侯 琨, 渡邊正樹, 王大利, 韓 晶, 李永路, 霍 虹

(1. 日立儀器(大連)有限公司, 遼寧 大連 116033; 2. 株式會社日立高新技術(shù)科學(xué), 日本 茨城 3120033; 3. 大連市兒童醫(yī)院, 遼寧 大連 116012; 4. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023)

食用菌因味道鮮美、營養(yǎng)豐富、藥食同源而備受關(guān)注。食用菌的蛋白質(zhì)含量為27% ～48% ,碳水化合物約60% ,脂質(zhì)在2% ～8%之間,同時含有多種維生素和微量元素[1]。近代醫(yī)學(xué)表明,食用菌除了營養(yǎng)豐富,還有增強機體免疫力、抗腫瘤等功效[2,3]。如營養(yǎng)學(xué)家預(yù)言,食用菌已成為新的食物資源,全世界有20個品種的食用菌在進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[1]。為了提高產(chǎn)量,滿足人們對食用菌的大量需求,食用菌生產(chǎn)過程中需要添加植物生長激素[4,5]。

6- 芐基腺嘌呤(6- benzylaminopurine, 6- BA)是人工合成的細胞分裂素,正常劑量下能促進細胞的分裂和生長,具有調(diào)運氨基酸、生長素、無機鹽等多種效能,對植物的生長、發(fā)育有著促進與調(diào)節(jié)作用[6-8],但過多攝入會刺激人體皮膚黏膜,造成食道胃黏膜損傷,出現(xiàn)惡心嘔吐等現(xiàn)象,甚至致癌、致畸[9]。歐洲食品安全局(EFSA)規(guī)定[10]植物來源的食品中6- 芐基腺嘌呤最大殘留量(MRL)為0.01 mg/kg。GB 2760- 1996規(guī)定在豆芽生產(chǎn)中的最大使用量為10 mg/kg,最大殘留量為2.0 mg/kg。2015年,中國食品藥品監(jiān)督管理總局農(nóng)業(yè)部中國衛(wèi)生和計劃生育委員會第11號公告已經(jīng)禁止在豆芽生產(chǎn)中使用6- 芐基腺嘌呤[11]。法律法規(guī)多針對“毒豆芽”事件而展開,對于食用菌培育中6- BA的使用導(dǎo)致的殘留問題目前國內(nèi)尚無報道。

6- BA的測定方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[12]、氣相色譜法(GC)[13]、氣相色譜- 質(zhì)譜法(GC- MS)[14]、高效液相色譜法(HPLC)[15]和高效液相色譜- 質(zhì)譜法(HPLC- MS)[16-19]等。這些方法足以解決6- BA的分離和檢測,但樣品基質(zhì)復(fù)雜和目標(biāo)物含量低使得樣品前處理成為決定分析結(jié)果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前常用的樣品前處理方法主要有固相萃取法[20],但成本相對較高,且食用菌樣品容易堵塞固相萃取柱,應(yīng)用此法耗時耗力。因此,開發(fā)操作簡單、提取分離效率高、高通量、成本低、準(zhǔn)確性高的前處理技術(shù)用于食用菌中6- BA的測定顯得尤為重要。低溫分配固液萃取(SLE- LTP)技術(shù)能在短時間內(nèi)同時完成提取和分離,實驗步驟大大簡化,和固相萃取法相比具有簡單、經(jīng)濟的優(yōu)勢[21,22],尤其適合食用菌類復(fù)雜生物基質(zhì)中高極性雜質(zhì)的去除。經(jīng)過SLE- LTP前處理,樣品可以直接進行檢測。

本研究采用SLE- LTP技術(shù),以食用菌中的6- 芐基腺嘌呤為檢測目標(biāo),采用HPLC進行測定,并采用質(zhì)譜對結(jié)果進行進一步確認,建立了簡便、快捷、實用的測定食用菌中6- 芐基腺嘌呤的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Chromaster高效液相色譜儀(配有Chromaster 5110輸液泵、5210自動進樣器、5310柱溫箱、5410紫外檢測器)、Chromaster 5610質(zhì)譜檢測器、CF16RXⅡ型高速離心機(日本日立公司); FU- 9H型超聲波清洗儀(日本TGK公司); MDF- U338- C型醫(yī)用低溫箱(日本SANYO公司); Milli- Q超純水器(美國Millipore公司)。

