劉環(huán)宇 郭志東

(廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東 中山 528458)

目前農(nóng)藥殘留的檢測已由單一農(nóng)藥品種檢測發(fā)展為多農(nóng)藥殘留組分同時檢測，而色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在這方面的應(yīng)用最多[1～4]。采用超臨界流體萃取(SFE)、柱前衍生GC-MS測定果蔬中2,4-D等四種農(nóng)藥，前處理過程無需凈化，經(jīng)2,2,2-三氯乙醇或溴甲基五氟苯衍生化后直接進行分析，與傳統(tǒng)的溶劑提取相比更加經(jīng)濟、快速，且回收率、檢測限和重現(xiàn)性都符合殘留檢測的要求。采用液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-離子阱-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析了柑橘中抑霉唑等六種農(nóng)藥，樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，在單級、串聯(lián)和三級質(zhì)譜模式下的最低檢出限為0.000 5～0.3 mg/kg，回收率72～94%，RSD<19%。雖然三級質(zhì)譜的靈敏度低于單級和串聯(lián)質(zhì)譜，但選擇性較好[5～8]。吳鳳琪[9]、王靜靜[10]等分別建立了水果中八種外源性調(diào)節(jié)劑(乙烯利、丁酰肼、抑芽丹、赤霉素、玉米素、氯吡脲、矮壯素、β-萘乙酸)的SPE-LC-MS/MS技術(shù)和果蔬中六種植物生長抑制劑(氯化膽堿、矮壯素、縮節(jié)胺、嘧啶醇、多效唑、烯效唑)的SPE-HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)。

色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以簡化前處理程序、縮短檢測時間、減少誤判、提高準(zhǔn)確度，是國際公認具有法律效力的標(biāo)準(zhǔn)方法。常用的色譜法依靠保留時間定性，假陽性和假陰性是不可避免的，為了提高檢測結(jié)果的可靠性，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(特別是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù))的推廣是必然的。

1 儀器與設(shè)備

1.1 儀器

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；氮吹儀；固相萃取儀；TG-SMS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)

1.2 試劑

酸性橙II標(biāo)準(zhǔn)品；酸性金黃標(biāo)準(zhǔn)品；堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)品；提取溶液：乙腈；洗脫溶液：甲醇-50mmol/L乙酸銨。乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；乙酸乙酯(色譜純)；正己烷(色譜純)；三氟化硼乙醚溶液(分析純)；甲酸(分析純)；鹽酸(分析純)；氯化鈉(分析純)；無水硫酸鈉(分析純)；QuECHERS試劑盒(300 mg/管)；MCS固相萃取柱(500mg/6mL)；2,4-D-乙酯標(biāo)準(zhǔn)品；2,4-D-丁酯標(biāo)準(zhǔn)品；4-氯苯氧乙酸(CPA)標(biāo)準(zhǔn)品；2,4-二氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品；β-萘乙酸標(biāo)準(zhǔn)品；吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品；吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)品；多效唑標(biāo)準(zhǔn)品；激動素標(biāo)準(zhǔn)品；6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑配制

1.0 g/L植物生長調(diào)節(jié)劑(十種)混合貯備液：分別稱取0.025 g上述植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別溶解并定容至25mL，并在4 ℃保存。5.0 mg/L植物生長調(diào)節(jié)劑混合應(yīng)用液：各吸取1.0 g/L植物生長調(diào)節(jié)劑貯備液0.5 mL，用甲醇定容至100 mL，并在4 ℃保存。5%氨化甲醇：取5 mL氨水，用甲醇定容到100 mL，并且現(xiàn)配現(xiàn)用。20%乙酸乙酯-正己烷混合液：吸取2 mL乙酸乙酯和8 mL正己烷混合而成。10%三氟化硼甲醇衍生溶液：吸取1 mL三氟化硼乙醚溶液和9 mL甲醇混合而成，并且現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品的提取及分級凈化

