余娟 徐彥召 劉興友

摘要 本文介紹了流式細(xì)胞術(shù)的工作原理，闡述了流式細(xì)胞術(shù)近年來在獸醫(yī)病毒感染診斷、寄生蟲診斷、微量元素檢測3個方面的臨床應(yīng)用研究，并展望了流式細(xì)胞術(shù)在畜禽疾病診斷和預(yù)防方面的應(yīng)用前景，以期為流式細(xì)胞術(shù)在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 流式細(xì)胞術(shù)；病毒感染；寄生蟲診斷；微量元素

中圖分類號 R446 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）21-0239-02

Application Research of Flow Cytometry in Veterinary Clinic

YU Juan 1 XU Yan-zhao 1 LIU Xing-you 2 *

（1 Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang Henan 453003； 2 Xinxiang University）

Abstract This paper introduced the working principle of flow cytometry，expounded the application research of flow cytometry in veterinary virus infection，parasites diagnosis，trace element detection，and its application prospect in livestock and poultry disease diagnosis and prevention were prospected，in order to provide references for the application of flow cytometry in veterinary clinic.

Key words flow cytometry；virus infection；parasites diagnosis；trace element detection

流式細(xì)胞術(shù)是一種現(xiàn)代細(xì)胞檢測技術(shù)，即利用流式細(xì)胞儀對懸浮于流體中的細(xì)胞或其他生物微粒進(jìn)行理化特征分析、計(jì)數(shù)和分選[1]。早期主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的腫瘤學(xué)和血液學(xué)研究，近年來，隨著免疫學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展、相互滲透和交叉，已應(yīng)用到細(xì)菌、真菌和病毒的快速檢測及微生物群落結(jié)構(gòu)領(lǐng)域。此外，這一技術(shù)不僅應(yīng)用于科研、教學(xué)等不同領(lǐng)域的研究，而且為畜牧生產(chǎn)等領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的工具。

1 工作原理

流式細(xì)胞術(shù)檢測的對象是細(xì)胞，并且是懸浮于液體中、呈獨(dú)立狀態(tài)的細(xì)胞。在一定壓力下，鞘液帶著懸浮的細(xì)胞進(jìn)入流式照射室，特定波長的激光束直接照射到細(xì)胞后發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光，細(xì)胞上結(jié)合的熒光素被激光激發(fā)后產(chǎn)生熒光，不同顏色的熒光被雙色反光鏡轉(zhuǎn)向不同的光電倍增管檢測器，轉(zhuǎn)換成電信號，被相應(yīng)的接收器接收后放大，再經(jīng)過數(shù)據(jù)化處理輸入電腦并儲存，從而分析出每個細(xì)胞的物理化學(xué)特征。

2 在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用研究

2.1 病毒感染診斷方面

流式細(xì)胞術(shù)是一種簡便、快速分析待測細(xì)胞的種類、亞類及其功能等特性的技術(shù)，最早應(yīng)用于人醫(yī)免疫檢測，近年來已廣泛應(yīng)用于免疫細(xì)胞表面標(biāo)志及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測等方面[2]。淋巴細(xì)胞亞群（如CD3、CD4和CD8）和表型分析在免疫功能檢測中具有重要的意義，特別是隨著近年來免疫學(xué)研究的快速發(fā)展，淋巴細(xì)胞亞群和表型分析也廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床研究。CD3分子與T細(xì)胞抗原受體（TCR）通過非共價鍵連接，形成TCR_CD3復(fù)合物，TCR識別抗原后，通過CD3傳導(dǎo)刺激信號，在體外可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用，增強(qiáng)T細(xì)胞、LAK細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷力。CD4分子主要分布在淋巴細(xì)胞和胸腺細(xì)胞表面，有黏附、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)和HIV受體等功能[3]。CD8分子是細(xì)胞間黏附分子，也分布于淋巴細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的表面，具有信號傳導(dǎo)作用。

