肖會敏,雷美娜,何 悅,劉 洋,王四旺

(空軍軍醫(yī)大學藥學院藥物研究所,西安 710032)

清心安神桂仁茶是由酸棗仁、茯苓、蓮子、龍眼肉和百合等藥食同源中藥組成的以清心安神為主要功效的袋泡茶劑。方中酸棗仁含有酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和黃酮類斯皮諾素等成分,其中黃酮類對中樞有抑制作用[1-3]；茯苓具有免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗氧化等作用[4-7]；蓮子具有免疫興奮、抗氧化等功效[8-10]；龍眼具有抗氧化等功效[11-13]；百合對腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂狀態(tài)有很好的改善作用[14-16]。本茶劑主要通過粉碎、混勻等工藝制成袋泡茶,為了控制茶劑質(zhì)量,本研究通過TLC法與HPLC法對清心安神桂仁茶中的有效成分進行定量與定性研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Prominence UFLC型高效液相色譜儀,配LC-20AD雙泵,SPD-M20A二極管陣列檢測器(日本島津公司)；KQ5200DE數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司)；BSA124S電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

1.2試藥 酸棗仁、茯苓和龍眼肉對照藥材以及斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B對照品,均購自中國食品藥品檢定研究院；清心安神桂仁茶(批號：20161208,20161209,20161210),由陜西含光生物科技有限公司研制并提供；甲醇、乙腈均為色譜純,美國Fisher公司；超純水,自制；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1斯皮諾素的TLC鑒別 取5袋本品,研細混勻,稱取粉末9 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL,加熱回流2次,每次2 h,濾過,棄濾液,揮干藥渣,加甲醇100 mL加熱回流1 h,濾過,蒸干濾液,殘渣加2 mL甲醇使溶解,作為供試品溶液；依照處方比例制成缺酸棗仁的茶劑,同法制成酸棗仁陰性對照溶液；取1 g酸棗仁對照藥材,同法制成酸棗仁對照藥材溶液；另取斯皮諾素對照品,加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的斯皮諾素溶液,作為對照品溶液。依據(jù)文獻方法[17]進行實驗,分別吸取上述不同的4種溶液各5 μL,點于同一硅膠G板上,展開劑為水飽和的正丁醇,展開,取出,晾干,噴質(zhì)量濃度為10 g·L-1的香草醛硫酸溶液作為顯色劑,于紫外光燈365 nm下檢視。結(jié)果顯示,供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,出現(xiàn)特征斑點,陰性對照無干擾,見圖1A。

2.2酸棗仁皂苷A與酸棗仁皂苷B的TLC鑒別 取5袋本品,研細混勻,稱取粉末9 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL加熱回流2 h,2次,濾過,棄去石油醚,藥渣揮干后加水200 mL,加熱回流30 min,濾過,棄濾液,揮干藥渣,加甲醇100 mL超聲(250 W,100 kHz)1 h,濾過,蒸干濾液,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為供試品溶液；依照處方比例制成缺酸棗仁的茶劑,同法制成酸棗仁陰性對照溶液；取1 g酸棗仁對照藥材,同法制成酸棗仁對照藥材溶液；再取酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B加甲醇制成質(zhì)量濃度均為1 mg·mL-1的混合對照品溶液。依據(jù)文獻方法[17]實驗,分別吸取上述不同的4種溶液各5 μL,點于同一硅膠G板上,展開劑為水飽和的正丁醇,展開,取出,晾干,噴質(zhì)量濃度為10 g·L-1的香草醛硫酸溶液作為顯色劑,加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果顯示,供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,出現(xiàn)特征斑點,陰性對照無干擾,見圖1B。