1.4.1生長調(diào)節(jié)劑提取

稱取搗碎的豆芽試樣10.000 g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，40 μL甲酸，漩渦混合均勻大約1 min，超聲提取約30 min，轉(zhuǎn)速8 000 r/min狀態(tài)下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一支50 mL離心管中，加入3.0 g NaCl，漩渦混合均勻；8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，然后吸出乙腈層，用無水Na2SO4脫水后收集至圓底燒瓶內(nèi)，然后用50 ℃水浴真空濃縮至干，最后在圓底燒瓶內(nèi)加入2 mL甲醇進行超聲溶解。

1.4.2生長調(diào)節(jié)劑凈化

取上述甲醇樣液1 mL，加到QuECHERS試劑管中，混合均勻，靜止5 min混合均勻，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min，取上清液進行GC/MS分析測定2,4-D-乙酯和2,4-D-丁酯。另取甲醇樣液1 mL，加入9 mL 40 mmol/L HCl，超聲混合均勻，轉(zhuǎn)移至離心管后在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，上清液等待凈化。然后先用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL 40 mmol/L HCl溶液來活化MCS柱，活化結(jié)束后把上清液轉(zhuǎn)移到MCS柱內(nèi)，待樣液過柱后，用5 mL水淋洗除雜，真空抽干柱內(nèi)液體后加入5 mL甲醇洗脫，收集于10 mL具塞試管內(nèi)，得組分Ⅰ；用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集于10 mL具塞試管內(nèi)，得組分Ⅱ，洗脫液分別于50 ℃下用氮氣吹干。組分Ⅱ用0.5 mL甲醇溶解后進行GC/MS分析，測定多效唑、激動素、6-BA。

1.5 衍生化

組分Ⅰ加入1 mL 10%三氟化硼甲醇衍生溶液，渦旋混合均勻，70 ℃加熱衍生30 min，取出冷卻后再加入1.0 mL 20%乙酸乙酯/正己烷混合液和2 mL純水，渦旋混合均勻，4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，吸出上層有機相，轉(zhuǎn)移至進樣瓶中進行GC/MS分析。分別吸取5.0 mg/L植物生長調(diào)節(jié)劑混合應(yīng)用液0.05，0.10，0.20，0.40和1.00 mL，以甲醇定容至1.0 mL，與樣品一起進行衍生測定。

1.6 色譜和質(zhì)譜條件

TG-SMS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：260 ℃；柱溫：初溫80 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至300 ℃，300 ℃后保留2 min；載氣：氦氣，純度≥99 %，流速1 mL/min；進樣量：1 μL；電離方式：EI源，70eV；離子源溫度：230 ℃；進樣方式：不分流進樣；監(jiān)測方式：掃描范圍m/z:35～450。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長調(diào)節(jié)劑提取

豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑多殘留測定提取溶劑主要有甲醇、乙腈，考慮乙腈提取可與目前國家標(biāo)準(zhǔn)方法提取溶劑相一致，優(yōu)先選擇乙腈作為提取溶劑。研究中的五種植物生長調(diào)節(jié)劑含羧基，為了提高提取率，在乙腈中適當(dāng)添加甲酸可以明顯改善植物生長調(diào)節(jié)劑的提取效率。實驗表明，不加甲酸，十種植物生長調(diào)節(jié)劑平均回收率為64.6～92.3%(n=3)，添加甲酸的乙腈可以增加帶羧基植物生長調(diào)節(jié)劑的提取率，十種植物生長調(diào)節(jié)劑回收率在83.2～94.2%之間(n=3)滿足豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑提取要求。

2.2 樣品分級凈化

十種植物生長調(diào)節(jié)劑按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)式，在酸性條件下可以分成兩類，一類中性，如2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯、CPA、β-萘乙酸、2,4-D、吲哚乙酸、吲哚丁酸；另一類堿性帶正離子，如多效唑、激動素、6-BA。中性化合物中2,4-D-乙酯，2,4-D-丁酯，可以直接用GC/MS測定。CPA，β-萘乙酸、2,4-D、吲哚乙酸和吲哚丁酸五種植物生長調(diào)節(jié)劑需要衍生后測定。采用三氟化硼甲醇甲酯化衍生，改善了峰形、提高了檢測靈敏度；堿性化合物多效唑、激動素、6-BA可以直接進行GC/MS分析。

