯醚甲環(huán)唑4種化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配呈相加作用，這可能與藥物抑菌活性機(jī)制有關(guān)，需要進(jìn)一步試驗(yàn)和探討?？鄥A與甲基托布津不同比例復(fù)配對(duì)其聯(lián)合毒力影響較大，當(dāng)復(fù)配比例為5∶5和6∶4時(shí)，其共毒系數(shù)值最高，分別為197.605和186.257，其EC50值分別為383.00、327.00 mg/L，這與Mansour法的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)相同，進(jìn)一步證明Mansour法和孫云沛法聯(lián)合使用的科學(xué)性。

本研究表明，苦參堿與甲基托布津5∶5和6∶4復(fù)配對(duì)山核桃干腐病抑菌效果較好，抑菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于單劑使用，具有明顯的增效作用，但一個(gè)商品化的復(fù)配農(nóng)藥還需要進(jìn)行抑菌譜的測(cè)定、田間試驗(yàn)、經(jīng)濟(jì)成本核算等綜合分析才能最終確定?？鄥A與甲基托布津復(fù)配可以增加抑菌活性，減少環(huán)境污染和抗藥性的產(chǎn)生，為今后田間試驗(yàn)和生產(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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