6- 芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99.0% ,德國Dr. Ehrenstorfer公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國Tedia公司);乙酸(色譜純,德國CNW公司);乙酸銨(純度為95.0% ,日本W(wǎng)ako公司)。各種食用菌樣品均購自大連超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取6- 芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃冰箱中保存。準(zhǔn)確移取適量6- 芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇稀釋并配制適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

新鮮的食用菌樣品經(jīng)高速萬能粉碎機以24 000 r/min粉碎20 s。準(zhǔn)確稱取4.0 g混合均勻的樣品,置于15 mL離心管中,加入5 mL乙腈,超聲提取15 min,以12 000 r/min的速率離心10 min,取上清液,殘渣加入5 mL乙腈,重復(fù)上述超聲提取和離心操作,合并上清液,向其中加入0.5 mL超純水,混勻,于-30 ℃醫(yī)用低溫箱中保存,待低溫分層4 h后,立即取出上層澄清液,在常溫下氮吹至4 mL以下,用乙腈定容至4 mL,過0.45 μm有機濾膜,待分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Hitachi LaChrom C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:45 ℃;流動相:0.02 mol/L乙酸銨(含0.1%(v/v)冰乙酸)- 甲醇(6∶4, v/v);等度洗脫;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:267 nm。

1.4.2質(zhì)譜條件

電離方式:電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;離子源溫度:70 ℃;檢測模式:選擇離子監(jiān)測(SIM)模式;離子化電壓:2 500 V;氣體(N2)流速:0.6 L/min;錐孔電壓1:80 V;錐孔電壓2:30 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 低溫分配固液萃取條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇

低溫分配固液萃取技術(shù)是基于低溫下有機相和水相分層而引起分析物的分配。分配后食用菌樣品中的多糖類物質(zhì)及其他高極性雜質(zhì)被凍結(jié)在水相中,而目標(biāo)物溶解在有機溶劑中,進而達到凈化的目的。乙腈、甲醇、乙酸乙酯是提取6- 芐基腺嘌呤時最常用的3種溶劑,本實驗采用這3種溶劑進行提取- 低溫分配效果的考察。結(jié)果表明:在常溫、低溫(-30 ℃)及超低溫(-80 ℃)下,以甲醇作提取劑的溶液體系直至凍結(jié)也沒有獲得兩相分離,即沒有低溫分配,因此不適合作為本實驗的提取溶劑;乙酸乙酯作為提取劑時目標(biāo)物的回收率不高,在24% ～32%之間;以乙腈作提取劑的溶液體系在-30 ℃下保持12 h,通過液液分配，分析物可轉(zhuǎn)移到有機相,高極性的雜質(zhì)停留在水相,利用低溫分配后,提取的絕大部分雜質(zhì)都能被去除,目標(biāo)物的回收率為48% ～81% ,從而確定乙腈為低溫分配的提取溶劑。

2.1.2提取體積的選擇

考察了乙腈體積(6、 8、 10、 12和14 mL,分別平均分為2份,提取2次后合并提取液)對目標(biāo)物回收率的影響。從圖1可以看出,隨著乙腈體積的增加,6- 芐基腺嘌呤的回收率逐漸增大,當(dāng)乙腈體積大于10 mL時6- BA的回收率變化平緩,因此,實驗采用10 mL乙腈(分2次提取,每次提取體積為5 mL)進行提取。

圖 1 提取溶劑體積對6- 芐基腺嘌呤回收率的影響(n=6)Fig. 1 Effects of volume of extraction solvent on the recoveries of the 6- benzylaminopurine (6- BA) (n=6)

2.1.3輔助液體積的選擇

低溫分配前在溶液體系中加入輔助液(水)可以促進極性雜質(zhì)向水相移動以獲得更純凈的分析樣品。本研究考察了水的體積(0、0.5、1.0、2.0和4.0 mL)對目標(biāo)物回收率的影響。由圖2可知,水的體積和6- BA的回收率呈負相關(guān),綜合考慮回收率及去除雜質(zhì)的效果,將水的體積確定為0.5 mL。