2.2.1QuECHERS凈化

QuEChERS技術(shù)具有試劑用量少、快速等優(yōu)點，克服了凝膠色譜和固相萃取試劑用量大的缺點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物樣品中農(nóng)藥殘留的測定。豆芽中干擾物質(zhì)主要有色素、脂肪及脂肪酸、嘌呤等，選擇含C18、石墨化碳黑和PSA填料的試劑盒，可以除去豆芽提取物中色素、脂肪酸等，2,4-D-乙酯，2,4-D-丁酯不被填料吸附，豆芽加標(biāo)測定圖譜(見圖1)。

2.2.2固相萃取分級凈化

牟艷利等[11]采用MAX混合型陰離子固相萃取柱結(jié)合LC/MS凈化測定瓜果中7種酸性植物生長調(diào)節(jié)劑。由于多種植物生長調(diào)節(jié)劑測定難在同一氣相色譜條件下完成測定，先將不同性質(zhì)的植物生長調(diào)節(jié)劑分離后分別測定。通過豆芽加標(biāo)回收實驗，比較了MCX，PCX，SLW，MCS等混合型陽離子固相萃取柱對上述八種植物生長調(diào)節(jié)劑分級凈化效果。實驗結(jié)果表明，MCX，PCX，SLW對吲哚乙酸、吲哚丁酸回收率較差；而MCS柱對八種植物生長調(diào)節(jié)劑回收率均在80%以上，且除雜效果較好。用甲醇從MCS柱洗脫獲得組分Ⅰ，組分Ⅰ中有CPA，β-萘乙酸、2,4-D-吲哚乙酸、吲哚丁酸等含羧基的五種植物生長調(diào)節(jié)劑，甲酯化后進行GC/MS分析，樣品加標(biāo)總離子流圖(見圖2)；5%氨化甲醇從MCS柱洗脫組分Ⅱ，組分Ⅱ含多效唑、激動素、6-BA這三種植物生長調(diào)節(jié)劑，這三種組分可以直接進行GC/MS分析，樣品加標(biāo)總離子流圖(見圖3)。

圖1 豆芽加標(biāo)2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯測定總離子流Fig 1 Total ion chromatogram of bean sproutspiking 2,4-D-ethyl ester and 2,4-D-butyl ester

圖2 組分Ⅰ甲酯化后測定總離子流圖Fig 2 Total ion chromatogram of compositionⅠafter methyl esterification

圖3 組分Ⅱ測定總離子流圖Fig 3 Total ion chromatogram of compositionⅡ

由圖2和圖3可知，通過MCS柱對豆芽中八種植物生長調(diào)節(jié)劑進行分級凈化，采用甲醇和5%氨化甲醇分別洗脫不同的植物生長調(diào)節(jié)劑，分別進行GC/MS分析，就可有效除去干擾物質(zhì)，使得實驗材料純度比較高，可以滿足實驗要求。

2.3 氣相色譜質(zhì)譜條件

目前，植物生長調(diào)節(jié)劑的多組分測定大多數(shù)采用LC/MS/MS法，雖然其定性準(zhǔn)確、靈敏度高，適用極性高的物質(zhì)測定，但定量分析的基質(zhì)效應(yīng)十分明顯，同樣需要對樣品進行合理的凈化，如進行QuECHERS凈化、固相萃取凈化，另一方面，LC/MS/MS法儀器成本高，方法推廣性差。GC/MS對極性較高的物質(zhì)需要進行衍生化等措施來改善化合物的性質(zhì)，儀器相對便宜且較為普及，采用GC/MS來評價豆芽中十種植物生長調(diào)節(jié)劑分級凈化效果。在當(dāng)前色譜條件下，采用TG-SMS柱，豆芽中十種植物生長調(diào)節(jié)劑均能較好分離，各化合物GC/MS分析條件(見表1)。十種植物生長調(diào)節(jié)劑在0.025～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)線性較好，相關(guān)系數(shù)約為0.995～0.999最低檢測濃度為0.02～0.05 mg/L。

