□ 崔 晗 劉玥婷 沈葆真 劉夢(mèng)遙 大連出入境檢驗(yàn)檢疫局

隨著工業(yè)生產(chǎn)和社會(huì)的飛速發(fā)展，全球沿海地區(qū)大量的工業(yè)廢水和生活污水排入海洋，導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，海洋環(huán)境日趨惡化，赤潮頻繁發(fā)生，赤潮藻毒素泛濫，海洋貝類(lèi)通過(guò)濾食在體內(nèi)富集，再通過(guò)食物鏈傳遞到食用的人和動(dòng)物身上，對(duì)健康產(chǎn)生危害[1]。由貝類(lèi)毒素引起的人體中毒事件不斷發(fā)生，同時(shí)赤潮對(duì)海洋養(yǎng)殖業(yè)也造成破壞性損失。

1 脂溶性貝類(lèi)毒素簡(jiǎn)介

貝類(lèi)毒素（shellfish toxin）又稱(chēng)赤潮生物毒素（red tide toxin），是赤潮生物產(chǎn)生的一系列天然活性毒素。濾食性魚(yú)、蝦和貝類(lèi)通過(guò)濾食活動(dòng)將這些毒素富集在體內(nèi)，導(dǎo)致海洋生物中毒，這些中毒的魚(yú)、蝦和貝類(lèi)再通過(guò)食物鏈的傳遞導(dǎo)致食用的人和動(dòng)物中毒。因?yàn)椴煌某喑鄙锂a(chǎn)生不同的貝類(lèi)毒素，造成貝類(lèi)毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性的巨大差異。2004年，由世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和政府間海洋委員會(huì)共同組建的雙殼軟體生物毒素工作組將貝類(lèi)毒素分為8類(lèi)，包括大田軟海綿酸毒素組（okadaic acid，OA）、蝦夷扇貝毒素組（yessotoxin，YTX）、原多甲酸毒素組（azaspiracid，AZA）、蛤毒素組（pecenotoxin，PTX）、短裸甲藻毒素組（brevetoxin，BTX）、環(huán)亞胺類(lèi)毒素組（cyclic imine，CI）、軟骨藻酸組（domoic acid，DA）和石房蛤毒素組（saxitoxin，STX）?，F(xiàn)有的8大類(lèi)貝類(lèi)毒素中DA和STX易溶于水，為水溶性貝類(lèi)毒素（hydrophilic phycotoxins，HPs）， 而 OA、YTX、AZA、PTX、BTX和CI為聚醚類(lèi)物質(zhì)，易溶解于甲醇、乙醚等有機(jī)試劑，因此被稱(chēng)作脂溶性貝類(lèi)毒素（lipophilic phycotoxins，LPs）。LPs具有熱穩(wěn)定性，通過(guò)加熱等常規(guī)加工方式只能降低產(chǎn)品的水分含量，而不能導(dǎo)致LPs的降解，這類(lèi)貝毒在貝類(lèi)內(nèi)臟和肉質(zhì)等組織中的分布情況也不存在顯著性差異。目前，已發(fā)現(xiàn)的LPs引起的中毒癥狀多為腹瀉、惡心、嘔吐等，中毒癥狀較普通細(xì)菌感染發(fā)作時(shí)間短，通常為食用后幾小時(shí)，甚至短至幾十分鐘，且沒(méi)有相應(yīng)的解毒藥物治療，所以這類(lèi)毒素對(duì)消費(fèi)者帶來(lái)的潛在危害更難預(yù)防，已成為當(dāng)前貝類(lèi)毒素研究的重要關(guān)注領(lǐng)域。

2 脂溶性貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法分析

目前，LPs的檢測(cè)方法主要有小鼠生物法、生物免疫法、細(xì)胞毒性法以及近年來(lái)迅速發(fā)展的化學(xué)儀器分析法等，小白鼠生物法在未知貝毒的發(fā)現(xiàn)和研究過(guò)程中發(fā)揮了巨大作用，目前仍是我國(guó)法定的分析方法，并在世界范圍內(nèi)被普遍采用，但是該方法由于內(nèi)在的不確定度超過(guò)20%以及動(dòng)物福利等種種原因，歐盟、加拿大等地區(qū)與國(guó)家已相繼提出了化學(xué)儀器分析技術(shù)替代小鼠生物法的建議，繼而推動(dòng)了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC- MSn）技術(shù)在LPs檢測(cè)領(lǐng)域的快速發(fā)展。

2.1 小鼠生物法

小鼠生物法是由Yasumoto 等建立的[2]，為全世界許多國(guó)家監(jiān)測(cè)LPs所使用，該法用丙酮從貝類(lèi)組織中提取出毒素，再經(jīng)減壓濃縮蒸干，用1%的吐溫60溶解殘留物，腹腔注射小白鼠，觀察其存活情況，根據(jù)小鼠不同的死亡時(shí)間，判斷毒性的大小。該方法的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)容易掌握，不需要使用大型分析儀器，但特異性較差，不能提供特定LPs的檢出限，在檢測(cè)過(guò)程中，多種LPs如 OA、YTX 、PTX和 AZA等毒素可能被同時(shí)檢測(cè)到，甚至包括毒性未知的其他貝類(lèi)毒素，對(duì)小鼠都具有毒性作用。由于易受到游離脂肪酸等內(nèi)源性化合物的影響，極易造成假陽(yáng)性結(jié)果，且動(dòng)物死亡時(shí)間的判斷受主觀因素以及小鼠個(gè)體特性的影響，導(dǎo)致該方法準(zhǔn)確性不高。此外，小鼠活體毒性試驗(yàn)越來(lái)越受到動(dòng)物保護(hù)主義者的反對(duì)，目前，很多國(guó)家已逐步禁止該方法的使用。

