李紅壘，徐丁潔，郭地利，耿玉聰，高學(xué)敏，李世峰，徐洪，楊方，魏中秋

（華北理工大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)實驗研究中心，2.中醫(yī)學(xué)院，3.病理學(xué)系，河北 唐山 063210）

Ac-SDKP通過調(diào)節(jié)HDAC6和HSP90抑制矽肺纖維化的機(jī)制研究*

李紅壘1，徐丁潔2，郭地利1，耿玉聰1，高學(xué)敏1，李世峰1，徐洪1，楊方1，魏中秋3

（華北理工大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)實驗研究中心，2.中醫(yī)學(xué)院，3.病理學(xué)系，河北 唐山 063210）

目的探討Ac-SDKP通過對組蛋白去乙?；?（HDAC6）、熱休克蛋白90（HSP90）的調(diào)節(jié)，抑制大鼠矽肺纖維化的作用機(jī)制。方法非暴露式支氣管內(nèi)灌注法復(fù)制大鼠矽肺模型，分為對照4周組、矽肺模型4周組、對照8周組、矽肺模型8周組、Ac-SDKP抗纖維化治療組和Ac-SDKP預(yù)防治療組。采用轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)原代培養(yǎng)新生大鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，并予以Ac-SDKP和HDAC6特異性抑制劑TCS HDAC6 20b預(yù)處理。采用蘇木精-伊紅染色法觀察病理形態(tài)變化，免疫組織化學(xué)法、Western blot檢測Ⅰ型膠原、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、HDAC6及HSP90的表達(dá)。結(jié)果免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，HDAC6和HSP90陽性表達(dá)主要位于矽結(jié)節(jié)內(nèi)，給予Ac-SDKP抗纖維化治療或預(yù)防治療均能抑制Ⅰ型膠原、α-SMA、HDAC6及HSP90蛋白表達(dá)的上調(diào)。而TGF-β1能誘導(dǎo)大鼠成纖維細(xì)胞α-SMA陽性表達(dá)，同時伴隨HDAC6和HSP90蛋白表達(dá)上調(diào)，而予以TCS HDAC6 20b或Ac-SDKP預(yù)處理均能抑制該變化。結(jié)論Ac-SDKP能夠通過對HDAC6和HSP90信號的調(diào)節(jié)，在體內(nèi)外抑制矽肺大鼠肌成纖維細(xì)胞分化和膠原沉積，從而發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用。

