劉爽 張卓伯

自誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)被發(fā)現(xiàn)以來它在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應用越來越廣泛。本研究通過查閱文獻的方法對iPSC及其衍生物神經(jīng)干細胞(neural stem cells NSC)移植治療腦梗死的方法、結(jié)論進行概述，為干細胞移植治療腦梗死提供理論依據(jù)。

腦梗死又稱缺血性腦卒中(cerebral infarction)，是指因腦組織局部血液循環(huán)障礙，缺血缺氧引起的神經(jīng)功能障礙性疾病[1]。神經(jīng)細胞是一種永久細胞，一旦壞死后不可逆轉(zhuǎn)，腦梗死的發(fā)生會導致神經(jīng)功能的缺損甚至威脅生命。腦梗死在我國的發(fā)病率很高，約為110/10萬人口，腦梗死患者的病死率較高、生活質(zhì)量較差，對家庭和社會造成的負擔較重。目前多采用藥物或介入手術(shù)治療，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種治療可以完全恢復神經(jīng)系統(tǒng)的功能。近些年來科學發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細胞移植是一項新穎而有潛力的治療腦梗死的方法，已有動物實驗表明移植入小鼠體內(nèi)的胚胎干細胞具有多分化性，可以分化為神經(jīng)細胞，并且具有高度的自我復制能力，替代死亡的神經(jīng)細胞而發(fā)揮功能[2]。但是，由于胚胎干細胞需要使用胚胎細胞，存在倫理道德爭議，且異體移植會產(chǎn)生免疫排斥反應，所以研究受到了限制。2006年誘導多能干細胞的發(fā)現(xiàn)解決了這一問題，日本Yamanaka[3]研究小組利用Oct3/4、Sox2、C-Myc 和Klf4 4種轉(zhuǎn)錄因子重新編碼小鼠胚胎成纖維細胞，成功獲得了生物特性與胚胎干細胞非常相似的細胞，稱為誘導多能干細胞。

iPSC相比于傳統(tǒng)的細胞重編程手段具有極大的優(yōu)勢。(1)iPSC受體細胞可來自體細胞，不需要使用卵母細胞或胚胎，可避免倫理及免疫排斥兩大問題；(2)來源廣泛?？梢匀∽匀薆淋巴細胞[4]、肝細胞、胃細胞[5]、神經(jīng)細胞[6]等多種組織器官；(3)操作簡單，具有重復性。取材可以來自患有特定疾病的患者，從而實現(xiàn)患者個體化。例如可以取來自于患神經(jīng)退行性疾病患者的皮膚細胞，如肌萎縮側(cè)索硬化癥或帕金森氏病[7]，分化提取所需要的細胞類型，如運動神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元[8]，這使得人們在研究疾病發(fā)展的細胞和分子水平上達到了一個新高度；(4)增殖能力高。許多類型的細胞如神經(jīng)細胞只能進行有限數(shù)量的增殖，而重新編程后得到的iPSC仍然是二倍體細胞。這讓iPSC技術(shù)迅速取代了傳統(tǒng)的重編程手段, 向臨床應用更近一步。

1 iPSC和NSC應用于治療腦梗死

腦梗死與其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病不同，腦缺血發(fā)生后血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元都在一定程度上發(fā)生了破壞和死亡，因此與帕金森病只需要一種細胞不同，治療腦梗死需要細胞移植后分化的細胞種類更多,但是腦梗死是一次性的腦組織缺血損傷而非退行性改變，已經(jīng)缺血壞死的腦組織不會再持續(xù)的退化，因此細胞移植治療腦梗死不需要再進行基因修飾和重新編碼。Jiang等[9]在小鼠模型上初步完成了iPSC治療腦梗死的實驗，以評估治療的效果及風險，雖然移植后小鼠的功能得到了改善，但發(fā)現(xiàn)大量的iPSC細胞經(jīng)移植后死亡，只有少量細胞存活，且存在高致瘤性的問題。有報道稱經(jīng)顱內(nèi)直接注射細胞較硬膜下腔注射的方法導致畸胎瘤的概率增高。有研究將纖維蛋白膠與iPSC混合后移植入腦梗死小鼠的硬膜下腔，觀察到小鼠的功能改善，梗死面積縮小，且在6周后未發(fā)現(xiàn)腫瘤的形成，說明纖維蛋白膠可以一定程度上降低腫瘤發(fā)生的概率[10]。

