研究背景

人類和嚙齒類動(dòng)物影像學(xué)研究表明，扣帶回在疼痛感覺過程中處于持續(xù)激活狀態(tài)。嚙齒類疼痛模型動(dòng)物前扣帶回(ACC)體外電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACC與疼痛記憶有關(guān)。然而，基于細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)化學(xué)、纖維聯(lián)系以及不同的活動(dòng)模式區(qū)分扣帶回亞區(qū)的功能研究仍很少，并且這些解剖學(xué)的差異如何轉(zhuǎn)化為功能上的差異仍是未知。盡管疼痛異常敏感病人MCC呈持續(xù)激活狀態(tài)，但是MCC在疼痛中的作用并不明確。此外，關(guān)于其通路及作用區(qū)域的機(jī)制研究也未見報(bào)道。該研究在清醒的小鼠上進(jìn)行光遺傳操作、環(huán)路研究和功能性評(píng)估，討論了MCC在傷害性感受、急性疼痛和疼痛過程中亞急性可塑性中的具體作用。

主要研究結(jié)果

該研究使用重組Camk2a啟動(dòng)子的腺病毒載體(rAAV-CaMKII-ArchT-Venus)將古紫質(zhì)質(zhì)子泵（ArchT，黃光控制）和光敏感通道視紫紅質(zhì)蛋白2（ChR2，藍(lán)光控制）導(dǎo)入MCC全層來抑制或刺激MCC神經(jīng)元活動(dòng)，光纖的最佳位置通過c-Fos表達(dá)情況來確定，并通過全細(xì)胞膜片鉗和體內(nèi)四極電極記錄來檢測(cè)操縱神經(jīng)元活動(dòng)的有效性。

將辣椒素注入小鼠后爪后， MCC各層神經(jīng)元中c-Fos蛋白表達(dá)顯著增加。在辣椒素注射后15～30 min內(nèi)，黃光激活A(yù)rchT以阻斷MCC神經(jīng)元活動(dòng)，c-Fos表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著減少。但是辣椒素誘發(fā)的急性疼痛行為并沒有減輕。黃光作用于表達(dá)ArchT的大腦第一軀體感覺皮質(zhì)后肢區(qū)(S1HL)時(shí)也產(chǎn)生相似的結(jié)果。使用雙纖維方法同時(shí)抑制MCC和S1HL也不會(huì)影響辣椒素誘發(fā)的急性疼痛行為，這表明辣椒素誘發(fā)的急性痛存在多種通路。

同樣，ArchT介導(dǎo)的MCC或S1HL抑制對(duì)足底機(jī)械性刺激（von Frey纖維）引發(fā)的后爪急性縮腿行為沒有影響。同時(shí)抑制MCC和S1HL神經(jīng)元活動(dòng)，小鼠對(duì)有害和無(wú)害機(jī)械性刺激的敏感性增強(qiáng)，這一作用僅發(fā)生在黃光照射的時(shí)間內(nèi)，此后并沒有持續(xù)。該結(jié)果表明，MCC與第一軀體感覺區(qū)(S1)共同參與疼痛抑制通路的緊張性調(diào)節(jié)。

接著，研究者在傷害性活動(dòng)誘導(dǎo)的中樞可塑性模型中探討了MCC和S1HL的功能。利用病毒注射小鼠，研究者觀察到MCC和S1HL的活動(dòng)對(duì)于C纖維傷害性感受器誘發(fā)中樞可塑性是必需的。在后爪注射辣椒素后15～30 min內(nèi)抑制MCC或S1HL活動(dòng)并用von Frey纖維刺激，發(fā)現(xiàn)機(jī)械性痛覺過敏消失。然而，在辣椒素注射后45～60 min接受機(jī)械性刺激，對(duì)照小鼠（僅接受光纖植入）和S1HL抑制小鼠表現(xiàn)出明顯的高敏感性，而MCC 抑制小鼠則沒有這種表現(xiàn)。表明MCC而非S1HL皮層神經(jīng)元的持續(xù)興奮在痛覺過敏的維持過程起作用。