表1 十種植物生長調(diào)節(jié)劑的保留時間與監(jiān)測離子Table 1 Monitoring ions,rententiontimes for ten plant growth regulators

表2 方法加標(biāo)回收率、檢出限、定量限和精密度Table 2 Recoveries,determination limits,quantification limits and precisions of method

2.4 方法精密度、檢出限及樣品測定

根據(jù)本實驗所建立的方法，在豆芽中進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果(見表2)。由表2可知，十種植物生長調(diào)節(jié)劑在豆芽中添加0.01～0.10 mg/kg，平均回收率為70.5～93.2%，RSD為5.2～12.3%，本方法對十種植物生長調(diào)節(jié)劑的定量限為0.010～0.025 mg/kg，根據(jù)3倍信噪比計算，檢出限為0.003～0.008 mg/kg。

3 結(jié) 論

建立了分級凈化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法測定植物中2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯、CPA、β-萘乙酸、2,4-D、吲哚乙酸、吲哚丁酸、多效唑、激動素、6-BA這十種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的分析檢驗方法。結(jié)果表明，本方法完全可以用于豆芽中十種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的檢測，在豆芽中添加0.01～0.10 mg/kg十種植物生長調(diào)節(jié)劑平均回收率范圍為70.5～93.2%，RSD為5.2～12.3%，本方法對十種植物生長調(diào)節(jié)劑的定量限(S/N,10)為0.0100～0.025 mg/kg，檢出限(S/N,3)為0.003～0.008 mg/kg。此凈化體系具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，結(jié)合GC/MS可以滿足豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑多殘留的檢測要求。

[1] 《食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量》編委會. 食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量(藥品卷)[M]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB2763-2005 食品中農(nóng)藥最大殘留限量[M]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2005.

[3] 劉環(huán)宇，楊劍峰，呂君亮，王春麗. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食品中非法添加的三種偶氮類工業(yè)染料[J]. 化工時刊, 2014, 28(12): 15～17,58.

[4] 周艷明，忻雪. 高效液相色譜法測定果蔬中7種植物激素的殘留量[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(18): 301～304.

[5] 儲曉剛，雍煒，蔡慧霞 等. 頂空氣相色譜法快速測定濃縮菠蘿汁中乙烯利的殘留量[J]. 色譜, 2001, 19(3): 286～288.

[6] 李麗華, 鄭玲. 固相微萃取-氣相色譜聯(lián)用技術(shù)測定芒果原漿中乙烯利的殘留量[J]. 分析試驗室, 2007(增刊1): 287～289.

[7] 周艷明, 韓瑜, 田宏哲 等. 高效液相色譜-質(zhì)譜法對水果中矮壯素的檢測[J]. 分析測試學(xué)報, 2009, 28(10): 1 206～1 908.

[8] 周艷明, 韓瑜, 田宏哲 等. 高效液相色譜-質(zhì)譜法測定蔬菜中矮壯素殘留[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(14): 197～200.

[9] 吳鳳琪, 靳保輝, 陳波 等. 水果中8種外源性植物生長調(diào)節(jié)劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2010, 26(15): 115～119.

[10] 王靜靜, 鹿毅, 楊濤 等. HPLC-MS/MS法同時測定果蔬中6種植物生長抑制劑殘留[J]. 分析測試學(xué)報, 2011, 30(2): 128～134.

[11] 牟艷莉, 郭德華, 丁卓平. 瓜果中常用植物生長調(diào)節(jié)劑的限量及檢測方法[J]. 農(nóng)藥, 2013, 52(6): 398～401.