李獻帥 陳獻國 樓 洋 許 博 徐小義

用體外誘導的心肌細胞重建損傷心肌是目前的研究熱點。胚胎干細胞在備選干細胞中，最具發(fā)育潛能性和研究價值。目前胚胎干細胞體外分離和培養(yǎng)的實驗方法已經很成熟，滿足大量培養(yǎng)和擴增的需要，并可定向分化為心肌細胞[1-3]。動物實驗表明，胚胎干細胞誘導分化的心肌細胞移植到體內后仍表現(xiàn)出非凡的擴增能力[4-7]，這意味著干細胞移植修復心肌細胞將成為可能。本文使用人胚胎干細胞，分別通過直接貼壁法和懸浮法誘導分化為心肌細胞，尋找效率、可行性更高的實驗方案，為體外胚胎干細胞誘導分化為心肌細胞更為深入的研究提供基礎實驗依據。

1 實驗方法

1.1 干細胞來源 人胚胎干細胞來自于上海斯丹賽生物技術有限公司X-01干細胞系。

1.2 主要試劑 DMEM/F12（Gibco SH30370.03），1%非必需氨基酸（Gibco），L-谷氨酰胺（Gibco），0.1mM β-巰基乙醇（Gibco），高糖 DMEM（Gibco），青鏈霉素（Gibco），絲裂霉素 C（Sigma），5%血清替代品SR（Gibco），普通胎牛血清 FBS（Gibco），干細胞專用胎牛血清 ES qualified FBS（Gibco 16141-061），成纖維細胞生長因子（bFGF Gibco HL20676），B27無血清添加劑（Gibco 17504-044），RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco 22400089），activin A（Gibco PHC9564），BMP4（Gibco），維生素 C，NaHCO3，PBS（Gibco），0.05%胰酶（Gibco），明膠，基質膠（BD Pharmingen），膠原酶Ⅳ（Gibco），白血病抑制因子 LIF（Gibco）。

1.3 主要儀器 低速控溫離心機（Thermo Scientific CL10），高速控溫離心機（Thermo Pic017），液氮罐（Thermofisher YDS35HC35），電動移液器（Thermo Scientific Finnpipette C1），CO2培養(yǎng)箱（Thermo，HERA cell150i），凍存管（NUNC），50mL/15mL 離心管（NUNC），6cm/10cm細胞培養(yǎng)皿（NUNC），6孔板/24孔板細胞培養(yǎng)皿（NUNC），低黏附性培養(yǎng)皿，超凈臺，顯微鏡，水浴鍋。

2 實驗方法

2.1 人胚胎干細胞懸浮法制備EB以及分化 用200U/mL膠原酶Ⅳ370C處理人胚胎干細胞克隆10min后，挑起克隆轉移碎片到低黏附性培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)以形成擬胚體。4天后將擬胚體轉移到基質膠處理過的6孔板中貼壁培養(yǎng)（1～3EBs/cm2），如結果中所需的時間分化成跳動的心肌細胞。

2.2 人胚胎干細胞加誘導劑的貼壁法分化 用200U/mL膠原酶Ⅳ370C處理人胚胎干細胞克隆10min后，以1×105個/cm2的細胞密度轉移到0.1%明膠處理過的培養(yǎng)皿中。用8ng/mL bFGF的條件培養(yǎng)基（人胚胎干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)MEF細胞24h后的培基）培養(yǎng)6d后，更換為1640-B27培養(yǎng)基，同時用100ng/mL的人重組activin A處理24h，接著用10ng/mL的人重組BMP4處理4d，之后更換為不帶誘導劑的1640-B27培養(yǎng)基，每隔2～3d換1次培養(yǎng)基，持續(xù)2～3周。大量的自發(fā)跳動心肌細胞在activin A加入后12d開始出現(xiàn)。

