梁寶愛 張素娟 楊 凱

1（國家農(nóng)副加工產(chǎn)品及白酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，山西太原030012）

2（山西省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，山西太原030012）

黃曲霉毒素B1是黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生的黃曲霉毒素次生代謝物之一，它被世界衛(wèi)生組織劃定為1類致癌物，毒性比砒霜大68倍，是目前已知霉菌毒素中毒性最強的，黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物、肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡。因此，我國的國家標準中對于各類食品中黃曲霉毒素B1的限量為 0.5 μg/kg～20 g/kg。

目前，黃曲霉毒素B1依據(jù)國家標準GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》進行檢測，在樣品前處理時，凈化過程等僅提供了人工手動的前處理凈化參考條件，耗時長、誤差大，對檢驗人員身體健康存在安全風險。因此本研究采用多功能凈化平臺進行全自動提取凈化處理,經(jīng)高效液相色譜儀測定。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），韓國德山藥品工業(yè)（株）；氯化鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純），天津市光復科技發(fā)展有限公司；氯化鉀（分析純），天津市天力化學試劑有限公司；吐溫-20，天津市大茂化學試劑廠；鹽酸（分析純），北京化工廠；黃曲霉毒素B1標準溶液（3 μg/mL），美國 Supelco公司。

1.2 儀器與設備

Freedom EVO ppSPE型多功能凈化平臺，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；U3000高效液相色譜儀（熒光檢測器），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；UGC-45CE型氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；AL104型天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Pribolab型光化學柱后衍生器，青島普瑞幫生物工程有限公司；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凈化條件

本研究“多功能凈化平臺”前處理方法與GB 5009.22—2016中“第三法 高效液相色譜—柱后衍生法”中前處理方法進行比較。

準確移取4 mL已處理好上清液（上清液的制備依據(jù) GB 5009.22—2016中 12.1、12.2），加入46 mL1%吐溫-20的PBS，混勻。

免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后,采用多功能凈化平臺移取50.0 mL樣品提取液，每次移取提取液2.5 mL，移取 20 次，以 17 μL/s（1 mL/min）的流速使溶液緩慢通過免疫親和柱后，以空氣吹掃體積3 300 μL過柱，移取10 mL水，以17 μL/s的淋洗速度淋洗柱子2次，棄去全部流出液，再以空氣吹掃體積3 300 μL使空氣通過柱體。準確移取2.0 mL甲醇洗脫，以17 μL/s的洗脫速度進行洗脫后，以空氣吹掃體積2 000 μL排空親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，用初始流動相定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，用孔徑0.22 μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

1.3.2 色譜條件

流動相：A相，水；B相，乙腈-甲醇（50+50）；等梯度洗脫條件：A，68%、B，32%；色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：50 μL；光化學柱后衍生器；激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱取樣液量及各種流速的選擇

使用多功能凈化平臺設備對流速的精確控制是自動化操作的最大優(yōu)勢，但若嚴格按照國標要求的流速進行過柱就會降低過柱的效率。依據(jù)多功能凈化平臺的實際流速控制范圍 4.17 μL/s～4 167 μL/s，分別選取不同樣品、不同濃度標準溶液，選取空氣吹掃體積均為2 000 μL，對黃曲霉毒素B1檢驗項目取樣量、固相萃取的凈化液、淋洗液、洗脫液3種流速（8 μL/s、17 μL/s、35 μL/s）進行試驗條件選擇。

通過試驗發(fā)現(xiàn)，在使用取樣針進行移液時，為了對目標液體和系統(tǒng)液（水）進行有效隔離，防止二者接觸后系統(tǒng)液對目標液體的稀釋和污染，按國家標準方法要求，移取凈化液體積、淋洗液體積分別為50 mL和20 mL。該多功能凈化平臺是5 mL的泵，能吸取目標液體的體積最大量為4 950 μL，只能通過多次循環(huán)移液來完成，而移液循環(huán)次數(shù)又是整數(shù)，因此，為了方便編程和修改程序，采用凈化液體積每次吸取2.5 mL作為移液的最大體積進行循環(huán)。而對于淋洗液為水洗的步驟，使用系統(tǒng)液（水）進行，為了提高移液速度，在程序中就設置一次吸取5 mL，洗脫液吸取2 mL。