在辣椒素注射后15～30 min僅在機(jī)械性刺激期間抑制MCC活動(dòng)，痛覺超敏反應(yīng)受到抑制，但在45～60 min又完全恢復(fù)持久性痛敏。這表明，與刺激無(wú)關(guān)的MCC神經(jīng)元持續(xù)活動(dòng)對(duì)于與痛覺敏化有關(guān)的皮質(zhì)回路的長(zhǎng)期興奮非常重要。體內(nèi)電生理記錄也顯示，在辣椒素注射后15～30 min后，痛覺超敏行為明顯，MCC活動(dòng)持續(xù)增加。

為了探討MCC持續(xù)興奮性活動(dòng)對(duì)傷害性活動(dòng)誘導(dǎo)的中樞可塑性的影響，研究者在辣椒素注射后不同階段對(duì)MCC進(jìn)行了抑制。在辣椒素注射后0～15 min（痛覺感受器激活期）持續(xù)抑制MCC神經(jīng)元活動(dòng)，在15～30 min時(shí)完全阻止了機(jī)械性超敏反應(yīng)。然而，這些小鼠在45～60 min時(shí)又出現(xiàn)了機(jī)械性痛覺超敏現(xiàn)象，盡管明顯低于對(duì)照小鼠。為了確定這是否由MCC神經(jīng)元的持續(xù)興奮引起，研究者僅在辣椒素注射后30～45 min內(nèi)抑制表達(dá)ArchT小鼠的MCC活性，發(fā)現(xiàn)在45～60 min時(shí)顯著降低了機(jī)械敏感性。

相反，在表達(dá)ArchT和ChR2的小鼠，在局部注射辣椒素后15～30 min內(nèi)用黃光刺激，在45～60 min內(nèi)以藍(lán)光(473 nm) 刺激MCC（激活MCC神經(jīng)元），小鼠機(jī)械性痛覺敏感性顯著增強(qiáng)，這和記憶的恢復(fù)過程類似。這些結(jié)果表明，在急性外周C傷害性纖維激活后，MCC神經(jīng)元在不同時(shí)相的持續(xù)活動(dòng)對(duì)于誘導(dǎo)和維持痛覺過敏反應(yīng)相關(guān)的中樞可塑性來說是必需的。

研究者測(cè)試了急性抑制MCC是否可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的長(zhǎng)期超敏反應(yīng)。在足底注射完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)的長(zhǎng)期炎癥性疼痛模型中，在CFA后24小時(shí)，黃光照射ArchT表達(dá)小鼠的MCC，部分但顯著地減輕了機(jī)械性痛覺過敏。與此相反，周圍神經(jīng)病變（坐骨神經(jīng)損傷模型，SNI）引起的機(jī)械性異常疼痛在很大程度上不受急性抑制MCC的影響，這表明MCC對(duì)長(zhǎng)期疼痛具有選擇性作用，炎性痛與神經(jīng)病理性疼痛引起的機(jī)械性痛覺超敏具有不同的中樞機(jī)制，而MCC參與炎性痛誘發(fā)的機(jī)械性痛覺超敏。

接下來，研究者檢測(cè)了MCC活動(dòng)本身是否足以誘導(dǎo)行為可塑性改變。在表達(dá)ChR2小鼠MCC切片，持續(xù)15 min的全細(xì)胞記錄顯示，在整個(gè)15 min的光照周期內(nèi)，錐體神經(jīng)元持續(xù)激活，與藍(lán)色光照強(qiáng)度改變成正比。與10 Hz相比，在20 Hz和30 Hz頻率下MCC神經(jīng)元的動(dòng)作電位明顯增加。在清醒的表達(dá)ChR2小鼠上進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)，觀察到在同側(cè)和對(duì)側(cè)MCC中c-Fos表達(dá)神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加。用藍(lán)光激活表達(dá)ChR2小鼠MCC神經(jīng)元，同時(shí)以von Frey纖維機(jī)械性刺激爪底，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)明顯的機(jī)械性痛覺超敏行為，這類似于外周傷害性刺激誘導(dǎo)的痛敏。