Ac-SDKP；肺纖維化；HDAC6；HSP90

矽肺病是我國最嚴(yán)重的職業(yè)病，占職業(yè)病報告總例數(shù)的90%左右，其主要病理特征為矽結(jié)節(jié)形成和間質(zhì)纖維化[1]。本課題組前期采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)乙?；⒐艿鞍爪粒╝cetylated α-tubulin，α-Ac-Tub）在矽肺模型組表達(dá)下調(diào)，而Ac-SDKP抗纖維化治療或預(yù)防治療能夠上調(diào)其表達(dá)，提示α-Ac-Tub可能是Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用的靶蛋白之一[2]。α-Tub乙酰化位點(diǎn)位于其第40位賴氨酸殘基，主要依賴組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylase，HDAC）的調(diào)節(jié)[3-4]。有關(guān)研究表明，HDAC6具有非組蛋白底物的特異性，主要作用于α-Tub、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）和皮動蛋白的去乙?；痆5-7]。因此，本研究擬通過支氣管灌注二氧化硅SiO2復(fù)制矽肺大鼠模型，結(jié)合體外轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化模型，觀察Ac-SDKP對HDAC6和HSP90信號的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步完善其抗纖維化作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SiO2粉塵購置于美國Sigma公司，藥物微量釋放泵（Alzet 2 ml）購置于美國Durect公司，Ac-SDKP（H-1156）購置于瑞士Bachem AG公司，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗購置于美國Eptomics公司，HDAC6兔抗、Ⅰ型膠原兔抗均購置于美國Abcam公司，HSP90購置于美國BD Transduction Laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及模型的復(fù)制SPF級成年雄性Wistar大鼠60只，質(zhì)量（180±10）g，訂購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（動物許可證：SCXK京20090003），在華北理工大學(xué)動物實驗中心屏障實驗室飼養(yǎng)。大鼠隨機(jī)分成6組：①對照4周組：一次性支氣管灌注生理鹽水1 ml，腹腔包埋含2 ml生理鹽水的微量緩釋泵，飼養(yǎng)4周后處理；②矽肺模型4周組：一次性支氣管灌注含50 mg/ml SiO2的生理鹽水1 ml，腹腔包埋含2 ml生理鹽水的微量緩釋泵，飼養(yǎng)4周后處理；③對照8周組：一次性支氣管灌注生理鹽水1 ml，腹腔包埋含2 ml生理鹽水的微量緩釋泵，飼養(yǎng)8周后處理；④矽肺模型8周組：一次性支氣管灌注含50 mg/ml SiO2的生理鹽水1 ml，腹腔包埋含2 ml生理鹽水的微量緩釋泵，飼養(yǎng)8周后處理；⑤Ac-SDKP抗纖維化治療組：一次性支氣管灌注含50 mg/ml SiO2的生理鹽水1 ml，腹腔包埋含2 ml生理鹽水的微量緩釋泵，4周后更換為含Ac-SDKP 800μg/（kg·d）的微量緩釋泵，繼續(xù)飼養(yǎng)至第8周處理；⑥Ac-SDKP預(yù)防治療組：灌塵前48 h腹腔包埋含Ac-SDKP 800μg/（kg·d）的微量緩釋泵，一次性支氣管灌注含50 mg/ml SiO2的生理鹽水1 ml，飼養(yǎng)8周后處理。實驗結(jié)束后，右下肺固定、包埋切片；其余組織-80℃冷凍。

1.2.2 肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及分組原代培養(yǎng)大鼠肺成纖維細(xì)胞，取2代細(xì)胞用于實驗研究。實驗分組：①對照組：空白培養(yǎng)基（無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）孵育細(xì)胞；②TGF-β1誘導(dǎo)組：空白培養(yǎng)基+ TGF-β15 ng/ml誘導(dǎo)；③Ac-SDKP預(yù)處理組：空白培養(yǎng)基+Ac-SDKP 10～8 mol/L預(yù)處理1 h后，給予TGF-β15 ng/ml共孵育；④TCS HDAC6 20b預(yù)處理組：空白培養(yǎng)基+HDAC6特異性抑制劑TCS HDAC6 20b 10～6 mol/L預(yù)處理1 h后，給予TGF-β15 ng/ml共同孵育。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色5 min，流水沖洗，0.117 mol/L鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗返藍(lán)，伊紅染色1 min，逐步梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色法切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)，0.3%雙氧水H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，HDAC6（1∶100）和HSP90（1∶100）4℃孵育過夜，二抗37℃、30 min，DAB顯色，鏡下控制，輕度復(fù)染，常規(guī)脫水透明封片，檢測HDAC6和HSP90的表達(dá)。

1.2.5 Western blot檢測提取肺組織或成纖維細(xì)胞蛋白，Brafford法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封閉1 h，一抗I型膠原（1∶500）、α-SMA（1∶500）、HDAC6（1∶500）、HSP90（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）37℃孵育30 min。ECL發(fā)光試劑顯色，采用Image-Pro-plus圖像處理軟件對條帶進(jìn)行分析，以目的蛋白光密度值與GAPDH內(nèi)參蛋白光密度值的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量，檢測I型膠原、α-SMA、HDAC6及HSP90蛋白的表達(dá)

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠矽肺模型病理形態(tài)學(xué)變化特點(diǎn)

HE染色結(jié)果顯示，對照組肺泡壁薄，結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。矽肺模型組肺組織內(nèi)可見肺泡壁均呈不同程度增寬，且有明顯的矽結(jié)節(jié)形成，多由巨噬細(xì)胞和增生的成纖維細(xì)胞構(gòu)成。其中矽肺模型4周組以細(xì)胞性結(jié)節(jié)多見，而矽肺模型8周組可見多個矽結(jié)節(jié)融合，纖維細(xì)胞性結(jié)節(jié)多見。經(jīng)Ac-SDKP抗纖維化治療或預(yù)防治療后，矽結(jié)節(jié)數(shù)量和面積較矽肺模型8周組減少，肺組織纖維化程度減輕。見圖1。