2.2 生物免疫法

和小鼠生物法相比較，免疫分析法具有更好的特異性和靈敏度，該方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[3]和放射免疫法（RIA）。目前，已有酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于LPs的測(cè)定，市售的DSP Check R 和Rougier Bio-Tech R兩種試劑盒均能從甲基-OA提取物中準(zhǔn)確定量出OA含量，與化學(xué)儀器分析法相比，檢測(cè)更快速，但由于LPs的毒性與甲基-OA、OA或這兩種物質(zhì)的混合物的含量都有關(guān)系，導(dǎo)致ELISA法不能夠準(zhǔn)確地判斷貝類(lèi)產(chǎn)品的總毒性。生物免疫法作為重點(diǎn)發(fā)展的貝毒檢測(cè)技術(shù)之一，也應(yīng)用于生物傳感器上，未來(lái)幾年在現(xiàn)場(chǎng)和快速高效貝類(lèi)毒素檢測(cè)方面，用來(lái)檢測(cè)LPs復(fù)合物毒素的生物傳感器可能會(huì)有很好的發(fā)展前景。生物免疫法與其他非化學(xué)性分析方法相比，在靈敏度、特異性上有了很大的提高，但必須有高質(zhì)量的酶制劑，且無(wú)法提供詳細(xì)的毒素成分信息等，這也限制了該方法在貝類(lèi)毒素定性和定量方面的應(yīng)用。

2.3 細(xì)胞毒性法

細(xì)胞毒性法是LPs體外細(xì)胞測(cè)試法中較為常見(jiàn)的一種分析方法，主要是用血清培養(yǎng)鼠白血病細(xì)胞，再加入LPs毒素提取物，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞受抑制的情況來(lái)定量LPs。該方法選取的細(xì)胞在整個(gè)毒性測(cè)試過(guò)程中極易出現(xiàn)大面積死亡的情況，方法重現(xiàn)性無(wú)法滿足檢測(cè)需求，不適于推廣應(yīng)用。

2.4 化學(xué)儀器分析法

LPs的化學(xué)儀器分析法主要指液相色譜法（LC）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MSn）[4]。LC法通過(guò)連接紫外或熒光等不同的檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)不同的LPs毒素成分，但由于大部分LPs在紫外區(qū)無(wú)吸收或吸收較弱，且不具備自發(fā)熒光能力，只有極少數(shù)如OA毒素可通過(guò)9-蒽基疊氮甲烷衍生后，用熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量，因此LC法在檢測(cè)LPs的領(lǐng)域受到局限。目前，隨著液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MSn）技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)外已逐步將LC-MSn法用于LPs的分析，并對(duì)其特征和含量進(jìn)行研究，2012年，歐盟提出將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）作為貝毒測(cè)定的參考方法（EN 16204-2012），美國(guó)、加拿大及國(guó)際食品法典委員會(huì)也相繼提出用LC-MS/MS法替代小鼠生物法作為貝毒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的建議，同時(shí)大幅度降低了貝類(lèi)毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。LCMS/MS法在LPs分析中具有明顯的優(yōu)越性：①靈敏度高；②特異性強(qiáng)；③分析時(shí)間短；④能夠準(zhǔn)確定量不同毒素組分。雖然這種方法研究起步較晚，但發(fā)展極為迅速，目前所有LPs毒素組均建立了相應(yīng)的LC-MS/MS分析方法，而且該方法的定性和未知物篩查能力，對(duì)于新型毒素的發(fā)現(xiàn)和確證有很廣闊的發(fā)展前景。

3 建議

我國(guó)已于2016年正式發(fā)布了GB 5009.212-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)貝類(lèi)中腹瀉性貝類(lèi)毒素的測(cè)定》，規(guī)定了小鼠生物法、酶聯(lián)免疫吸附法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法三種方法均可作為腹瀉性貝類(lèi)毒素大田軟海綿酸（OA）、鰭藻毒素-1（DTX-1）和鰭藻毒素-2（DTX-2）的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，建議今后以分析方法標(biāo)準(zhǔn)化為基礎(chǔ)，系統(tǒng)地開(kāi)展我國(guó)LPs的污染狀況及分布規(guī)律研究、LPs毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)研究、貝類(lèi)產(chǎn)品中LPs的限量標(biāo)準(zhǔn)和管控措施等，以提高我國(guó)貝類(lèi)毒素研究能力和監(jiān)管水平。

[1]周名江,李鈞,于仁誠(chéng),等.赤潮藻毒素研究新進(jìn)展[J].中國(guó)海洋藥物 ,1999：48-54.

[2]Yasumoto T, Oshima Y, Yamaguchi M. Occurrence of a New Type of Shellfish Poisoning in the Tohoku District[J].Nihonsuisan-gakkai-shi,1978(11)：1249-1255.

[3]Uzuki T, Yoshizawa R, Kawamura T,et al. Interference of Free Fatty Acids from the Hepatopancreas of Mussels with the Mouse Bioassay for Shellfish Toxins[J].Lipids,1996(6)：641-645.

[4]Jorge R, Araceli E R, Gonzalo L, et al. Automated Online Solid-phase Extraction Coupled to Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry for Determination of Lipophilic Marine Toxins in Shellfish[J].Food Chemistry,2011(2)：533-540.