穆一帆， 鐘廣炎， 高 峰*， 鐘 云， 胡敏倫， 閆化學(xué)， 姜 波， 吳 波

(1. 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣州 510640)

NPR1和Defensin雙價抗病基因過量表達(dá)載體構(gòu)建及其對沙田柚的遺傳轉(zhuǎn)化

穆一帆1， 鐘廣炎2*， 高 峰1*， 鐘 云2， 胡敏倫2， 閆化學(xué)2， 姜 波2， 吳 波2

(1. 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣州 510640)

通過PCR技術(shù)，從克里曼丁橘和荔枝品種“三月紅”葉片中克隆獲得了NPR1和Defensin基因序列. 以pBI-121作為載體骨架，構(gòu)建了NPR1和Defensin雙價抗病基因過量表達(dá)載體，命名為ND-pBI121. 通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了6株P(guān)CR檢測為陽性的雙抗沙田柚植株, 為探究NPR1和Defensin基因的過量表達(dá)對柑橘黃龍病的抗性影響提供試材.

抗病基因； 過表達(dá)載體； 柑橘黃龍?。?遺傳轉(zhuǎn)化； 沙田柚

柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是一種由革蘭氏陰性細(xì)菌引起的植物病害，病株果實常表現(xiàn)為青果，果汁味酸、淡，果實中心柱不正[1]. 此外，病株的種子質(zhì)量減輕，多敗育且萌發(fā)率降低[2]. 隨著近年來柑橘黃龍病在全球范圍內(nèi)的爆發(fā)，對該病的防治受到了廣泛的關(guān)注，但目前尚無有效的防治方法[3]. 黃龍病病原菌不能分離純化培養(yǎng)的特性對該病的研究和防治造成了嚴(yán)重的阻礙[4]，傳統(tǒng)的防治方法：培育無毒苗、鏟除病樹、防控木虱，無法從根本上解決黃龍病的爆發(fā)[5]. 因此，抗性育種材料的篩選和培育至關(guān)重要[6]，遠(yuǎn)緣植物中抗性基因的利用可望為黃龍病的防治提供一條新的途徑.

病程相關(guān)非表達(dá)子1(Nonexpressor of Pathogenesis Related Genes 1,NPR1)具有廣譜抗性，在植物系統(tǒng)獲得抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR)、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced Systemic Resistance, ISR)中起核心調(diào)控作用，是多種抗病途徑中的關(guān)鍵節(jié)點[7]. CAO等[8]發(fā)現(xiàn)，缺失NPR1基因的擬南芥突變植株對各種SAR誘導(dǎo)物不能做出應(yīng)答反應(yīng)，同時對病原微生物感染的敏感性顯著提高. 隨后在不同植物物種中克隆得到了NPR1基因及其同源基因，并且證實NPR1基因能增強(qiáng)水稻[9]和玉米[10]等作物的抗病能力.

植物防御素(Defensin)是植物體在受到病原體侵染時所產(chǎn)生的一種拮抗物質(zhì)，是一類富含半胱氨酸的小分子多肽，對細(xì)菌等微生物具有廣譜抗性[11]. 來源不同的植物防御素的抗菌作用機(jī)制與抗菌廣譜性不盡相同，其抗菌作用機(jī)制主要有2種：一種機(jī)制是與細(xì)胞膜上的脂類相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性改變的[12-13], 從而導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，原生質(zhì)體的泄露和電化學(xué)勢的失衡；一種機(jī)制是與細(xì)胞內(nèi)的復(fù)合物結(jié)合，該方式的作用機(jī)制還有待研究[14].

2015年DUTT等[15]發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入擬南芥NPR1基因的甜橙轉(zhuǎn)基因植株對黃龍病的抗性增強(qiáng). 此外，對已經(jīng)分離得到的植物防御素(Defensin)進(jìn)行分類的研究發(fā)現(xiàn)，部分Defensin能夠抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的生長[16]. 有研究[17]表明，荔枝鮮有革蘭氏陰性菌引起的病害發(fā)生，據(jù)此推測荔枝對細(xì)菌侵染性疾病具有一定的抗性. 本實驗擬采用基因工程技術(shù)構(gòu)建柑橘NPR1和荔枝Defensin雙價抗病基因過量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化柑橘柚類優(yōu)良品種“沙田柚”，為探究NPR1和Defensin基因的過量表達(dá)對柑橘黃龍病的抗性影響提供試材及技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗材料：克里曼丁橘(CitrusreticulataBlanco cv. Clementine)葉片，取自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所；荔枝(LitchichinensisSonn.)，品種“三月紅”的葉片，分別作為提取基因組DNA的材料；沙田柚(Critrusgrandis(L.) Osbeck cv. Shatianyou)果實購自廣東梅龍柚果股份有限公司，作為遺傳轉(zhuǎn)化受體.