圖1 矽肺大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 （HE染色）

2.2 Ac-SDKP對矽肺大鼠Ⅰ型膠原、α-SMA、HDAC6及HSP90表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，HDAC6和HSP90在對照組中表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞和部分肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，其中在支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)陽性表達(dá)，偶見胞核內(nèi)表達(dá)，而在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中以胞核表達(dá)為主；在矽肺模型組中，除具有上述表達(dá)特點(diǎn)外，在巨噬細(xì)胞中陽性表達(dá)較為顯著，多位于矽結(jié)節(jié)和間質(zhì)纖維化區(qū)域，以胞漿顯色為主。與矽肺模型8周組相比，Ac-SDKP抗纖維化治療和預(yù)防治療組矽結(jié)節(jié)明顯減小，HDAC6和HSP90陽性表達(dá)減弱。見圖2、3。

圖2 HDAC6在矽肺大鼠肺組織中的定位和表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色）

Western blot檢測結(jié)果顯示，HDAC6和HSP90在矽肺模型組較相應(yīng)時間點(diǎn)對照組表達(dá)增加，其中HDAC6上調(diào)至相應(yīng)時間點(diǎn)對照組的2.04和1.60倍，HSP90上調(diào)至1.58和1.81倍；Ac-SDKP抗纖維化治療和預(yù)防治療后HDAC6和HSP90表達(dá)較矽肺模型8周組下降，其中HDAC6表達(dá)分別下調(diào)至矽肺模型8周組的87.07%和75.57%，HSP90分別下調(diào)至76.09%和69.29%，對照4周組、矽肺模型4周組、對照8周組、矽肺模型8周組、Ac-SDKP抗纖維化治療組、Ac-SDKP預(yù)防治療組的HDAC6、HSP90蛋白比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F =41.780和 30.893，均P =0.000）。α-SMA和I型膠原在矽肺模型組分別較相應(yīng)時間點(diǎn)對照組表達(dá)增加，其中矽肺模型4周組α-SMA和I型膠原表達(dá)量是對照4周組的1.73和1.95倍，矽肺模型8周組α-SMA和I型膠原表達(dá)量是對照8周組的2.15和1.84倍；而Ac-SDKP抗纖維化治療和預(yù)防治療組α-SMA和I型膠原表達(dá)較矽肺8周組下降，α-SMA分別下調(diào)至矽肺8周組的65.31%和70.15%，I型膠原分別下調(diào)至矽肺8周組的77.67%和69.13%，對照4周組、矽肺模型4周組、對照8周組、矽肺模型8周組、Ac-SDKP抗纖維化治療組、Ac-SDKP預(yù)防治療組的α-SMA、I型膠原蛋白比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F =23.517和37.349，均P =0.000）。見表1和圖4。

2.3 Ac-SDKP在TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中對HDAC6、HSP90的調(diào)節(jié)作用

Western blot結(jié)果顯示，I型膠原、α-SMA、HDAC6和HSP90在TGF-β1誘導(dǎo)組較對照組表達(dá)增加，分別上調(diào)1.68、1.76、1.70和1.85倍；分別給予Ac-SDKP、TCS HDAC6 20b預(yù)處理后，與TGF-β1誘導(dǎo)組相比，I型膠原、α-SMA、HDAC6和HSP90表達(dá)下降，其中I型膠原的表達(dá)分別是TGF-β1誘導(dǎo)組的68.69%和60.59%，α-SMA的表達(dá)分別是TGF-β1誘導(dǎo)組的64.98%和56.10%，HDAC6的表達(dá)分別是TGF-β1誘導(dǎo)組的76.60%和61.81%，HSP90的表達(dá)分別是TGF-β1誘導(dǎo)組的56.16%和47.95%。對照組、TGF-β1誘導(dǎo)組、Ac-SDKP預(yù)處理組、TCS HDAC6 20b預(yù)處理組的I型膠原、α-SMA、HDAC6、HSP90蛋白比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=72.707、55.804、29.799和81.115，均P=0.000）。見表2和圖5。

