宮曉平,崔璐璐,董 琨,楊桂英

(張家口市食品藥品檢驗中心,張家口 075000)

腺苷鈷胺即腺苷輔酶維生素B12,化學名為5,6-二甲基苯并咪唑基-5-脫氧腺嘌呤核苷基鈷胺,是維生素B12的活性輔酶形式之一,據(jù)相關(guān)文獻報道[1-9],腺苷鈷胺對B12缺乏引起的貧血、多發(fā)性神經(jīng)炎、三叉神經(jīng)痛、肝病、長期萎縮性胃炎和急性視神經(jīng)炎等疾病均具有較好的療效；也可與其他藥物聯(lián)合使用[10-12],治療帶狀皰疹、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病及糖尿病周圍神經(jīng)病變等疾病。腺苷鈷胺的化學性質(zhì)不穩(wěn)定,對光敏感[13-14],對酸、堿、熱[15]和氧亦不穩(wěn)定,易分解產(chǎn)生腺苷、羥鈷胺素[16-17]等雜質(zhì)。腺苷鈷胺片劑所用輔料、生產(chǎn)工藝[18-19]及其去除包衣的方法[20]等對實驗結(jié)果也會產(chǎn)生一定的影響?！吨袊幍洹?015年版二部[21]規(guī)定腺苷鈷胺的實驗條件均在避光條件下進行。本文通過在可見光區(qū)波長范圍內(nèi)選取7個波段、5個光照強度,參考相關(guān)文獻方法[22-23],確定光照射時間為40 min,通過所測含量考察對照品溶液的穩(wěn)定性[24],對腺苷鈷胺的降解率進行研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010A型高效液相色譜儀(包括二元泵、在線脫氣機、PDA二極管陣列檢測器等)，LC-30A型超高效液相色譜儀串聯(lián)8060型串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)；YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm；批號0425067794；十八烷基硅烷鍵合硅膠,YMC股份有限公司)；Shim-pack GISS C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm；批號227-30048-01；十八烷基硅烷鍵合硅膠，島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司)；CPA225D型精密電子天平(賽多利斯集團)；超純水機(Millipore公司)；DTC-15型超聲波清洗儀(鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司,40 kHz)；TES-1334A型數(shù)位式照度計(泰仕電子工業(yè)股份有限公司)；LED光燈(寧波良亮燈飾總廠,6 W,DC 5 V)；濾光片(飛宇達光電科技有限公司,8 cm×8 cm)。

1.2試藥 腺苷鈷胺對照品(批號140658-201302,質(zhì)量分數(shù)：98.3%),腺苷對照品(批號110879-200202),肌苷對照品(批號140669-201104),氰鈷胺對照品(維生素B12，批號100248-200802,質(zhì)量分數(shù)：95.7%)，均為中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；甲鈷胺對照品(批號L270P20,質(zhì)量分數(shù)：99.0%,北京百靈威科技有限公司)；羥鈷胺素乙酸鹽(批號5KBZO-BK,質(zhì)量分數(shù)：97.0%,東京化成工業(yè)株式會社)；乙腈(Fisher Scientific試劑公司,色譜純)；磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司,色譜純)；甲酸(Fisher Scientific試劑公司,液質(zhì)聯(lián)用級)；磷酸二氫鉀(天津市大茂化學試劑廠,分析純)；水由Milli-Q純化系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及溶液制備

2.1.1色譜條件 YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm；批號0425067794)。以乙腈為流動相A,以0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2)∶乙腈(90∶10)為流動相B,進行線性梯度洗脫(0～7 min,2%A→9%A；7～14 min,9%A；14～30 min,9%A→2%A)。流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：260 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2波長的選取 在400～700 nm范圍內(nèi),每隔50 nm選取1個波長,采用400±10,450±10,500±10,550±10,600±10,650±10和700±10 nm的濾光片,對可見光光波進行過濾的方式實現(xiàn)。

2.1.3光照強度的選取 選取50,100,200,300,400和500 lx的光照強度對腺苷鈷胺對照品溶液進行光照實驗,光照強度用照度計進行測定并確認。

2.1.4對照品溶液的制備 精密稱取腺苷鈷胺對照品適量,加水制成1 mL含100.030 08 μg的溶液,用0.45 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液。避光操作。

2.1.5供試品溶液的制備 取腺苷鈷胺對照品溶液,分別在所選定的波長與光照強度條件下照射40 min,用0.45 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液。

2.2測定結(jié)果 取腺苷鈷胺對照品溶液與照射后的供試品溶液,按照2.1.1項下的色譜條件進行測定,記錄峰面積。在400 nm的波長處、200 lx的光照強度下照射40 min,色譜圖見圖1。

圖1樣品在400nm波長處、200lx下照射40min的色譜圖

1.雜質(zhì)峰1；2.腺苷；3.腺苷；4.羥鈷胺素；5.腺苷鈷胺。

Fig.1 Chromatograms of the sample radiated for 40 min under the wavelength of 400 nm and the illumination intensity of 200 lx

1.impurity peak 1；2.adenosine；3.adenosine；4.hydroxocobalamin；5.cobamamide.