在獸醫(yī)臨床上，檢測淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)數(shù)量及比值的變化對疾病預(yù)防及治療進(jìn)程的監(jiān)測具有重要意義[4]。李 華等[5]利用流式細(xì)胞術(shù)通過檢測SPF仔豬感染PRRS病毒后BJ-4外周血淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)，得出淋巴細(xì)胞各亞群的比例下降，抑制了機(jī)體對病原體的免疫反應(yīng)，這些比值變化也揭示了其他病原體的混合感染或繼發(fā)感染。司興奎等[6]利用流式細(xì)胞術(shù)對豬前腔靜脈血中的CD4/CD8進(jìn)行檢測，研究了豬圓環(huán)病毒2型感染對偽狂犬疫苗免疫應(yīng)答的影響，結(jié)果表明，PCV2感染在一定程度上影響了機(jī)體T細(xì)胞和B細(xì)胞對抗原的識別功能，抑制了機(jī)體特異性細(xì)胞免疫，這一研究對臨床PR疫苗免疫具有重要意義。齊 偉[7]以流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)，對REV感染的SPF雛雞免疫器官中淋巴細(xì)胞周期分布及CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量及比值變化進(jìn)行檢測，研究了REV感染對SPF雛雞免疫器官的免疫功能的影響，為RE的防治提供了理論基礎(chǔ)。鄒 璐等[8]對不同日齡仔豬外周血T淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測與分析，建立了健康仔豬外周血淋巴細(xì)胞亞群的臨床參考范圍，為不同生長階段仔豬的免疫系統(tǒng)功能水平監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)。通過對畜禽淋巴細(xì)胞各亞群的數(shù)量和比值變化測定來監(jiān)控畜禽的免疫狀態(tài)，監(jiān)控畜禽病毒傳染性疾病，能制定更有效的預(yù)防治療措施。

2.2 寄生蟲診斷方面

畜禽寄生蟲病感染宿主在臨床上多處于非清除性免疫狀態(tài)，寄生蟲種類多，分布廣泛，重復(fù)感染機(jī)會很多，嚴(yán)重影響動物的身體健康，損害其繁殖性能，抑制幼年動物的生長發(fā)育，極大地削弱了其生產(chǎn)性能，導(dǎo)致畜產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量降低。

近年來，隨著流式細(xì)胞儀的推廣應(yīng)用，利用流式細(xì)胞術(shù)在寄生蟲感染診斷方面的研究應(yīng)用也較廣。崔 洋等[9]利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟巨噬細(xì)胞后膜分子CD36和CD64的變化動態(tài)，結(jié)果表明，隨著感染時間的延長，CD36和CD64表達(dá)水平逐漸升高至峰值，并通過吞噬方式殺傷瘧原蟲，此研究證明巨噬細(xì)胞是小鼠發(fā)揮抗瘧原蟲感染的保護(hù)性效應(yīng)細(xì)胞。周永華等[10]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對弓形蟲感染后大鼠外周血T細(xì)胞亞群的變化進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，機(jī)體在抗弓形蟲感染免疫中，T細(xì)胞亞群產(chǎn)生了大量的細(xì)胞因子，在抗弓形蟲感染中起著重要的作用。徐 鵬等[11]運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對仔豬人工感染豬囊尾蚴蟲后外周血中淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)變化進(jìn)行了研究，通過對CD3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的檢測，客觀地反映了機(jī)體細(xì)胞免疫狀況。利用流式細(xì)胞術(shù)從細(xì)胞水平上檢測寄生蟲感染后淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，對寄生蟲病的預(yù)防控制與早期治療具有重要意義，已應(yīng)用于多種寄生蟲感染的輔助檢查，可以較快獲知感染時期、感染程度等。