本文作者之后研究了MCC環(huán)路是否參與中樞可塑性。在研究的10個(gè)與疼痛感覺有關(guān)的腦區(qū)中，只有伏隔核(NAc)、后島葉(PI)以及鄰近腦區(qū)屏狀核c-Fos表達(dá)模式呈雙向調(diào)控，這與在無(wú)辣椒素時(shí)通過ChR2激活MCC或通過ArchT抑制MCC聯(lián)合足底注射辣椒素時(shí)痛覺超敏反應(yīng)的雙向變化一致。研究者還觀察到內(nèi)側(cè)丘腦的活性在MCC激活和辣椒素處理時(shí)都沒有變化。盡管在追蹤實(shí)驗(yàn)中，研究者觀察到基底外側(cè)杏仁核在結(jié)構(gòu)上接受來自MCC興奮性神經(jīng)元的傳入，但在杏仁核中并未看到特異性的MCC驅(qū)動(dòng)的c-Fos蛋白表達(dá)。在與MCC有解剖關(guān)系的前額前邊緣和下邊緣皮層，抑制MCC幾乎完全抑制辣椒素誘導(dǎo)的c-Fos表達(dá)。然而，直接光刺激MCC并沒有引起邊緣前皮層和邊緣下皮層產(chǎn)生明顯的c-Fos表達(dá)，這提示連接的復(fù)雜性和間接性。同樣，前島葉、S1HL和中央杏仁核在抑制和激活MCC時(shí)，c-Fos表達(dá)沒有出現(xiàn)雙向變化。因此，只有PI和NAc表現(xiàn)出c-Fos表達(dá)的雙向變化，與MCC活性的雙向變化高度吻合。因此，研究者推測(cè)從MCC到PI和NAc的下行投射會(huì)影響痛覺可塑性和痛覺過敏的誘導(dǎo)。

為了進(jìn)一步研究激活的MC-PI和MCC-NAc投射是否在功能上參與了痛覺過敏的誘導(dǎo)，研究者利用光遺傳技術(shù)直接刺激或抑制MCC到PI或NAc的投射。首先，用表達(dá)改良的ArchT即 eArchT的腺病毒來感染單側(cè)MCC神經(jīng)元。然后，在對(duì)側(cè)后肢注射辣椒素激活MCC后15～30 min的行為測(cè)試中，通過在目標(biāo)區(qū)域（PI或NAc）放置光纖進(jìn)行光照抑制表達(dá)。抑制單側(cè)MCC-NAc投射在早期階段僅對(duì)對(duì)側(cè)后爪的機(jī)械性超敏反應(yīng)產(chǎn)生很小的影響，并且在后期的測(cè)試中并沒有效果。與表達(dá)GFP的小鼠相比，表達(dá)eArchT小鼠用黃光照射單側(cè)MCC-PI投射，不僅在注射辣椒素后15～30 min，而且在45～60 min明顯抑制了對(duì)側(cè)后爪的機(jī)械性超敏反應(yīng)。在另一組小鼠中，直接抑制MCC-PI通路的靶區(qū)即PI神經(jīng)元，辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械痛覺超敏反應(yīng)被抑制。在沒有辣椒素刺激的情況下，抑制MCC-PI投射后基礎(chǔ)痛覺敏感性沒有變化。因此，抑制PI再現(xiàn)了抑制MCCPI投射所引起的主要表型變化。

在第二種方法中，研究者通過病毒使MCC興奮性神經(jīng)元表達(dá)ChR2，并將光纖分別置于投射區(qū)PI或Nac來直接光照激活MCC-PI投射和MCCNAc投射。與只表達(dá)GFP的小鼠相比，藍(lán)光照射表達(dá)ChR2的MCC-PI投射，而不是表達(dá)ChR2的MCC-Nac投射，在無(wú)后爪注射辣椒素的情況下，誘導(dǎo)了顯著的機(jī)械性超敏反應(yīng)。因此，直接刺激MCC-PI投射，而不是MCC-NAc投射，很大程度重現(xiàn)了刺激MCC興奮神經(jīng)元時(shí)觀察到的超敏反應(yīng)。