圖 2 輔助液體積對6- 芐基腺嘌呤回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effects of volume of auxiliary solution on the recoveries of the 6- BA (n=6)

2.1.4低溫分配時間的選擇

圖 3 低溫分配時間對6- 芐基腺嘌呤回收率的影響(n=6)Fig. 3 Effects of low- temperature partition time on the recoveries of the 6- BA (n=6)

低溫分配需要一個低溫靜置的時間,為了減少靜置時間,對兩相的分離動力學(xué)進行評價。對低溫靜置時間進行考察,在0～12 h之間,6- BA的回收率均穩(wěn)定在95%左右(見圖3)。低溫時,液相開始分離,0.5～2.0 h后液相保持著穩(wěn)定的兩相分層狀態(tài);3 h后水相可見少量冰碴;4 h左右,約80%的水相被冷凍,其分層界面較3 h前更清晰;5 h后水相被全部冷凍,乙腈層開始出現(xiàn)冰碴,水相與乙腈相的分界線變模糊;6 h后水相呈白色固相,水相與乙腈分界線變更模糊。從實驗數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn),水相凍實后將阻斷水相中物質(zhì)的分配和轉(zhuǎn)移。因此,推測物質(zhì)的分配與轉(zhuǎn)移發(fā)生在水相冰凍之前。綜合考慮,選擇低溫分配的靜置時間為4 h。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

[19]的方法,比較了0.02 mol/L乙酸銨(含0.1%(v/v)冰乙酸)與甲醇在不同體積比所形成的流行相條件下對目標(biāo)化合物分離度和峰形的影響。隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加(由35%增至50% ), 6- 芐基腺嘌呤在固定相上的保留減弱,為了避免雜質(zhì)峰的干擾,選擇0.02 mol/L乙酸銨(含0.1%(v/v)冰乙酸)- 甲醇(6∶4, v/v)作流動相,6- 芐基腺嘌呤的保留時間為16.4 min。

圖 4 6- 芐基腺嘌呤的質(zhì)譜圖Fig. 4 Mass spectrum of 6- BA

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

6- 芐基腺嘌呤的結(jié)構(gòu)中含有氨基,在正離子模式下更易得到較強的準(zhǔn)分子離子信號。本實驗選擇ESI+模式,采用注射泵直接連續(xù)進樣,以2.0 μL/min的速率注入10 mg/L的6- 芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液,全掃描條件下獲得6- 芐基腺嘌呤的準(zhǔn)分子離子峰(見圖4),并對此離子(m/z226.4)進行SIM模式掃描。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

將1.2節(jié)中配制的不同質(zhì)量濃度(0.05、0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)分析3次,以目標(biāo)物峰面積(Y)對其在標(biāo)準(zhǔn)工作液中的質(zhì)量濃度(X, mg/L)進行線性回歸。以3倍和10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度為檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。6- 芐基腺嘌呤的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2),線性范圍、檢出限和定量限見表1。

表 1 6-芐基腺嘌呤的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.5 回收率和精密度

在4 g(精確到0.01 g)香菇等7種食用菌樣品中進行加標(biāo)回收試驗,每個基質(zhì)的加標(biāo)水平分別為0.1 mg/kg和0.5 mg/kg,每個水平平行測定6次,計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。7種基質(zhì)中6- 芐基腺嘌呤的平均加標(biāo)回收率為81.3% ～93.7% ,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7% ～2.4% 。

表 2 7種蘑菇樣品中6-芐基腺嘌呤的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 實際樣品分析

使用本方法對從大連市場購買的24份食用菌樣品進行測定,全部樣品中均未檢出6- 芐基腺嘌呤。用質(zhì)譜儀在SIM模式下對食用菌樣品及加標(biāo)樣品進行確認,食用菌樣品中不含有6- 芐基腺嘌呤。杏鮑菇實際樣品和定量限添加水平下的杏鮑菇實際樣品的色譜圖見圖5。