由圖1可知,腺苷鈷胺光降解后出現(xiàn)4個雜質(zhì)峰,據(jù)文獻報道,雜質(zhì)峰1可能為腺苷分子中核糖結(jié)合了一個氧原子[16]。經(jīng)對照品定位及二極管陣列檢測器確認,雜質(zhì)峰2和3與腺苷對照品的保留時間及其紫外光譜圖一致,雜質(zhì)峰4與羥鈷胺素對照品的保留時間及其紫外光譜圖一致,初步推斷腺苷鈷胺的主要光降解產(chǎn)物雜質(zhì)Ⅱ(雜質(zhì)峰2和3)為腺苷、雜質(zhì)Ⅲ(雜質(zhì)峰4)為羥鈷胺素,并采用質(zhì)譜作進一步確認。

根據(jù)腺苷鈷胺光降解后的峰面積確定腺苷鈷胺標準曲線質(zhì)量濃度范圍。精密量取2.1.4項下的腺苷鈷胺對照品溶液1.5,5,5,7.5,12.5和20 mL,分別置于100,100,50,25,25和25 mL量瓶中,加水定容,搖勻,用0.45 μm的微孔濾膜濾過,即得腺苷鈷胺對照品系列標準溶液。取系列標準溶液各20 μL,按照2.1.1項下的色譜條件進行分析,以對照品溶液的質(zhì)量濃度 (μg·mL-1)為橫坐標x、色譜峰的峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線,得回歸方程y=26 631x-4 941.4,相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

由回歸方程計算出照射后的各供試品溶液中腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度值(μg·mL-1),以光照強度為橫坐標x、供試品溶液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為縱坐標y繪制不同波長下腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度趨勢圖,見圖2。

由圖2可知,腺苷鈷胺在600 nm的波長處降解率最低，在50 lx的光照強度下降解最少,100 lx的光照強度下降解后的百分含量為96.52%,200 lx的光照強度下降解后的百分含量為93.16%。即在波長600 nm、光照強度50～100 lx的條件下腺苷鈷胺降解率最低。

圖2不同波長下腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度趨勢圖

Fig.2 Mass concentration trend chart after cobamamide degradation at the different wavelengthes

以本文選取的光照條件(600 nm的波長,50 lx的光照強度)與用傳統(tǒng)避光燈在50 lx的光照強度下的避光效果進行比較。選取10,15,20,30和40 min的光照時間,按照2.1.1項下的色譜條件進樣分析,由回歸方程計算出照射后的各供試品溶液中腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度值(μg·mL-1),以照射時間為橫坐標x、光照后的供試品溶液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為縱坐標y,繪制腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度趨勢圖,見圖3。

由圖3可知,用避光燈在50 lx下操作,腺苷鈷胺降解率均高于在600 nm波長處50 lx光照的降解率。由此可見,以本文選定的實驗條件進行避光的效果比用傳統(tǒng)避光燈的避光效果更優(yōu)。

圖3選定條件與避光燈條件下腺苷鈷胺降解后質(zhì)量濃度趨勢圖

Fig.3 Concentration trend chart after cobamamide degradation under the selected condition and avoiding light condition

3 質(zhì)譜確認

3.1色譜條件 Shim-pack GISS C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm；批號227-30048-01)。以0.2 mL·L-1的甲酸水溶液為流動相A,以0.2 mL·L-1的甲酸乙腈溶液為流動相B,進行線性梯度洗脫(0～0.5 min,95% A；0.5～3 min,95% A→5% A；3～4 min,5% A；4～4.1 min,5% A→95% A；4.1～6 min,95% A)。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

3.2質(zhì)譜條件 正離子檢測模式；離子源：ESI源；離子源溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：200 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；霧化氣流量：3 L·min-1；加熱氣流量：15 L·min-1；干燥氣流量：5 L·min-1。

3.3對照品溶液的制備 精密稱取腺苷鈷胺對照品、腺苷對照品和羥鈷胺素乙酸鹽適量,分別加水制成1 mL含腺苷鈷胺10 ng、腺苷10 ng和羥鈷胺素1 ng的溶液。避光操作。

3.4供試品溶液的制備 取腺苷鈷胺對照品溶液在400 nm波長處,以200 lx的光照強度照射40 min,用0.45 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液。

經(jīng)質(zhì)譜確認,雜質(zhì)Ⅱ為腺苷,雜質(zhì)Ⅲ為羥鈷胺素。腺苷鈷胺、腺苷和羥鈷胺素的LC-MS/MS測定圖見圖4。

圖4腺苷鈷胺、腺苷和羥鈷胺素的LC-MS/MS色譜圖

1.混合對照色譜圖；B.樣品色譜圖；1.腺苷；2.羥鈷胺素；3.腺苷鈷胺。

Fig.4 LC-MS/MS chromatogram of cobamamide,adenosine and hydroxocobalamin

1.mixed chromatogram；B.sample chromatogram；1.adenosine；2.hydroxocobalamin；3.cobamamide.

4 討論

4.1腺苷鈷胺的光降解產(chǎn)物確認 腺苷鈷胺、氰鈷氨、甲鈷胺及羥鈷胺均為維生素B12類物質(zhì)。經(jīng)本文驗證,腺苷鈷胺光降解產(chǎn)物并無氰鈷胺及甲鈷胺。經(jīng)質(zhì)譜確認后,腺苷鈷胺的主要光降解產(chǎn)物為腺苷及羥鈷胺。

4.2腺苷鈷胺避光操作的必要性 腺苷鈷胺水溶液對光極為敏感,在日光下(光照強度為1 000 lx)照射10 min,含量剩余20.23%,照射20 min含量剩余4.08%,照射30 min含量僅剩0.73%。因此,腺苷鈷胺的相關(guān)實驗必須嚴格執(zhí)行避光操作。

4.3照射時間的選取 《中國藥典》2015年版二部中腺苷鈷胺片含量測定項下[21]規(guī)定：超聲20 min,離心15 min；文獻[22]中腺苷鈷胺片溶出度測定時間為30 min。綜上所述,本文選取40 min為光照時間,可有效滿足制劑分析的前處理要求。

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