2.3茯苓的TLC鑒別 取5袋本品,研細混勻,稱取粉末7 g,加100 mL體積分數(shù)為80%的乙醇加熱回流4 h,濾過,蒸干濾液,再加2 mL甲醇使溶解,作為供試品溶液；依處方比例制成缺茯苓的茶劑,同法制成茯苓陰性對照溶液；另取茯苓對照藥材1 g,加20 mL體積分數(shù)為80%的乙醇加熱回流4 h,濾過,蒸干濾液,加2 mL甲醇制成對照藥材溶液。依據(jù)文獻方法[17]實驗,分別吸取上述3種不同的溶液各10 μL,點于同一硅膠G板上,使用展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2),展開,取出,晾干,噴以100 mL·L-1的硫酸乙醇液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果顯示,供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,出現(xiàn)特征斑點,陰性對照無干擾,見圖1C。

2.4龍眼肉的TLC鑒別 取5袋本品,研細混勻,稱取粉末7 g,加乙醇100 mL回流1 h,濾過,蒸干濾液,加水20 mL使殘渣溶解,用乙酸乙酯萃取2次,每次20 mL,合并萃取液,用20 mL水洗滌,并將乙酸乙酯層濃縮至2 mL,作為供試品溶液。依照處方比例制成缺龍眼肉的茶劑,同法制成龍眼肉陰性對照溶液；取龍眼肉對照藥材1.5 g,按照2.5.3項下方法制成對照藥材溶液。依據(jù)文獻方法[17]實驗,分別吸取上述3種不同的溶液各5 μL,點于同一硅膠G板上,使用展開劑為氯仿-甲醇-甲酸(8∶1∶0.25),展開,取出,晾干,在紫外光燈365 nm下檢視。結(jié)果顯示,供試品在與對照藥材色譜相應的位置上,出現(xiàn)特征顯斑點,陰性對照無干擾,見圖1D。

2.5斯皮諾素含量的測定

2.5.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A、水為流動相B,0～10 min,B 88%→81%；10～16 min,B 81%→80%；16～22 min,B 80%→40%；22～30 min,B 40%→0%；記錄時間：30 min。流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：335 nm；進樣量：20 μL。理論塔板數(shù)按照斯皮諾素峰計算應不低于4 000。

2.5.2對照品溶液的制備 取斯皮諾素對照品12.40 mg,置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度,搖勻,即得。

2.5.3供試品溶液的制備 取本品5袋,研細混勻,稱取粉末6 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL,置于250 mL錐形瓶中,加熱回流1 h,去除石油醚,藥渣蒸干,殘渣加60 mL甲醇,加熱回流1 h,濾過,收集并蒸干濾液,加甲醇使殘渣溶解,置于5 mL量瓶中,定容即得。

2.5.4酸棗仁陰性對照溶液的制備 按照處方比例及工藝制成缺酸棗仁的茶劑,按照2.5.3項下方法制備酸棗仁陰性對照溶液。

2.5.5標準曲線及線性范圍 精密吸取質(zhì)量濃度為1.24 mg·mL-1的斯皮諾素對照品溶液0.005,0.010,0.030,0.050,0.200和1.000 mL,分別置于2 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,依次得到質(zhì)量濃度分別為3.10,6.20,18.60,31.00,124.00和620.00 μg·mL-1的系列對照品溶液,用0.45 μm的微孔濾膜濾過,分別吸取各對照品溶液20 μL進樣,按照2.5.3項下方法測定峰面積,以峰面積積分值為縱坐標(y)、對照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(x),繪制標準曲線,得回歸方程y=429 563x-236 697,r=0.999 6。結(jié)果表明,斯皮諾素質(zhì)量濃度在3.10～620.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1TLC圖

A.斯皮諾素:1～2.清心安神桂仁茶；3～4.酸棗仁空白對照；5～6.酸棗仁對照藥材；7～8.斯皮諾素對照品。B.酸棗仁皂苷：1～2.清心安神桂仁茶；3.酸棗仁空白對照；4～5.酸棗仁對照藥材；6.酸棗仁皂苷A；7.酸棗仁皂苷B。C.茯苓：1～2.清心安神桂仁茶；3～4.茯苓空白對照；5～6.茯苓對照藥材。D.龍眼肉：1～2.清心安神桂仁茶；3～4.龍眼肉空白對照；5～6.龍眼肉對照藥材。