根據(jù)對5類食品中黃曲霉毒素B1檢驗加標回收率的情況（見表1）和檢驗時間結(jié)合確定最佳流速條件：黃曲霉毒素B1測定時樣液、淋洗液、洗脫液流速控制在17 μL/s（相當于流速1 mL/min）。

2.2 進入固相萃取柱空氣吹掃體積的選擇

樣液、淋洗液、洗脫液分別過柱后，均需要空氣吹掃固相萃取柱。原因是第一步樣液過柱完成后，如直接加入清洗液，柱子中殘留的樣本會降低清洗液的清洗效果，也降低樣本中待測物與柱子的結(jié)合程度，會降低回收率。第二步淋洗液清洗完成后，如直接加入洗脫液，柱子中殘留的清洗液會降低洗脫液的洗脫效果，降低洗脫效率，進而降低回收率的問題。第三步洗脫液過柱，目的是將被測物全部解析后，待分析。如不進行空氣吹掃，就會直接影響檢驗結(jié)果的準確度。為了達到好的凈化、洗脫效果，在選定多功能凈化平臺最佳流速參數(shù)的基礎上，分別選取不同樣品、不同濃度標準溶液，對黃曲霉毒素B1檢驗項目上樣、淋洗、洗脫后選用3種空氣吹掃體積（1 000 μL、2 000 μL、3 300 μL）進行最佳條件的選擇。通過試驗，根據(jù)5類食品中黃曲霉毒素B1檢驗回收率的情況（見表2），確定最佳空氣吹掃體積：黃曲霉毒素B1檢驗項目上樣后空氣吹掃體積、淋洗后空氣吹掃體積均為3 300 μL，淋洗后空氣吹掃體積分別為 2 000 μL。通過空氣吹掃體積的選擇，既能將柱子中的殘留液排干，又能提高各個過程的作用效率，從而能夠達到很好的洗脫效果。

表1 黃曲霉毒素B1各流速參數(shù)的選擇

表2 黃曲霉毒素B1過固相萃取柱空氣吹掃體積的選擇

2.3 多功能凈化平臺取樣針及輔助設施的選擇

多功能凈化平臺設備配備了約15 cm的長取樣針和約11 cm的短取樣針，根據(jù)配備的細試管，為了對待凈化液樣品準確移取，選擇了長取樣針進行凈化試驗，經(jīng)過多次試驗，發(fā)現(xiàn)在試驗過程中經(jīng)常出現(xiàn)取樣針變形彎曲，在固相萃取柱上卡針、報警。為了解決報警、停止試驗的情況，現(xiàn)選擇了短取樣針，同時對相應使用的試管和試管架進行了更換，樣液試管采用了離心管，在連續(xù)進行試驗過程中，未發(fā)生報警、卡針故障。

2.4 多功能凈化平臺凈化步驟的選擇

使用多功能凈化平臺設備處理樣品，在樣本量較大時，柱活化、上樣順序的選擇尤為重要。在開始試驗設定凈化步驟程序時，對所有固相萃取柱進行活化，然后進行取樣，但由于待凈化液樣液量較大，必須多次取樣，同時考慮已活化的固相萃取柱不能變干。在一次固相抽取8個樣液后，對取樣針清洗，再取另一排的8個樣液，由于交替取不同排的樣液，增加了洗針的程序，增加很長的處理時間，同時增加了交叉污染的風險。通過不斷試驗，對于不能一次性取完樣液的檢驗項目按一次性8個樣品全部程序處理完，再進行下一排8個樣品的處理。這樣既減少了洗針次數(shù)，縮短了處理時間，又可使下一步的濃縮步驟提前進行。整個試驗相當于縮短一半的時間，保證了準確性又提高了檢驗效率。

2.5 精密度的測定

根據(jù)樣品基體的復雜程度和檢驗方法標準，選取了不同有代表性的4類食品樣品，同時向部分陰性試樣中加入一定濃度的標準溶液，按照1.3.1凈化條件，進行精密度試驗，平行測定6次，結(jié)果見表3。由表3可以看出，黃曲霉毒素B1檢驗項目加標量在 2.0 μg/kg～20 μg/kg范圍時，相對標準偏差（RSD）在 1.45%～5.57%之間，符合 GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[5]中被測組分含量在0.1 μg/kg～10 mg/kg時，RSD為4.3%～7.5%的要求。