2.3 微量元素檢測方面

微量元素是動物體必需的營養(yǎng)元素，直接參與機(jī)體幾乎所有的生理、生化活動，對動物的新陳代謝、生長發(fā)育及生產(chǎn)性能影響較大。因此，在畜禽日糧中微量元素的添加日益受到關(guān)注。由于對飼料中微量元素含量及其利用率缺乏系統(tǒng)準(zhǔn)確的分析，生產(chǎn)中微量元素添加存在盲目性，且添加量普遍過高[12]。過量的微量元素大部分隨排泄物進(jìn)入環(huán)境，造成環(huán)境污染。

研究微量元素日糧對畜禽生產(chǎn)性能的影響，對提高微量元素的利用率、減少排放和控制環(huán)境污染具有重要意義。崔恒敏等[13]利用流式細(xì)胞術(shù)研究了銅添加量對雛雞淋巴細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，日糧銅含量超過400 mg/kg，活性淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損。龔 濤等[14]研究了高氟日糧對雛雞肝細(xì)胞周期和凋亡的影響，流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，日糧含氟400 mg/kg時，對雛雞肝臟生長發(fā)育無顯著影響；但是日糧含氟800、1 200 mg/kg時，能增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖能力，使凋亡細(xì)胞顯著增多。陳 濤等[15]用流式細(xì)胞術(shù)研究了高氟日糧對雛雞法氏囊淋巴細(xì)胞增殖分化的影響發(fā)現(xiàn)，日糧含氟400 mg/kg時，對雛雞法氏囊生長發(fā)育無顯著影響；而日糧含氟800、1200 mg/kg時，會引起法氏囊淋巴細(xì)胞增殖分化受阻，法氏囊生長發(fā)育受抑，凋亡細(xì)胞顯著增多，機(jī)體體液免疫功能受損。崔 偉等[16]用流式細(xì)胞術(shù)研究了高銅對雛鴨腎臟細(xì)胞周期和凋亡的影響，結(jié)果表明，日糧添加銅達(dá)到400 mg/kg以上時，腎臟細(xì)胞增殖分化嚴(yán)重受阻，腎臟細(xì)胞凋亡大量增加，導(dǎo)致腎臟功能嚴(yán)重受損。彭西[17]利用流式細(xì)胞術(shù)研究日糧硒對雛雞免疫功能影響的機(jī)理發(fā)現(xiàn)，日糧硒水平達(dá)到5 mg/kg以上會導(dǎo)致免疫器官細(xì)胞分裂增殖能力下降、凋亡細(xì)胞增多；外周血T淋巴細(xì)胞增殖能力降低，CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)量下降，進(jìn)而導(dǎo)致免疫器官生長發(fā)育受阻，出現(xiàn)病理損傷，嚴(yán)重影響其生長發(fā)育。

微量元素作為多種酶的構(gòu)成成分和活性成分，同時也是動物體內(nèi)免疫因子之一，從消化、吸收、利用各個層次調(diào)控動物體內(nèi)能量、蛋白質(zhì)等的代謝過程，并調(diào)控機(jī)體內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)體內(nèi)離子平衡和滲透壓，調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)體液機(jī)制和免疫反應(yīng)等，對動物健康至關(guān)重要[18-19]?？茖W(xué)合理添加日糧中微量元素的含量不僅能提高畜禽的生產(chǎn)性能，而且可以減少微量元素的濫用排放，降低養(yǎng)殖業(yè)對環(huán)境的污染。

3 展望

流式細(xì)胞術(shù)是對單細(xì)胞進(jìn)行定量分析和分選的一門檢測技術(shù)，具有分析快速[20-21]、檢測指標(biāo)多、數(shù)據(jù)量大、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)等領(lǐng)域的研究中已得到廣泛應(yīng)用。近年來，隨著各新型流式細(xì)胞儀的開發(fā)，各熒光染料的充分發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)在畜禽疾病診斷方面的研究也較為普遍，為畜牧養(yǎng)殖業(yè)提供了重要的診斷依據(jù)[22-25]。隨著流式細(xì)胞儀小型化、操作簡單化的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)在畜禽疾病診斷和預(yù)防方面將有更廣闊的應(yīng)用前景。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 賈永蕊.流式細(xì)胞術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：1-34.