調(diào)節(jié)MCC-PI或MCC-Nac投射并沒有影響運(yùn)動(dòng)機(jī)能和功能，說明這些行為結(jié)果沒有受到運(yùn)動(dòng)功能的明顯干擾，而且MCC-PI投射并不參與MCC引發(fā)的恐懼反應(yīng)。

最后，研究者試圖探討MCC和MCC-PI通路是否僅通過脊髓上機(jī)制導(dǎo)致傷害性行為的敏化，或者它們是否通過下行調(diào)制作用于脊髓傷害性過程。研究者用30 Hz刺激表達(dá)ChR2小鼠MCC神經(jīng)元或MCC-PI投射。光遺傳激活ChR2表達(dá)小鼠MCC或MCC-PI通路誘導(dǎo)發(fā)生明顯的超敏反應(yīng)，但對(duì)鞘內(nèi)注射格拉司瓊（5-HT拮抗劑）的小鼠卻沒有作用，表明在MCC以及MCC-PI通路的促疼痛功能中，下行5-HT起重要作用。單獨(dú)注射格拉司瓊對(duì)基礎(chǔ)機(jī)械性痛敏無(wú)影響。熒光共聚焦顯微鏡顯示，PI發(fā)出興奮性投射至中縫大核（下行5-HT能投射的起點(diǎn)）。這些都提示MCC-PI通路作用于下行5-HT易化系統(tǒng)而誘發(fā)機(jī)械性痛覺超敏。

綜上所述，MCC-PI投射在C纖維激活后產(chǎn)生并維持傷害性痛覺超敏反應(yīng)，在缺乏條件性傷害性傳入的情況下，激活MCC-PI通路足以誘發(fā)痛覺超敏，并且不引起刺激依賴的恐懼或負(fù)面情緒。

討 論

關(guān)于扣帶回亞區(qū)功能的劃分仍不清楚。盡管關(guān)于人類影像學(xué)已經(jīng)證明ACC亞區(qū)與疼痛、厭惡情緒具有廣泛的相關(guān)性，但是由于缺乏干預(yù)操作，它們與痛覺超敏之間的因果聯(lián)系尚不明確。該研究結(jié)果揭示了MCC腦區(qū)可以調(diào)控小鼠的痛覺過敏，但不能調(diào)控小鼠的急性疼痛或與情感相關(guān)的行為。

雖然光遺傳學(xué)不能同時(shí)靶向整個(gè)MCC所有的神經(jīng)細(xì)胞和亞區(qū)，但是在被照射區(qū)域內(nèi)控制80%的興奮性神經(jīng)元的活動(dòng)就足以調(diào)節(jié)痛覺可塑性，但不能調(diào)節(jié)急性疼痛或情緒。對(duì)ACC在嚙齒類動(dòng)物疼痛中的作用研究表明，ACC在疼痛相關(guān)負(fù)面情緒中具有特異性作用，但在疼痛感覺中卻不起作用。大多數(shù)關(guān)于扣帶回功能對(duì)痛覺影響的研究都是針對(duì)于rACC，而該研究著眼于MCC，并基于靶向特定功能的亞區(qū)和闡明環(huán)路的作用，在細(xì)胞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)水平分析疼痛的不同組成部分。

研究數(shù)據(jù)顯示，雖然S1皮質(zhì)和MCC對(duì)于強(qiáng)烈的痛覺傳入誘導(dǎo)早期行為可塑性很重要，但是只有MCC興奮性神經(jīng)元的持續(xù)活動(dòng)才會(huì)在中止外周傳入后過渡到亞急性痛敏的維持中起作用。關(guān)于病理性疼痛狀態(tài)的長(zhǎng)期可塑性，研究者觀察到MCC對(duì)炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛的不同作用。盡管這兩種慢性疼痛狀態(tài)都涉及中樞可塑性，但人們普遍認(rèn)為，它們的機(jī)制和潛在途徑存在很大差異，不僅涉及到周邊傳入因素，還涉及到參與中樞神經(jīng)環(huán)路。目前，膠質(zhì)細(xì)胞依賴性的機(jī)制和與情感、情緒和獎(jiǎng)賞相關(guān)的環(huán)路是神經(jīng)性疼痛的決定因素。該研究觀察到急性抑制MCC神經(jīng)元可以部分地但是明顯地逆轉(zhuǎn)炎癥性痛覺過敏。