由于iPSC的較高致瘤性和較低存活率，將未分化的iPSC直接用于治療腦梗死是不可行的，而移植后的iPSC需要先分化為神經(jīng)干細胞(neural stem cells NSC)，才能進一步分化成為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，生理條件下人的腦組織側(cè)腦室的腦室下層及海馬齒狀回粒內(nèi)含有一定量的神經(jīng)干細胞，這些細胞以膠質(zhì)細胞的狀態(tài)存在而不發(fā)揮功能，當神經(jīng)細胞受到損傷時這些神經(jīng)干細胞受到環(huán)境因素中某些信號因子的影響遷移、分化為神經(jīng)元而發(fā)揮功能。移植的NSC具有弱免疫原性的特點，進行細胞移植后很少發(fā)生免疫排斥的現(xiàn)象。此外，NSC的趨化性較強，由于微環(huán)境的作用，移植入體內(nèi)后可向病灶處遷移、增殖、分化。因此，有研究將iPSC-NSC移植應用于治療腦梗死[11]，目前已有多種方法可在體外成功地將iPSCs誘導為神經(jīng)干細胞[12-14]。有研究將人類iPSC-NSC移植到腦缺血大鼠的紋狀體，并使用MRI追蹤發(fā)現(xiàn)細胞經(jīng)注射區(qū)域沿著胼胝體遷移至腦梗死區(qū)域，與宿主細胞發(fā)生整合，取代受損的細胞重建神經(jīng)環(huán)路[15]。此外，神經(jīng)干細胞修復神經(jīng)系統(tǒng)的損傷可能還有以下機制：(1)NSC分化為多種類型的成熟神經(jīng)元、星狀細胞、少突膠質(zhì)細胞，修復、替代梗死后缺損的神經(jīng)細胞；(2)改變微環(huán)境，產(chǎn)生營養(yǎng)因子，如成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor)、表皮生長因子(epidermal growth factor)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor)等促進損傷修復作用的營養(yǎng)因子[16]；(3)減少了炎癥反應的發(fā)生、抑制了膠質(zhì)細胞的增生，且促進了室管膜下區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖和遷移，整體提高了神經(jīng)細胞的修復能力；(4)通過促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor)和促血管生成素的生成，從而促進新生血管的形成，為神經(jīng)功能的恢復提供充足的血供[17]。實驗證據(jù)表明無腫瘤細胞形成。Oki等[8]人將在體外獲得的iPSC-NSC移植到腦梗死小鼠模型的紋狀體，10周后發(fā)現(xiàn)移植的細胞存活率是10%。Oki等人在10只裸鼠身上再次重復這個試驗，48 h后進行神經(jīng)干細胞的移植，4個月后發(fā)現(xiàn)細胞的存活率為50%，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)72%的細胞表達成熟神經(jīng)元抗體，6%的細胞表達星形膠質(zhì)細胞的抗體，2個月后2只小鼠死亡，8只存活，4個月后4只小鼠死亡，6只存活，所以移植后2個月的存活率為80%，4個月為60%；4個月后77%的細胞表達成熟神經(jīng)元抗體，5%的細胞表達紋狀體細胞的標志物—多巴胺能和cAMP相關(guān)的神經(jīng)元磷蛋白(DARPP)-32，這個百分比與細胞直接移植到紋狀體后，存活的機率大致相同。這一發(fā)現(xiàn)預示著進行移植的部位(例如皮層、紋狀體)不影響細胞最終的存活，而在體外將iPSCs分化為神經(jīng)干細胞再進行移植比直接使用iPSCs更能提高細胞的存活率。

目前iPSC的應用存在最大的問題就是在基因整合的過程中腫瘤的發(fā)生，目前導致iPSC成瘤的因素還未明確。Riggs等[18]發(fā)現(xiàn)iPSCs與惡性肉瘤有部分細胞類型相同，在沉默基因與代謝活性方面存在某些共性，認為iPSC與癌細胞十分相似，腫瘤發(fā)生的原因可能就在于此。Park等[19]認為使用病毒作為載體將體細胞轉(zhuǎn)化為干細胞過程中會產(chǎn)生基因突變，導致腫瘤的發(fā)生。Mohammad等[20]用無病毒載體和無外源基因的編程方法誘導出iPSC，再將這些細胞分化成為神經(jīng)干細胞，并將這些細胞移植到腦梗死發(fā)生7 d后的實驗小鼠體內(nèi)，通過移除黏附物能力測試，測試到小鼠恢復了感知功能，且腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子也相應的增加，從而促進細胞的存活、生長及突觸的形成，12個月后測試無腫瘤形成。為了去除iPSC中的致腫瘤基因，Liu等[21]也使用相同的方法在缺氧的條件下僅使用2個因子將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)染為iPSC，并將其誘導為神經(jīng)干細胞注入腦缺血小鼠模型，小鼠的神經(jīng)功能缺損也得到了改善，且無腫瘤形成。Thier等[22]使用最新的技術(shù)，成功地激活了Oct4將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為iPSC，這種方法與傳統(tǒng)的iPSC技術(shù)相比生產(chǎn)速度提高了2～3倍，且細胞的致瘤性也得到了降低。有實驗表明當移植宿主存在免疫缺陷時會增加致瘤的風險[23]。