Fig.1 TLC chromatograms

A.spinosin:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofZizipphiSpinosaeSemen；5-6.reference crude herb ofZizipphiSpinosaeSemen；7-8.spinosin standard.B.jujuboside:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3.blank control ofZizipphiSpinosaeSemen；4-5.reference crude herb ofZizipphiSpinosaeSemen；6.jujuboside A;7.jujuboside B.C.Poriacocos:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofPoriacocos；5-6.reference crude herb ofPoriacocos.D.DriedLonganPulp:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofDriedLonganPulp；5-6.reference crude herb ofDriedLonganPulp.

2.5.6專屬性實驗 取斯皮諾素對照品溶液、供試品溶液和酸棗仁陰性對照溶液各20 μL,按照2.5.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見圖2,陰性對照無干擾。結(jié)果表明,該方法專屬性強。

圖2HPLC圖

A.斯皮諾素對照品；B.樣品；C.陰性樣品(缺酸棗仁)；1.斯皮諾素。

Fig.5 HPLC chromatograms

A.spinosin reference substance；B.sample；C.negative control (missing spina date seed)；1.spinosin.

2.5.7精密度實驗 取斯皮諾素對照品溶液(精密量取質(zhì)量濃度為1.24 mg·mL-1的線性樣品溶液0.030 mL,加甲醇定容至2 mL,即得質(zhì)量濃度為18.60 μg·mL-1的對照品溶液),連續(xù)進樣5次,測定峰面積RSD值為1.94%。結(jié)果表明,該儀器精密度良好。

2.5.8穩(wěn)定性實驗 取質(zhì)量濃度為18.60 μg·mL-1的斯皮諾素對照品溶液,在第0,1,2,4,8和12 h進樣,測定峰面積RSD值為1.97%。結(jié)果表明,12 h內(nèi)該樣品穩(wěn)定。

2.5.9重復性實驗 精密稱取樣品(批號20161208)5份,按照2.5.3項下方法制備供試品溶液,按照2.5.1項下色譜條件進樣測定,結(jié)果茶劑中斯皮諾素的含量為88.40 μg·g-1,RSD值為1.90%。

2.5.10回收率實驗 取3袋本品(批號20161208),研細混勻,稱取粉末6 g(斯皮諾素的含量為88.40 μg·g-1),加石油醚(60～90 ℃)100 mL,置于250 mL錐形瓶中,添加對照品溶液,稱取斯皮諾素10 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,按照2.5.3項下方法制備供試品溶液,按照2.5.1項下色譜條件進樣測定,結(jié)果見表1。由表1可知,平均加樣回收率為96.07%,RSD值為1.39%。結(jié)果表明,該方法加樣回收率良好。

表1斯皮諾素加樣回收率測定結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery test of spinosin

取樣量/g相當于斯皮諾素的量/mg添加斯皮諾素的量/mg測出斯皮諾素總量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%2.28910.20240.140.336896.000096.071.392.15240.19030.160.340293.68752.67480.23650.190.421897.52633.19670.28260.230.501495.13043.22600.28520.230.508797.17392.65630.23480.190.418996.8947

2.5.11樣品測定 按照2.5.3項下方法進行制備,按照2.5.1項下色譜條件進樣測定,按照外標法計算。結(jié)果顯示,3批樣品中斯皮諾素的平均含量為90.60 μg·g-1,RSD值為1.34%。結(jié)果表明,不同批次間均一性較好。

3 討論

3.1TLC鑒別 依據(jù)文獻方法[18],對茶劑中酸棗仁藥材及其中的斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和茯苓藥材進行鑒別,結(jié)果可檢出清晰的特征斑點,Rf適中,重復性較好,專屬性強,故列入質(zhì)量標準。依據(jù)文獻方法[19],對茶劑中的龍眼肉進行鑒別,可檢出特征斑點,同時具有重復性與專屬性,故列入質(zhì)量標準。依據(jù)文獻方法[7],對茶劑中百合、蓮子進行鑒別,出現(xiàn)清晰斑點,陰性對照有干擾,無專屬性,故未列入質(zhì)量標準。