實驗試劑：Ex Taq酶、PrimeSTARMax Premix、PCR純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker、ClonExpressII One Step Cloning Kit試劑盒、購于TaKaRa生物工程有限公司. BamH I、Sac I限制性內(nèi)切酶購自NEB公司. 植物DNA提取試劑盒購自東盛生物技術(shù)有限公司. 用于載體構(gòu)建的連接載體pBI-121和大腸桿菌菌株DH5α的感受態(tài)細(xì)胞、卡納霉素(Kanamycin，Kan)、利福平(Rifampin，Rif)、鏈霉素(Streptomycin，Str)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司. 用于啟動子克隆的pFGC5941載體購于瑞真生物工程有限公司.

實驗儀器：電泳系統(tǒng)(ATTO，AE-6111)；PCR儀(Biometra)；凝膠成像系統(tǒng)(UVP，LMS-26E)；

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取 按照DNA快速提取試劑盒的說明書提取柑橘品種“克里曼丁橘”和荔枝品種“三月紅”的葉片總DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，保存于-20 ℃冰箱中備用.

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 分別從在線網(wǎng)站http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php中下載得到甜橙NPR1基因序列(ctNPR1)；從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載菠菜Defensin基因序列，與荔枝品種“三月紅”的基因組序列比對，得到一段同源序列并命名為DF-1；從NCBI網(wǎng)站中下載pBI-121載體編碼序列，以及pFGC5941載體上的啟動子(35S-PR)和終止子(TER-1)序列. 利用Primer 5設(shè)計NPR1、TER-1、35S-PR、DF-1等4個片段的特異性擴(kuò)增引物(表1). 根據(jù)ClonExpressII One Step Cloning Kit試劑盒提供的連接方法，在ctNPR1的正向引物與DF-1的反向引物中的5′端分別引入線性化克隆載體酶切位點末端序列，使得插入片段的PCR產(chǎn)物5′和3′最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)的完全一致的序列 (15～20 bp)，再按照上述4個片段的排列順序分別在各片段正向引物的5′端添加前一個片段的3′端同源序列(15～20 bp)，反向引物的5′端添加后一個片段的5′端同源序列，引物序列由生工生物工程有限公司合成.

表1 基因克隆及轉(zhuǎn)基因植株檢測所用引物Table 1 Primers used for gene cloning and detection of transgenic plants

1.2.3 目的片段的擴(kuò)增及測序 分別以克里曼丁橘總DNA、pFGC5941載體、荔枝“三月紅”總DNA為模板，利用上述引物擴(kuò)增進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，得到ctNPR1(1784 bp)、TER-1(738 bp)、35S-PR(1343 bp)與DF-1(313 bp) DNA片段. 反應(yīng)體系25 μL，其中模板DNA 1 μL，正反擴(kuò)增引物各1 μL，Prime STAR Max Premix12.5 μL，然后加雙蒸水補(bǔ)足至25 μL， PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 下預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，63 ℃退火10 s，72 ℃ 延伸20 s，循環(huán)34次；72 ℃延伸3 min. 反應(yīng)產(chǎn)物用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測. 以第1輪的4段擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以ctNPR1 F作為上游引物，DF-1 R作為下游引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，利用各片段兩端的重復(fù)序列連接4個DNA片段. 反應(yīng)同樣采用25 μL體系，連接后的目的片段理論長度為4 119 bp. 在偱環(huán)儀上進(jìn)行擴(kuò)增. 第2輪反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇與目的片段大小一致的條帶進(jìn)行膠回收，所得PCR產(chǎn)物與膠回收產(chǎn)物測序.