由于腦梗死的發(fā)病年齡老年化，因此Tatarishvili等[24]在24個月齡的大鼠身上完成了細胞移植治療腦梗死的實驗，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)干細胞移植8周后49%的細胞分化為成熟的γ氨基丁酸神經(jīng)元，圓筒實驗證明小鼠缺損的神經(jīng)功能明顯得到改善，且減少了小膠質(zhì)細胞的激活。目前大多數(shù)已發(fā)表的實驗都使用的是健康雄性鼠，將來還需要在雌性鼠及一些合并其他疾病的鼠身上開展實驗，如高血壓病、糖尿病等，這些都是腦梗死的危險因素[22]。

2 移植的時間窗和劑量

iPSC-NSC移植的重要問題之一就是腦梗死發(fā)生后細胞移植的時間，以往胚胎細胞移植的經(jīng)驗提示大腦中動脈閉塞致腦梗死發(fā)生后在第48 h移植細胞的存活率最高[25]，Shear等[26]認為腦梗死發(fā)生后第2～7 d為神經(jīng)干細胞移植的最佳時間，而非在這個時間點之前移植可能與急性期局部腦組織壞死、細胞釋放的炎癥介質(zhì)增高有關(guān)，且急性期的神經(jīng)營養(yǎng)因子較少，不利于細胞的生長，但是在腦梗死發(fā)生后第48 h這一時間點移植在臨床實施上比較困難，制備一定量的iPSC至少需要4周，再將其誘導為需要的神經(jīng)干細胞又需要幾周，而將這些細胞應用于臨床前還需要經(jīng)過一系列的實驗，確保其安全性。因此，以現(xiàn)在的制備技術(shù)達到時間窗的要求還十分的困難。

目前就腦梗死細胞移植劑量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計還十分匱乏，大部分的數(shù)據(jù)主要來自鼠胚胎神經(jīng)干細胞的實驗，Darsila等[27]分別將3×105、7.5×105和15×105數(shù)量的神經(jīng)干細胞移植到腦梗死小鼠模型的腦內(nèi)，結(jié)果顯示當移植細胞數(shù)超過3×105的時候，細胞的存活率將不再隨著細胞數(shù)的增加而增加，提示3×105數(shù)量的神經(jīng)干細胞可以以最小的數(shù)目發(fā)揮較好的治療效果。Wang等[28]認為8×105數(shù)量的神經(jīng)干細胞治療腦梗死的Wistar大鼠為最佳數(shù)目。此項實驗還沒有在與人類腦體積和構(gòu)造相似的大型動物身上實踐過，所以應用人體的細胞數(shù)量可否依據(jù)這些實驗的細胞數(shù)據(jù)成比例計算還不明確。

3 展 望

目前對iPSC的定向誘導和神經(jīng)干細胞的移植治療腦梗死實驗研究已有很多，但還都停留在探索階段，以iPSC為基礎(chǔ)的細胞療法在治療腦梗死方面存在著巨大的潛力，但還有很多問題亟待明確，如iPSC的致瘤性、神經(jīng)干細胞移植的數(shù)量、時間、部位(缺血半暗帶內(nèi)還是梗死區(qū)域)。為了保證iPSC和NSC的質(zhì)量和減少制備時間，將來需要建立統(tǒng)一來源的iPSC細胞儲備庫，提供優(yōu)質(zhì)來源細胞，增加移植后的安全系數(shù)，使細胞移植治療腦梗死應用于臨床早日實現(xiàn)。

[1] 侯書敏,張東,黨國義.腦梗死臨床治療研究進展[J].河北醫(yī)學,2012,18(12):1799-1801.

[2] Kelly S,Bliss TM,Shah AK,et al.Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(32):11839-11844.