圖3 HSP90在矽肺大鼠肺組織中的定位和表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色）

表1 Ac-SDKP對矽肺大鼠肺內(nèi)Ⅰ型膠原、α-SMA、HDAC6及HSP90蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) （n =4，±s）

表1 Ac-SDKP對矽肺大鼠肺內(nèi)Ⅰ型膠原、α-SMA、HDAC6及HSP90蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) （n =4，±s）

注：1）與對照4周組比較，P ＜0.05；2）與對照8周組比較，P ＜0.05；3）與矽肺8周組比較，P ＜0.05

組別 I型膠原 α-SMA HDAC6 HSP90對照4周組 0.553±0.056 0.488±0.048 0.445±0.057 0.553±0.062矽肺模型4周組 1.143±0.0611） 0.813±0.0831） 0.890±0.0551） 0.935±0.0581）對照8周組 0.695±0.122 0.400±0.111 0.515±0.069 0.495±0.066矽肺模型8周組 1.233±0.0622） 0.950±0.1082） 0.900±0.0722） 0.905±0.0692）Ac-SDKP抗纖維化治療組 0.985±0.1013） 0.623±0.0743） 0.743±0.0573） 0.700±0.0573）Ac-SDKP預(yù)防治療組 0.833±0.0913） 0.603±0.0623） 0.563±0.0423） 0.610±0.0823）F值 37.349 23.517 41.780 30.893 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 Ⅰ型膠原、α-SMA、HDAC6及HSP90在肺組織中的表達(dá)

表2 Ac-SDKP對TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、α-SMA、HDAC6及HSP90表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 （n =4，±s）

表2 Ac-SDKP對TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、α-SMA、HDAC6及HSP90表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 （n =4，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，P ＜0.05

組別 I型膠原 α-SMA HDAC6 HSP90對照組 0.795±0.051 0.788±0.061 0.658±0.059 0.785±0.035 TGF-β1誘導(dǎo)組 1.365±0.0791） 1.410±0.0511） 1.068±0.0991） 1.353±0.0841）Ac-SDKP預(yù)處理組 0.905±0.0772） 1.000±0.0842） 0.795±0.0652） 0.973±0.0502）TCS HDAC6 20b預(yù)處理組 0.790±0.0392） 0.858±0.0942） 0.688±0.0362） 0.895±0.0342）F值 72.707 55.804 29.799 81.115 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

Ac-SDKP是一種生理性造血系統(tǒng)的生長抑制因子。近年來研究表明，Ac-SDKP在諸多器官纖維化動物模型（心、腎、肺、肝）中，Ac-SDKP均能夠抑制靶器官膠原的沉積，減輕致病因素導(dǎo)致的器官纖維化的程度[8-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP能夠調(diào)節(jié)α-Ac-Tub信號，發(fā)揮抑制矽肺大鼠肌成纖維細(xì)胞分化和膠原沉積的作用[2]。作為調(diào)節(jié)α-Tub去乙?；闹饕鞍?，HDAC6可被TGF-β1誘導(dǎo)并促進(jìn)α-Ac-Tub的去乙酰化，參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控，而抑制HDAC6的表達(dá)，能夠阻斷TGF-β1/Smad3信號的活化[11-12]。ROCK信號活化能夠磷酸化TPPP1，使其失去對HDAC6的抑制作用，促進(jìn)α-Tub的去乙?；?，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移[13-14]。HDAC6基因敲除或HDAC6選擇性抑制劑Tubastatin A，能夠改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大和纖維化程度，并維持心肌收縮能力和左心室功能，起到一定的心血管保護(hù)作用[15]。提示針對HDAC6信號的阻斷能夠發(fā)揮拮抗器官纖維化的作用。而HSP90是HDAC6的經(jīng)典下游底物，可由HDAC6脫乙?；せ頪16]。HSP90抑制劑17-AAG能夠抑制TGF-β1信號的活化，從而減輕腎纖維化病變程度[17]，同時還能夠抑制氧化應(yīng)激損傷，改善硫代乙酰胺所致的肝損傷，降低星狀細(xì)胞活性[18]。然而，Ac-SDKP是否能夠通過調(diào)節(jié)HDAC6及其特異底物HSP90信號，并發(fā)揮相應(yīng)的抗纖維化作用，目前仍不清楚。