通過光遺傳抑制或激活MCC，暫時(shí)控制MCC活動(dòng)以及基于c-Fos的腦區(qū)描繪，研究揭示了MCC是調(diào)節(jié)超敏感狀態(tài)環(huán)路的關(guān)鍵點(diǎn)，為MCC在受到刺激時(shí)能快速作出行為適應(yīng)控制提供了功能證據(jù)，這些已經(jīng)在人類影像學(xué)研究中得到了預(yù)測(cè)?；赾-Fos的活動(dòng)圖譜，研究者觀察到MCC相關(guān)網(wǎng)絡(luò)跨越幾個(gè)皮層和皮層下區(qū)域，包括最近被證明可以調(diào)節(jié)中樞疼痛處理的前額皮質(zhì)的其他區(qū)域。然而，功能聯(lián)系最明確的是MCC與PI、NAc和屏狀核。

該研究尚未確定MCC和MCC-PI通路是如何控制感覺過敏的。有幾種可能的機(jī)制，如調(diào)節(jié)預(yù)期的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（包括MCC而非rACC），影響注意力，調(diào)節(jié)特殊神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（其中包括MCC作為接頭），調(diào)節(jié)上行脊髓丘腦和丘腦皮質(zhì)傷害性信息傳入到PI，或者通過下行控制途徑調(diào)節(jié)脊髓傷害性信息處理過程。MCC在解剖學(xué)上也與扣帶運(yùn)動(dòng)前區(qū)有關(guān)，該區(qū)域被認(rèn)為是可以直接控制對(duì)刺激威脅作出適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)反應(yīng)。最近的研究表明，在疼痛期間激活的MCC腦區(qū)和運(yùn)動(dòng)控制腦區(qū)之間存在緊密的重疊。有多條證據(jù)顯示PI與編碼強(qiáng)度有關(guān)，因此，MCC-PI連接可能利用PI的這一功能在疼痛過程中增強(qiáng)疼痛感覺。MCC調(diào)控痛覺過敏的最終下游過程是通過脊髓痛覺加工的下行易化來實(shí)現(xiàn)的，而不是依賴于上述MCC激活后的脊髓上機(jī)制。事實(shí)上，PI在解剖學(xué)上和功能上都與中縫大核相關(guān)，這是5-HT能調(diào)控的起點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)MCC-PI通路通過招募下行5-HT能機(jī)制來影響痛覺。起源于中縫大核的5-HT能通路在脊髓中發(fā)揮了顯著的促進(jìn)調(diào)節(jié)作用，最近有報(bào)道稱，光遺傳激活腦干5-HT能神經(jīng)元可誘發(fā)痛覺過敏。

關(guān)于皮層可塑性是否僅僅反映了在痛覺通路初始部分的活動(dòng)依賴性致敏現(xiàn)象，或者皮層的結(jié)構(gòu)和功能可塑性是否會(huì)導(dǎo)致病理性疼痛，還存在爭(zhēng)論。該研究認(rèn)為僅激活MCC-PI投射，就能產(chǎn)生不依賴于外周傷害性信息傳入的痛覺過敏。這對(duì)沒有明顯損傷或身體疾病的病人的疼痛敏感性的變化（或是在治療后的持續(xù)疼痛）具有重要意義。因此，該研究為心理社會(huì)因素加重疼痛提供了一種可能機(jī)制，這些因素可能會(huì)抑制MCC和PI的基本活動(dòng)。綜上所述，該研究結(jié)果提示皮層神經(jīng)環(huán)路參與從急性疼痛到長(zhǎng)期疼痛的轉(zhuǎn)變。