孫淑娟

（西安石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710065）

響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取純化大黃素的工藝研究

孫淑娟

（西安石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710065）

以植物掌葉大黃的根莖粗粉為原料，采用微波輔助方法提取掌葉大黃根莖中的大黃素，研究了不同料液比、輻射功率、輻射時間和輻射溫度對大黃素提取率的影響，通過響應(yīng)面法對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，該工藝的最佳條件為：料液比1∶8 g/mL，輻射功率400 W，輻射時間40 min，輻射溫度60℃，在此條件下，大黃素的平均提取率為0.598%，與預(yù)測值0.54%接近，這說明所建立的模型是切實可行的。

掌葉大黃；大黃素；微波輔助；響應(yīng)面法

掌葉大黃為蓼科植物，味苦，性寒，根及根莖可入藥，具有瀉熱通便，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)等功效。其有效成分為蒽醌衍生物，包括：大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚[1]。蒽醌類化合物大黃素可以防治肝功能損害，治療心血管疾病等，具有較高的藥理作用和保健價值[2]15958?？蒲腥藛T已對大黃素的含量測定方法、提取、提純工藝進(jìn)行了研究，如王蓉等人介紹了超聲-微波協(xié)同萃取何首烏中大黃素的最佳工藝條件，為后續(xù)的大黃素的提取提供參考[2]15959。杜永峰等人通過分光光度法測出了大黃中大黃素的含量[3]。微波輔助法提取具有反應(yīng)高效性、強(qiáng)選擇性等特點，且操作簡便、副產(chǎn)物少、節(jié)省溶劑、產(chǎn)率高、安全清潔，已廣泛用于天然產(chǎn)物的提取[4]。

本文采用微波輔助提取法，以有機(jī)溶劑無水乙醇為提取溶劑，從植物掌葉大黃根莖粗粉中提取大黃素，考察不同料液比、輻射功率、輻射時間和輻射溫度對大黃素提取率的影響，并建立響應(yīng)面實驗優(yōu)化工藝條件。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

材料：掌葉大黃的根莖，無水乙醇（分析純）。

儀器：FW117中草藥粉碎機(jī)，廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司；WF-2000微波快速反應(yīng)系統(tǒng)，上海屹堯分析儀器有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；GR-200電子天平，日本AND；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波輔助提取大黃素的工藝流程

掌葉大黃的根莖洗凈、烘干→粉碎過篩→準(zhǔn)確稱取→有機(jī)溶劑抽提→微波輔助提取→稀釋定容→測定吸光度→計算提取率。

1.2.2 大黃素的提取

稱掌葉大黃根莖洗凈后，溫度60℃下烘干，粉碎過80目篩，準(zhǔn)確稱取掌葉大黃根莖粉末10 g于錐形瓶中，加入10倍量的無水乙醇溶液，在輻射功率400 W，輻射時間40 min，輻射溫度60℃，料液比1∶8 g/mL的條件下微波輔助提取，提取完成后，得到棕黃色透明濾液，蒸發(fā)揮干乙醇得提取大黃素，測定吸光度，計算提取率。

1.2.3 大黃素的純化

精確稱取經(jīng)微波輔助提取得到的大黃素30 g于500 mL圓底燒瓶中，加12倍量的無水乙醇，置沸水浴中回流提取2 h，濾液靜置 3 h，抽濾，得沉淀，洗滌沉淀3次，合并洗滌后的沉淀。取所得沉淀的1/10，加15倍量的乙酸乙酯溶解，用量濃度為5 mol/L氫氧化鈉溶液萃取3次，將萃取液用量濃度為3 mol/L鹽酸調(diào)至酸性，得橙黃色沉淀，用冰乙酸重結(jié)晶，最終純化得大黃素產(chǎn)品。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取純化后的大黃素50 mg，溶解定容至500 mL容量瓶，加入一定量的無水乙醇溶解并定容至刻度線，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以備用。

用移液管吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，移到10 mL容量瓶中，加入量濃度為5 mol/L的NaOH溶液1.0 mL，搖勻，乙醇定容，搖勻，放置10 min，用空白做對照。用UV-2550型紫外可見分光光度計于波長200～550 nm范圍內(nèi)測定其吸光度，結(jié)果表明：大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長530 nm處達(dá)到最大吸光度，因而選用530 nm為測定波長。