[2] 陳朱波，曹雪濤.流式細(xì)胞術(shù)：原理、操作及應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2014：102-232.

[3] 金伯泉.細(xì)胞和分子免疫學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：3-34.

[4] 孫慶申，蔡雪暉，童光志.CD4和CD8分子在細(xì)胞免疫中的作用及其與PRRSV感染的關(guān)系[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2002，24（2）：151-152.

[5] 李華，楊漢春，許勇鋼，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)[J].中國免疫學(xué)雜志，2001，17（4）：208-211.

[6] 司興奎，張濟(jì)培，陳建紅，等.豬圓環(huán)病毒2型感染對偽狂犬疫苗免疫應(yīng)答的影響[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32（1）：60-64.

[7] 齊偉.REV感染對SPF雛雞免疫器官免疫功能及Cyclin D1表達(dá)的影響[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[8] 鄒璐，張景艷，張凱，等.不同日齡仔豬外周血T淋巴細(xì)胞的檢測與分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29（8）：1253-1260.

[9] 崔洋，劉軍，吳憶，等.約氏瘧原蟲感染小鼠的巨噬細(xì)胞表面吞噬相關(guān)分子的研究[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報，2007，14（2）：71-75.

[10] 周永華，胡玉紅，顧向明，等.弓形蟲感染對大鼠腦組織神經(jīng)絲mRNA表達(dá)和細(xì)胞免疫水平的影響[J].中國地方病學(xué)雜志，2009，28（6）：601-603.

[11] 徐鵬，楊桂連，劉孝剛，等.仔豬人工感染豬囊尾蚴后外周血中淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)變化研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，29（4）：440-442.

[12] 榮俊，趙阿勇.四種市售雞飼料中銅、鋅、鉻含量的測定與分析[J].中國家禽，1998（10）：5-6.

[13] 崔恒敏，徐之勇，彭西，等.高銅對雛雞淋巴細(xì)胞凋亡的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007，38（6）：601-607.

[14] 龔濤，陳濤，柏才敏，等.高氟對雛雞肝細(xì)胞周期和凋亡影響的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40（11）：1675-1680.

[15] 陳濤，龔濤，柏才敏，等.高氟對雛雞法氏囊形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期和凋亡影響的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40（8）：1235-1243.

[16] 崔偉，彭西，趙麗，等.高銅對雛鴨腎臟細(xì)胞周期和凋亡影響的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（7）：980-984.

[17] 彭西.日糧硒對雛雞免疫功能影響的機(jī)理研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[18] 賈久滿，張文秋，劉剛，等.低微量元素日糧對蛋雞生產(chǎn)性能的影響[J].飼料研究，2012（4）：54-55.

[19] 屈雪琪，趙建增，梁智選，等.流式細(xì)胞術(shù)檢測不同試驗(yàn)條件對豬T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（4）：101-104.

[20] 劉新星，霍轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，云慧，等.流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌快速檢測中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報，2014，41（1）：161-168.

[21] 王維維，袁向亮，費(fèi)奇力，等.流式細(xì)胞術(shù)快速測定紅細(xì)胞滲透脆性的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，31（10）：911-916.

[22] 陳軍浩.流式細(xì)胞術(shù)在臨床及科研中的應(yīng)用[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2012，30（10）：861-864.

[23] 李素芝.流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2015，28（6）：732-734.

[24] 李靖，李成斌，頓文濤，等.流式細(xì)胞術(shù)（FCM）在生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008（6）：107-111.

[25] 韓鴻鵬，宋純鵬.流式細(xì)胞術(shù)在植物生物學(xué)研究中應(yīng)用進(jìn)展[J].北方園藝，2015（15）：178-181.