2.6 多功能凈化平臺穩(wěn)定性試驗

根據(jù)多功能凈化平臺設備具有8個獨立的移液通道，可同時對8個樣本進行過柱操作的特性，選取4種不同基質(zhì)的空白樣品，向試樣中加入質(zhì)量濃度5.0 μg/kg的標準溶液，提取后在多功能凈化平臺上進行自動化一次性凈化處理，測定其含量，通過回收率的變化，確認多功能凈化平臺的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。通過表4可看出，在進行每個檢驗項目測定不同基質(zhì)的樣品檢測過程中回收率均在80%以上，變化不明顯，穩(wěn)定性良好。

2.7 準確度的測定

為了驗證多功能凈化平臺前處理方法的準確度，選取不同基體的樣品，加入不同質(zhì)量濃度的各項目標準溶液，按照1.3.1凈化條件，按已確定的凈化條件進行處理，做準確度試驗，結(jié)果見表5。由表5可以看出，黃曲霉毒素B1檢驗項目回收率在75%～105%之間，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中被測組分含量在＜0.1 mg/kg時，回收率范圍在60%～120%的要求。

表3 同一樣品加標準溶液或陽性樣品進行精密度試驗（n=6）

表4 8個獨立移液通道同時測定不同樣品加標準溶液進行穩(wěn)定性試驗

表5 同一樣品加不同質(zhì)量濃度標準溶液回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.8 與國標檢驗方法比較

2.8.1 檢測數(shù)據(jù)的比較

為了驗證該方法的可行性和可靠性，選取了不同具有代表性的樣品，分別采用多功能凈化平臺與國家標準GB 5009.22-2016(第三法)手動固相萃取凈化方法進行了比較，結(jié)果中見表6。由表6可知，2種方法均符合國家標準要求，但本方法回收率基本高于手動固相萃取凈化方法，相對標準偏差低于手動固相萃取凈化方法。結(jié)果表明，該方法的準確度高、精密度好、穩(wěn)定性好，減少了人為引起的偶然誤差。

表6 多功能凈化平臺與國家標準方法回收率及精密度的比較

2.8.2 工作效率的比較

通過多次試驗，使用多功能凈化平臺進行凈化處理的結(jié)果不僅準確度高、精密度好，而且從表7可看出，多功能凈化平臺的處理方法凈化時間短，可節(jié)省3/4的時間，由原來的360 min中縮短到90 min。

多功能凈化平臺全自動方式進行凈化處理，無需人員看守，檢驗人員可同時完成其他工作，從而提高工作效率；在保障檢驗人員安全方面，通過平臺全自動進行凈化處理，檢驗人員避免了直接接觸陽性樣品并減少了直接接觸有機試劑的機會，從而使檢驗人員的身體安全得到了保障。

表7 多功能凈化平臺方法與國家標準方法的比較

2.9 多功能凈化平臺方法在實驗室能力驗證中的應用

2016年在參加食藥總局和認監(jiān)委對黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素M1的能力驗證考核中，使用了多功能凈化平臺的凈化處理方法對考核樣品進行了試驗，結(jié)果均為滿意，充分證明該方法的可行性與可靠性。能力驗證考核結(jié)果見表8。

表8 能力驗證考核結(jié)果

3 結(jié)論

采用多功能凈化平臺建立了一種高效、準確、安全、環(huán)保的應用于食品中黃曲霉毒素B1檢驗的食品檢驗自動化凈化前處理方法。試驗結(jié)果表明，該方法回收率在81.3%～104.0%，RSD＜6.0%，準確度高、精密度好，能夠滿足其國家檢驗方法標準和GB/T27404—2008的要求。

［1］馬志科，昝林森.黃曲霉毒素危害、檢測方法及生物降解研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（9）:91-94.

［2］余丹，鄒成義.黃曲霉毒素對蛋品質(zhì)影響及機理研究［J］.飼料工業(yè)，2009，30（4）：59-60.

［3］國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB2761—2017，食品安全國家標準食品中真菌毒素限量［S］.北京：中國標準出版社，2017：1-8.

［4］國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 5009.22—2016，食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定［S］.北京：中國標準出版社，2016.

［5］中華人民共和國浙江出入境檢驗檢疫局.GB/T 27404—2008，實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測［S］.北京：中國標準出版社，2008：3-27.