張玉婷，文美瓊

(楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000)

多糖類化合物是一類重要的廣泛存在于自然界的有機(jī)化合物，是目前備受關(guān)注的產(chǎn)物之一。植物多糖具有廣泛的藥理作用，參與機(jī)體各種生理代謝，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制腫瘤、抗衰老、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化等多種生物活性[1―2]。

野壩子(Elsholtziarugulosa)是一種非常常見(jiàn)的植物，還是一種藥食同源的植物，來(lái)源非常廣泛。野壩子是漢藥名，它有許多種叫法，如：野壩蒿、野拔子、野蘇草、野香蘇、小鐵蘇、夸巴脂、草拔子、掃把茶、草芝麻蒿、皺葉香薷等等。野壩子始載于《中國(guó)彝藥學(xué)》，在《全國(guó)中藥匯編》中記載了它的藥效[3]。其味辛、性涼，具疏風(fēng)解表，利濕、消食化積等功效。用于治療四季感冒、咽喉炎、消化不良、腹?jié)M脹痛、泄瀉、急性腸炎、潰爛瘡瘍、中耳炎等[4]。

迄今為止，有不少學(xué)者對(duì)野壩子進(jìn)行了許多研究，如：野壩子微量元素分析[4]、紅外光譜分析[5]、化學(xué)成分分析[6]，總黃酮的提取及對(duì)活性氧自由基的清除作用[3]等，但對(duì)其中的多糖含量的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)野壩子中多糖的含量進(jìn)行測(cè)定，旨在為它的綜合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

樣品野壩子于2014年12月采自云南楚雄西山。

1.1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(南京春秋生物工程有限公司)，活性炭、石油醚、無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸、鋁粉、碳酸氫鈉、丙酮等均為分析純，水為楚雄師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.1.3 儀器

SHZ-A(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵(河南省豫華儀器有限公司)；Alpha-1502型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司)； HH-2型恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；80-2離心機(jī)、202-2型干燥箱(中華人民共和國(guó)上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 原料處理

將野壩子地上部分自然晾干， 60℃烘干，將其用粉碎機(jī)粉碎，樣品密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 多糖的測(cè)定[7―10]

2.2.1 多糖的提取與精制

準(zhǔn)確稱取野壩子地上部分樣品粗粉5.0000g，用濾紙包好。先加入石油醚80mL，水浴回流1h，樣品再用80mL80%乙醇水浴回流1h，在室溫條件下?lián)]干乙醇；將揮干乙醇的樣品回流提取三次(1h、1h、0.5h)，每次加入超純水80mL。用抽濾機(jī)趁熱抽濾，將三次濾液合并，用活性炭脫色大約半小時(shí)，又抽濾，將濾液水浴濃縮至40mL，流水冷卻，然后定容到50mL容量瓶中制得提取液；用吸量管精確吸取1mL提取液放于離心試管中，然后加入7mL無(wú)水乙醇，攪拌，離心(4000r/m， 10min)，棄去上層清液，用熱水溶解沉淀，定容至10mL，制得樣品液。

精密稱取鐵皮石斛樣品粗粉3.0000g，按“多糖的提取”方法進(jìn)行提取，濾液濃縮至80mL，加入無(wú)水乙醇至溶液含醇80%，靜置過(guò)夜。過(guò)濾，用無(wú)水乙醇、丙酮依次洗滌沉淀，制得多糖精制品，60℃烘干1h后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 提取液中多糖的定性檢驗(yàn)

吸取1mL提取液置于試管中，先加入幾滴5%的苯酚溶液，搖勻后加入幾滴濃硫酸，再搖勻，結(jié)果溶液出現(xiàn)棕色環(huán)，說(shuō)明野壩子的提取液中含有多糖。

2.2.3 苯酚、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取苯酚100g， 鋁粉0.10g和碳酸氫鈉0.05g，混勻后常壓蒸餾，用溫度計(jì)測(cè)量溫度，收集182℃的餾分。稱取餾分5g，然后加入100mL超純水混勻后，將其轉(zhuǎn)移到棕色試劑瓶中，制得5%的苯酚溶液。