1.2.4 ctNPR1和DF-1雙價抗病基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 經(jīng)BamH1和Sac1雙酶切的載體pBI-121在電泳后將載體骨架從膠中回收、純化. 連接測序后的目的片段和線性化載體，獲得ctNPR1和DF-1雙價抗病基因過量表達(dá)載體，命名為ND-pBI121. 用ND-pBI121轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在含有Kan的LB平板上培養(yǎng). 正常生長的陽性克隆菌斑經(jīng)PCR檢測后，在含有Kan的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒. 所得質(zhì)粒經(jīng)目的基因特異引物ctNPR1(F/R)PCR鑒定為陽性后，將重組質(zhì)粒用化學(xué)法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，在含有Kan、Rif、Str的LB平板上培養(yǎng)，所得克隆菌斑進(jìn)行PCR陽性鑒定，用于沙田柚的遺傳轉(zhuǎn)化.

1.2.5 ND-pBI121在沙田柚幼苗中的遺傳轉(zhuǎn)化 將沙田柚上胚軸斜切成1～2 cm小段的外植體用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染柑橘上胚軸具體的方法步驟參考貝學(xué)軍[18]和胡新喜等[19]的方法. 上胚軸愈傷組織分化出的抗性再生芽長到2 cm，并在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至葉片顏色深綠后用于嫁接. 待嫁接成活的幼芽長出5～6片幼葉時，取新生葉片提取總DNA，使用引物ctNPR1 F、DF-1 R進(jìn)行PCR檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增與連接

以甜橙總DNA、pFGC5941載體、三月紅荔枝總DNA為模板，通過第1輪PCR擴(kuò)增出ctNPR1(1 784 bp)、TER-1 (738 bp)、35S-PR(1 343 bp)與DF-1 (313 bp) DNA片段，經(jīng)凝膠電泳檢測，獲得條帶大小與預(yù)測條帶大小一致(圖1A). 以第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增出一條大小約為4 000 bp的條帶(圖1B)，目的片段預(yù)測為4 119 bp，基本符合，將其進(jìn)行膠回收并純化后測序，測序結(jié)果與該片段的預(yù)期序列進(jìn)行比對，結(jié)果基本一致，僅在35S啟動子的非保守區(qū)域有個別堿基錯配發(fā)生，對目的片段的表達(dá)并無影響.

圖1 目的片段擴(kuò)增及連接產(chǎn)物的電泳結(jié)果

Figure 1 Electrophoresis analysis of target fragments (A) amplified from the ligated product (B)

注：M為DL5000 DNA marker.

2.2 ctNPR1和DF-1雙價抗病基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SacⅠ對載體pBI-121進(jìn)行雙酶切，得到2個片段，分別為大小約為12 000 bp的載體骨架序列和大小約為2 000 bp的小片段(圖2A)，符合預(yù)期大小. 將pBI-121骨架序列回收后與目的片段根據(jù)同源重組的方法連接為重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌. 獲得的陽性克隆使用基因特異引物ctNPR1(F/R)PCR檢測驗證后進(jìn)行菌液培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再次進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果與預(yù)期相符(圖2B)，表明已成功獲得ctNPR1和DF-1雙價抗病基因過量表達(dá)載體，命名為ND-pBI121.

2.3 根癌農(nóng)桿菌工程菌及擬轉(zhuǎn)基因植株獲得

圖2 線性化載體與農(nóng)桿菌陽性鑒定的電泳結(jié)果

Figure 2 Linearized pBI 121 vector (A) and identification of positive transformed Agrobacterium (B)

注：M1為DL5000 DNA marker，M2為DL2000 DNA marker，CK1為未酶切的pBI-121載體，CK2為陰性對照.

圖3 ND-pBI121農(nóng)桿菌菌液的PCR檢測及擬轉(zhuǎn)基因植株

Figure 3 PCR detection of ND-pBI121 Agrobacterium liquid and transgenic plant

注： M1為DL5000 DNA marker，1～4為隨機(jī)挑選的EHA105菌斑菌液PCR的結(jié)果，“+”為陽性對照，“-”為陰性對照.

將重組質(zhì)粒ND-pBI121用化學(xué)法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，獲得過量表達(dá)ctNPR1和DF-1的農(nóng)桿菌工程菌，隨機(jī)挑選4～5個菌斑進(jìn)行菌液PCR檢測，其檢測結(jié)果均為陽性(圖3A). 表明已成功獲得轉(zhuǎn)入ND-pBI121表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株. 將沙田柚幼苗的上胚軸與PCR檢測結(jié)果為陽性的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，一共獲得了7株抗性芽(分別編號為ND1～ND7). 將抗性芽嫁接至沙田柚的砧木，成活后獲得了擬轉(zhuǎn)基因植株(圖3B).