圖 5 (a)杏鮑菇實際樣品和(b)杏鮑菇加標(biāo)(0.5 mg/kg)樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of (a) a pleurotus eryngii sample and (b) a pleurotus eryngii sample spiked with 0.5 mg/kg 6- BA

3 結(jié)論

本文建立了食用菌樣品中6- 芐基腺嘌呤的檢測方法,樣品經(jīng)乙腈提取,低溫分配固液萃取,高效液相色譜- 質(zhì)譜法測定。該法前處理步驟簡單、快速,大大降低了前處理的成本。方法評價結(jié)果表明,該法準(zhǔn)確、可靠、能夠滿足國內(nèi)關(guān)于6- 芐基腺嘌呤殘留限量的要求,同時也為其他種類食品中6- 芐基腺嘌呤的檢測提供了新思路。

參考文獻:

[1] Sanchez C. Appl Microbiol Biot, 2004, 64(6): 756

[2] Greeshma P, Ravikumar K S, Neethu M N, et al. Int J Med Mushrooms, 2016, 18(3): 235

[3] Kashina S, Flores Villavicencio L L, Zaina S, et al. Int J Med Mushrooms, 2016, 18(1): 49

[4] Qiu C E, Tu J M, Wang W D, et al. Journal of Microbiology, 2001, 21(3): 63

邱昌恩, 涂俊銘, 王衛(wèi)東, 等. 微生物學(xué)雜志, 2001, 21(3): 63

[5] Wang Q, Liu M, Xu X C, et al. Journal of Hebei University (Natural Science Edition), 2012, 32(3): 286

王謙, 劉敏, 徐嘯晨, 等. 河北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2012, 32(3): 286

[6] Sun D, Zhang H J. Anal Chim Acta, 2006, 557(1/2): 64

[7] Ohashi F, Ueda S, Taguri T, et al. Appl Clay Sci, 2009, 46(3): 296

[8] Pan B Z, Xu Z F. J Plant Growth Regul, 2011, 30(2): 166

[9] United States Environmental Protection Agency (US EPA). The US EPA Pesticide Toxicity Database. (2009- 10- 19) [2016- 08- 22]. http://www3.epa.gov/pesticides/chem_search/ppls/072639- 00003- 20091019.pdf

[10] European Food Safety Authority (EFSA). EFSA J, 2010, 8(10): 1716

[11] China Food and Drug Administration. 2015 Years No. 11 Bulletin of the China Food and Drug Administration. (2015- 04- 13) [2017- 11- 24]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0050/118260.html

國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2015年第11號. (2015- 04- 13) [2017- 11- 24]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0050/118260.html

[12] Zhang W, He L S, Zhang R, et al. Food Chem, 2016, 207: 233

[13] Lee S M, Kim J Y, Lee H J, et al. J Korean Soc Appl Bi, 2014, 57(1): 83

[14] Wu P G, Tan Y, Zhang J, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(6): 866

吳平谷, 譚瑩, 張晶, 等. 分析化學(xué), 2014, 42(6): 866

[15] Ma X F, Chen G, Qin D P, et al. Agrochemicals, 2016, 55(2): 124

馬雪豐, 陳果, 秦德萍, 等. 農(nóng)藥, 2016, 55(2): 124

[16] Kim K G, Park D W, Kang G R, et al. Food Chem, 2016, 208: 239

[17] Xie H B, Zhou M Y, Zhao H F, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(5): 493

謝寒冰, 周明瑩, 趙海峰, 等. 色譜, 2014, 32(5): 493

[18] Liu H, Wu B, Yin Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(1): 22

柳菡, 吳斌, 殷耀, 等. 色譜, 2013, 31(1): 22

[19] Zhang J, Wan H H, Zhang H. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(9): 963

張婧, 萬慧慧, 張華. 色譜, 2017, 35(9): 963

[20] GB/T 23381- 2009

[21] Sousa D A, Goncalves R M, Heleno F F, et al. Microchem J, 2014, 114: 266

[22] Costa A I G, Queiroz M E L R, Neves A A, et al. Food Chem, 2015, 181: 64