精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g，溶解并定容于100mL容量瓶中。用吸量管精密吸取10mL溶液置于100mL容量瓶中定容并搖勻，即得濃度為100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

測(cè)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液最大吸收波峰分別在490nm和485nm處，故確定試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)為490nm。

2.2.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL分別置于8支比色管中，分別向這八支比色管中加入超純水至2.00mL，按照上面“測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”進(jìn)行顯色，以試劑空白為參比，在490nm處測(cè)定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

求得葡萄糖含量c (μg/mL)與吸光度A間的回歸方程為：A = 0.0125c + 0.0023 ，R2= 0.9992，表明葡萄糖濃度在0―35μg/mL范圍內(nèi)與吸光度A呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品液各0.40mL，加超純水至2.00mL，按照上面“測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”來(lái)進(jìn)行顯色，分別測(cè)定0min、5min、10min，直至60min的吸光度。

結(jié)果表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品液顯色后在60min內(nèi)其吸光度值變化不大，具有一定的穩(wěn)定性。葡萄糖顯色溶液在20―35min的時(shí)間內(nèi)其吸光度值不變，樣品顯色液在15―40min的時(shí)間內(nèi)其吸光度值不變，因此選擇在顯色26min后來(lái)測(cè)定溶液的吸光度。

1)當(dāng)NH(q)>Q*時(shí)，收益表達(dá)式為(36)，對(duì)公式(36)分別求q，α，β三者的一、二階導(dǎo)數(shù)，求解最優(yōu)的訂貨量以及彈性系數(shù).

2.2.7 測(cè)定換算因數(shù)

精確稱取烘干后的多糖精制品0.0106g、0.0105g、0.0104g三份，分別定容到50mL容量瓶中制得溶液。分別用2mL吸量管分別精取多糖溶液1.7mL，加超純水至2mL，按照上面“測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”處的做法來(lái)進(jìn)行顯色，重復(fù)做三次取平均值。

換算因數(shù)計(jì)算公式如下：

F = M/(C·D)

M為多糖質(zhì)量；

C為多糖液中的葡萄糖濃度；

D為多糖的稀釋倍數(shù)。

根據(jù)以上計(jì)算公式，計(jì)算結(jié)果換算因數(shù)F為5.46。

2.2.8 多糖含量的測(cè)定(重復(fù)性試驗(yàn))

分別用1mL吸量管精確吸取樣品液0.50mL置于比色管中，加超純水至2.00mL，按照上面“測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”的做法來(lái)進(jìn)行顯色，測(cè)定其吸光度，每個(gè)樣品液平行顯色三次取平均值。計(jì)算樣品中多糖的含量。

M多糖= F × M葡萄糖

表1 多糖含量

計(jì)算結(jié)果為野壩子多糖含量為7.96%，RSD為0.24%，說(shuō)明重復(fù)性較好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

用吸量管精確吸取樣品液0.50mL置于比色管中，加超純水至2.00mL，按照上面“測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”的做法來(lái)進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，平行測(cè)定5次。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，計(jì)算RSD為0.26%，表明精密度好。

2.3.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)[11]

精確稱取野壩子地上部分粗粉三份，質(zhì)量分別為5.0005g，5.0004g，5.0009g，分別向其中加入一定質(zhì)量的多糖精制品，用濾紙包好，如“多糖的提取”操作，制得3份待測(cè)液。分別向三份待測(cè)液中吸取一定體積的溶液，按照上面“測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”的做法來(lái)進(jìn)行顯色，測(cè)定其吸光度，每份待測(cè)液平行顯色三次，取其吸光度平均值計(jì)算。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3表明，樣品回收率在90.02%到94.51%之間，表明準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)回流提取法來(lái)提取野壩子中的多糖，利用苯酚-濃硫酸顯色法，根據(jù)吸光度與葡萄糖濃度成線性關(guān)系成正比，以此來(lái)測(cè)定其含量。結(jié)果測(cè)得野壩子中的多糖含量為7.96%，試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性好( RSD=0.24%，n=8)，精密度高(RSD=0.26%，n=5)，準(zhǔn)確度也較高(樣品回收率在90.02%到94.51%之間，RSD=1.43%，n=3)。

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