[3] Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[4] Hanna J,Markoulaki S,Schorderet P,et al.Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency[J].Cell,2008,133(2):250-264.

[5] Aoi T,Yae K,Nakagawa M,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells[J].Science,2008,321(5889):699-702.

[6] Kim JB,Sebastiano V,Wu G,et al.Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells[J].Cell,2009,136(3):411-419.

[7] Dimos JT,Rodolfa KT,Niakan KK,et al.Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons[J].Science,2008,321(5893):1218-1221.

[8] Oki K,Tatarishvili J,Wood J,et al.Human-induced pluripotent stem cells form functional neurons and improve recovery after grafting in stroke-damaged brain[J].Stem Cells,2012,30(6):1120-1133.

[9] Jiang M,Lv L,Ji H,et al.Induction of pluripotent stem cells transplantation therapy for ischemic stroke[J].Mol Cell Biochem,2011,354(1/2):67-75.

[10] Chen SJ,Chang CM,Tsai SK,et al.Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue[J].Stem Cells Dev,2010,19(11):1757-1767.

[11] Chang DJ,Lee N,Park IH,et al.Therapeutic potential of human induced pluripotent stem cells in experimental stroke[J].Cell Transplant,2013,22(8):1427-1440.

[12] Hoveizi E,Ebrahimi-Barough S,Tavakol S,et al.In vitro differentiation of human iPS cells into neural like cells on a biomimetic polyurea[J].Mol Neurobiol,2017,54(1):601-607.

[13] Su H,Wang L,Huang W,et al.Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells[J].Stem Cell Res,2013,10(3):338-348.

[14] Stover AE,Brick DJ,Nethercott HE,et al.Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling[J].J Neurosci Res,2013,91(10):1247-1262.

[15] Mochizuki N,Moriyama Y,Takagi N,et al.Intravenous injection of neural progenitor cells improves cerebral ischemia-induced learning dysfunction[J].Biol Pharm Bull,2011,34(2):260-265.

[16] Waschek JA.Noggin on heaven's door: a factor that promotes the selective production of serotonergic neurons from murine embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells[J].J Neurochem,2012,122(1):1-3.

[17] Jiang Q,Zhang ZG,Ding GL,et al.Investigation of neural progenitor cell induced angiogenesis after embolic stroke in rat using MRI[J].Neuroimage,2005,28(3):698-707.

[18] Riggs JW,Barrilleaux BL,Varlakhanova N,et al.Induced pluripotency and oncogenic transformation are related processes[J].Stem Cells Dev,2013,22(1):37-50.

[19] Park TS,Huo JS,Peters A,et al.Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors[J].PLoS One,2012,7(8):e42838.

[20] Mohamad O,Drury-Stewart D,Song M,et al.Vector-free and transgene-free human iPS cells differentiate into functional neurons and enhance functional recovery after ischemic stroke in mice[J].PLoS One,2013,8(5):e64160.

[21] Liu SP,Fu RH,Wu DC,et al.Mouse-induced pluripotent stem cells generated under hypoxic conditions in the absence of viral infection and oncogenic factors and used for ischemic stroke therapy[J].Stem Cells Dev,2014,23(4):421-433.

[22] Thier M,W rsd rfer P,Lakes YB,et al.Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells[J].Cell Stem Cell,2012,10(4):473-479.

[23] Nelson TJ,Martinez-Fernandez A,Yamada S,et al.Repair of acute myocardial infarction by human stemness factors induced pluripotent stem cells[J].Circulation,2009,120(5):408-416.

[24] Tatarishvili J,Oki K,Monni E,et al.Human induced pluripotent stem cells improve recovery in stroke-injured aged rats[J].Restor Neurol Neurosci,2014,32(4):547-558.

[25] Fisher M,Feuerstein G,Howells DW,et al.Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations[J].Stroke,2009,40(6):2244-2250.

[26] Shear DA,Tate CC,Tate MC,et al.Stem cell survival and functional outcome after traumatic brain injury is dependent on transplant timing and location[J].Restor Neurol Neurosci,2011,29(4):215-225.

[27] Darsalia V,Allison SJ,Cusulin C,et al.Cell number and timing of transplantation determine survival of human neural stem cell grafts in stroke-damaged rat brain[J].J Cereb Blood Flow Metab,2011,31(1):235-242.

[28] Wang L,Cui WY,Wang XP,et al.Different quantities of neural stem cells transplantation in treating experimental cerebral infarction[J].Chinese Journal of Tissue Engineering Research,2012,16(1):90-94.