2.4 沙田柚轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

用7株擬轉(zhuǎn)基因植株葉片提取總DNA進(jìn)行PCR檢測，引物為ctNPR1 F、DF-1 R，結(jié)果顯示ND1～ND5和ND7為陽性(圖4). 說明，這6株為導(dǎo)入了ctNPR1和DF-1基因的轉(zhuǎn)基因植株.

圖4 擬轉(zhuǎn)基因沙田柚植株的PCR檢測

注：M為DL5000 DNA marker，“-”為陰性對照，“+”為陽性對照.

3 討論

筆者成功構(gòu)建了ctNPR1和DF-1雙價抗病基因的過量表達(dá)載體ND-pBI121，并導(dǎo)入大腸桿菌中保存. 經(jīng)PCR檢測為陽性后，轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌. 通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了6株經(jīng)PCR檢測證實為陽性的沙田柚轉(zhuǎn)基因植株. 本實驗的結(jié)果將為探究ctNPR1和DF-1的過量表達(dá)對柑橘黃龍病的抗性影響提供理想試材.

由于單個抗病基因選擇性抑菌以及抗病譜窄等原因，很難獲得效果理想的轉(zhuǎn)基因植株，為提高轉(zhuǎn)基因植物的廣譜抗病性和持久性，更好地抵御不同病害，就需要同時轉(zhuǎn)入一個以上具有廣譜抗性的抗病基因[20]. 已有實驗證明，擬南芥的NPR1基因可使柑橘對黃龍病的抗性提高，但是提高的程度并不顯著，無法起到明顯的防治效果[15]，因此嘗試多基因的導(dǎo)入模式對柑橘的抗黃龍病分子育種具有重大意義. 本文選擇來源于柑橘的NPR1基因和來源于抗病性較強(qiáng)的荔枝的Defensin基因為操作對象，構(gòu)建獲得了雙價抗病基因過量表達(dá)載體，以期獲得能夠更加有效的抵抗黃龍病的柑橘品種.

后續(xù)試驗中需要擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得更多轉(zhuǎn)基因植株，并對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行黃龍病抗性評價，同時與單一轉(zhuǎn)入柑橘NPR1基因的沙田柚植株進(jìn)行對比，以驗證多基因?qū)肽Ｊ降目尚行?，為在分子層面探究如何增?qiáng)柑橘對黃龍病的抗性提供了更多的可能. 這在柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展受到黃龍病嚴(yán)重影響的大環(huán)境下，對防治黃龍病、加強(qiáng)抗性育種材料的篩選和利用具有重大意義.

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Construction of Bivalent Over-Expression Vector of the NPR1 and Defensin Genes and its Transformation into Shatianyou Pummelo (Citrus grandis (L.) Osbeck)

MU Yifan1, ZHONG Guangyan2*, GAO Feng1*, ZHONG Yun2, HU Minlun2, YAN Huaxue2, JIANG Bo2, WU Bo2

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2. Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China)

To improve the disease resistance of Shatianyou Pummelo (CitrusgrandisL. Osbeck) to Huanglongbing, the open reading frames ofNPR1 andDefensingenes were obtained by PCR from the leaf genomic DNA ofCitrusclementinaand lich cv. “Red March”, respectively, and were cloned into the binary vector pBI 121. The recombinant plasmid harboring both genes of NPR1 and Defensin , named ND-PBI 121, was successfully constructed, and was transformed into Shatianyou Pummelo by theAgrobacteriumtumefaciensmediated transformation. Six transformed plants were obtained. The results provide the basis for study of the function ofNPR1 and Defensin on the resistance of Shatianyou Pummelo to Citrus Huanglongbing.

disease resistance gene; over-expression vector; citrus huanglongbing; genetic transformation;Citrusgrandis(L.) osbeck cv. ‘Shatianyou’

2016-10-27 《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學(xué)基金項目(31572113); 廣東省科技計劃項目(2014B020202009，2016B020201006，2014B070706018)

*通訊作者:鐘廣炎，研究員，Email:gy_zhong@163.com；高峰，教授，Email:peak0041@vip.sina.com.

S666.3; Q785

A

1000-5463(2017)06-0060-05

【中文責(zé)編：成文；助理編輯：冷佳奕 英文審校：李海航】