本實驗免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，在α-SMA陽性表達(dá)的矽結(jié)節(jié)和間質(zhì)纖維化區(qū)域，HADC6和HSP90表達(dá)增強(qiáng)。Western blot檢測結(jié)果也顯示，與對照組相比，矽肺模型4和8周組的α-SMA、I型膠原、HADC6、HSP90的蛋白表達(dá)量增加。體外實驗結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)刺激成纖維細(xì)胞可增強(qiáng)HADC6和HSP90蛋白的表達(dá)，同時伴隨著肌成纖維細(xì)胞分化和I型膠原的合成，而TCS HDAC6 20b預(yù)處理組與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，α-SMA、I型膠原、HDAC6和HSP90表達(dá)均下調(diào)，阻斷了肌成纖維細(xì)胞分化。提示，針對HDAC6信號的阻斷，能夠抑制肌成纖維細(xì)胞分化和膠原沉積，其可能是器官纖維化的一個新的靶向治療方法。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，給予Ac-SDKP抗纖維化治療和預(yù)防后，能夠逆轉(zhuǎn)HADC6和HSP90水平的升高，從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化和I型膠原蛋白的表達(dá)。提示Ac-SDKP能夠通過對HADC6和HSP90蛋白信號的阻斷，從而抑制肌成纖維細(xì)胞分化和膠原沉積，這可能是Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用新的機(jī)制之一。

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Effect of Ac-SDKP on expressions of HDAC6 and HSP90 in lungs of rats with silicosis*

Hong-lei Li1,ding-jie Xu2,di-li Guo1, Yu-cong Geng1, Xue-min Gao1, Shi-feng Li1, Hong Xu1,
Fang Yang1, Zhong-qiu Wei3
(1. Medical Research Center, 2. Institute of Traditional Chinese Medicine, 3.department of Pathology, North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063210, China)

ObjectiveTo investigate the effect of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (Ac-SDKP) on the expressions of histonedeacetylase 6 (HDAC6) and heat shock protein 90 (HSP90) in the process of fibroblast differentiation.MethodsRats were instilled with silica through trachea to establish silicotic models. The rats weredivided into 4-week control group, 4-week silicosis group, 8-week control group, 8-week silicosis group, Ac-SDKP treatment group and Ac-SDKP pre-treatment group. Myofibroblasts induced by TGF-β1 were pretreated with TCS HDAC6 20b, the specific inhibitor of Ac-SDKP and HDAC6. Routine HE staining was used to observe the pathomorphology. The expressions of α-SMA, collagen I, HDAC6 and HSP90 were measured by immunohistochemistry and Western blot.ResultsThe expressions of HDAC6 and HSP90 were increased in the silicotic nodules of the rat lungs; upon the treatment or pre-treatment with Ac-SDKP, the expressions of collagen I, α-SMA, HDAC6 and HSP90 weredecreased. TGF-β1 induced the α-SMA expression in rat fibroblasts and up-regulated the expressions of HDAC6 and HSP90; moreover, pre-treatment with Ac-SDKP or TCS HDAC6 20b inhibited the TGF-β1-induced expressions of these factors.ConclusionsAc-SDKP inhibits myofibroblast differentiation and collagendeposition, which is related with regulation of HDAC6 and HSP90.

N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline; fibrosis; HDAC6; HSP90

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.001

1005-8982（2018）02-0001-07

R135.2

A

2016-11-29

國家自然科學(xué)基金（No：81472953）；河北省自然科學(xué)基金（No：H2016209107）；華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項目（No：X2016315）

魏中秋，E-mail：wzq3725185@163.com

（童穎丹 編輯）