2.3 免疫熒光染色、膜片鉗實驗及細胞凋亡-Hoechst染色 在鋪有22mm×22mm蓋玻片的24孔板中，將人胚胎干細胞誘導分化為跳動的心肌細胞。然后經過心肌細胞常規(guī)免疫熒光染色步驟處理；選擇有cTnT表達的跳動心肌細胞用于膜片鉗實驗。應用電流鉗技術記錄心肌細胞的自發(fā)性動作電位。在三氣細胞培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)（5%CO2，95%N2）跳動的心肌24h，刺激細胞發(fā)生凋亡后，使用Hoechst染色，再進行流式細胞儀進行分析。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用配對t檢驗及多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 細胞形態(tài)和免疫染色 光鏡下可見人胚胎干細胞克隆生長形態(tài)及懸浮法誘導形成人胚胎干細胞擬胚體（EB）形態(tài)（見封三圖1）。分化培養(yǎng)7d左右，各組克隆開始出現(xiàn)跳動的區(qū)域（有錄像保存）。胚胎干細胞分化為跳動克隆后，經免疫熒光染色心肌細胞特異性標志物cTnT，可以看到幾乎整個克隆都呈陽性；通過膜片鉗實驗，兩組跳動心肌細胞均檢測到自發(fā)性動作電位（見封三圖2）。

3.2 各組胚胎干細胞開始出現(xiàn)跳動克隆的時間比較每組胚胎干細胞接種96個孔，每個孔1個EB。懸浮法組出現(xiàn)自發(fā)跳動心肌細胞的平均時間為（13.9±0.9）天，貼壁法組出現(xiàn)自發(fā)跳動心肌細胞的平均時間為（13.0±1.1）天，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見封三圖 3A。

3.3 各組胚胎干細胞誘導分化出現(xiàn)跳動EB的平均頻率 懸浮法組出現(xiàn)自發(fā)跳動心肌細胞的平均跳動頻率為（63.8±5.6）次/分；貼壁法組出現(xiàn)自發(fā)跳動心肌細胞的平均跳動頻率為（63.0±7.0）次/分。兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見封三圖3B。

3.4 分化過程中兩組胚胎干細胞分化為跳動克隆的數量比較 懸浮法組分化為跳動克隆的百分比為20.8%，貼壁法組分化為跳動克隆的百分比為66.7%，表明貼壁法誘導分化效率明顯高于懸浮法（P＜0.05）。見封三圖4。另外，誘導出現(xiàn)的跳動心肌細胞維持跳動的時間可長達3個月以上。

3.5 各組心肌細胞凋亡比例 懸浮法組心肌細胞凋亡比例為（8.1±0.4）%，貼壁法組心肌細胞凋亡比例為（8.0±0.5）%。兩組凋亡比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見封三圖 3C、圖 5。

4 討論

人胚胎干細胞基因調控技術、體外誘導分化技術、移植技術、體內擴增技術等，均為現(xiàn)今各國專家研究的熱點[8-11]。

實驗表明，與懸浮法比較，直接貼壁法誘導分化為心肌細胞的效率更高，所需時間也更短（P＜0.05），而兩組最后誘導出的心肌細胞在活性方面、抗凋亡能力方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但直接貼壁法用到的部分實驗耗材，如activin A、BMP4、bFGF等相對比較昂貴，所以當需要大量制備心肌細胞時這些成本必須要考慮在內。而懸浮法誘導分化為心肌細胞盡管分化效率較低，但是制備成本較低，也更加實用。兩種實驗方法在分化為跳動的心肌細胞所需時間上有一個共同點，就是前1周幾乎沒有跳動的心肌細胞出現(xiàn)，從第2周左右開始呈爆發(fā)性指數式增長，我們猜測是心肌細胞內的肌蛋白纖維含量以及自律傳導系統(tǒng)大概需要2周左右的時間才能發(fā)育完全，最終產生心肌細胞的收縮。另外，直接貼壁法誘導分化為心肌細胞的步驟相對懸浮法雖然更為復雜，但具有進一步優(yōu)化步驟的可能（如誘導因子劑量的調控、誘導因子培育的時間等），后續(xù)的試驗將有可能進一步提高其誘導分化效率，那么這種方法的價值也將更加凸顯。

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