3.2含量測定 依據(jù)文獻方法[18],對制樣方法進行篩選,篩選方法1：第一步,用石油醚回流4 h；第二步,①用體積分數(shù)為70%的乙醇回流2 h,或②用不同體積分數(shù)的甲醇(0,50%,70%和80%)超聲30 min或③用不同體積分數(shù)的乙醇(50%,70%和80%)超聲30 min或④乙腈超聲30 min。篩選方法2：水提醇沉法,檢測結(jié)果均不理想,后采用先用石油醚回流1 h,再用甲醇回流1 h的方法,結(jié)果顯示,目標峰分離度大于1.5,陰性對照無干擾。經(jīng)方法學考察,各項指標均符合要求。

綜上所述,把具有良好穩(wěn)定性與重復性的含量測定項及專屬性強、重復性好的TLC鑒別(即斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B成分以及茯苓、龍眼肉藥材)進行鑒別,納入質(zhì)量標準,可以很好地控制茶劑的質(zhì)量。

[1] 胡明亞.酸棗仁的藥理作用及現(xiàn)代臨床應用研究[J].中醫(yī)臨床研究,2012,19(4):20-21.

[2] 翟旭峰,肖小春,婁勇軍,等.生酸棗仁及其炮制品鎮(zhèn)靜催眠作用及對失眠大鼠腦電圖的影響[J].中藥藥理與臨床,2015,31(6):94-97.

[3] 吳玉蘭,丁安偉,包貝華.炒酸棗仁中酸棗仁皂苷的提取純化工藝研究[J].中藥材,2005,28(3)：219-223.

[4] 牛爽,郝利民,趙樹欣,等.茯苓多糖的研究進展[J].食品科學,2012,33(13):348-353.

[5] 梁學清,李丹丹,黃忠威.茯苓藥理作用研究進展[J].河南科技大學學報:醫(yī)學版,2012,30(2):154-156.

[6] 劉惠知,吳勝蓮,張德元,等.茯苓藥物成分提取分離及其藥用價值研究進展[J].中國食用菌,2015,34(6)：1-6.

[7] 徐碩,姜文清,鄺詠梅,等.茯苓的化學成分及生物活性研究進展[J].西北藥學雜志,2016,31(5):327-330.

[8] 王曉娜,王曉梅,楊素珍.蓮主要部位功能活性成分概述[J].食品研究與開發(fā),2016,37(1),216-220.

[9] 陳嬋,鄭寶東,黃艷,等.蓮子可溶性多糖提取工藝的研究[J].福建輕紡,2016,(11):91-94.

[10]何錦婷,虞舜.蓮子心的現(xiàn)代臨床應用[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2012,28(3):544-546.

[11]賈琦,李雪華.龍眼肉多糖分離及結(jié)構(gòu)研究[J].解放軍藥學學報,2009,25(1):46-48.

[12]黃建榮,李琳,李冰.龍眼肉生理功效和活性成分的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2007,28(3):221-224.

[13]郭倩倩,張曉衛(wèi),周暄宣,等.龍眼的化學成分與藥理活性研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,11(23):4552-4555.

[14]李艷,苗明三.百合的化學、藥理與臨床應用分析[J].中醫(yī)學報,2015,30(7):1021-1023.

[15]張國強,楊正平.百合多糖提取及成分分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2012,51(15):3298-3299.

[16]高淑怡,李衛(wèi)民,帥穎,等.藥用植物百合甾體皂苷研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(16):337-343.

[17]國家藥典委員會.中國藥典:2015年版:四部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015:57.

[18]國家藥典委員會.中國藥典:2015年版:一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015:132-367.

[19]孫桂梅.薄層色譜法鑒別九味健腎膠囊中的枳殼和龍眼肉[J].人參研究,2004,(4):11-12.