另取50 mL容量瓶7個，分別加入已配制好的大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液， 依次加入 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 和 5.0 mL，加入1.0 mL量濃度為5 mol/L的NaOH溶液，用乙醇定容至50 mL，放置10 min，以空白溶液為參比，用紫外可見分光光度計在波長530 nm處測定其吸光度。以吸光度值A(chǔ)對質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，得到純化大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。其中，大黃素的線性回歸方程計算為y=0.007 5x+0.022 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，表明在測定范圍內(nèi)大黃素線性關(guān)系良好。

圖1 純化大黃素溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5 大黃素提取率的計算

式中：y為大黃素提取物的吸光度；Q為大黃素提取物的總稀釋倍數(shù)。

1.2.6 溶劑的選擇

大黃素屬于蒽醌衍生物，不易溶于水，但易溶于一些有機(jī)溶劑和堿性溶液，如無水乙醇、氫氧化鈉、乙酸、乙酸乙酯等溶劑，采用不同溶劑提取掌葉大黃根莖中的大黃素，結(jié)果如圖2所示。

吸光度越高，提取效果越好。由圖2可知，在所有實驗的溶劑中，無水乙醇提取物的吸光度最高為0.68，其次為乙酸乙酯提取物，吸光度為0.6，其他幾種均較低。因此本實驗選用無水乙醇為提取溶劑。

圖2 不同溶劑對大黃素的提取效果

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 單因素實驗

以大黃素的提取率為指標(biāo)，分別研究料液比、輻射功率、輻射時間以及輻射溫度對掌葉大黃根莖粉末提取率的影響，進(jìn)而確定單因素的最佳工藝條件。

1.3.2 響應(yīng)面實驗

以單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，選擇輻射功率、輻射時間、輻射溫度為相應(yīng)變量，以大黃素的提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行大黃素提純工藝優(yōu)化的響應(yīng)面實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對掌葉大黃根莖部大黃素提取率的影響

按照1.2.2的步驟進(jìn)行實驗。在輻射功率400 W，輻射時間40 min，輻射溫度60℃的條件下，分別設(shè)定料液比 1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12 和 1∶14 g/mL進(jìn)行實驗，測定吸光度值，計算提取率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對植物掌葉大黃中大黃素提取率的影響

從圖3可知，隨著溶劑含量的增加，植物掌葉大黃中大黃素的提取率是先增加后減小；當(dāng)料液比為1∶8 g/mL時，大黃素的提取率達(dá)到最大，隨著溶劑量的增加，植物掌葉大黃中大黃素的提取效率反而逐漸降低。這有可能是因為溶劑的量增多使得掌葉大黃中有其他物質(zhì)生成，阻礙了大黃素的溶解。綜合各個方面，選擇最佳的料液比為1∶8 g/mL。

2.1.2 輻射時間對掌葉大黃根莖部大黃素提取率的影響

按照1.2.2的步驟進(jìn)行實驗，在輻射功率400 W，輻射溫度60℃，料液比為1∶8 g/mL的條件下，分別設(shè)定輻射時間為 20、25、30、35、40 和 45 min 進(jìn)行實驗，測定其吸光度的值，并計算提取率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 輻射時間對植物掌葉大黃中大黃素提取率的影響

由圖4可知，隨著輻射時間的不斷增加，植物掌葉大黃中大黃素的提取率是先增大后減小，輻射時間為40 min時，對應(yīng)的吸光度最大，大黃素的提取率也最高，再延長輻射時間時，大黃素的提取率反而下降。這有可能是輻射時間過長，微波輻射會損壞大黃素的結(jié)構(gòu)，使得提取率降低，因此最佳的輻射時間為40 min。

2.1.3 輻射功率對掌葉大黃根莖部大黃素提取率的影響

按照1.2.2的步驟進(jìn)行實驗。在輻射時間40 min，輻射溫度60℃，料液比為1∶8 g/mL的條件下，分別設(shè)定輻射功率為 100、200、300、400、500 和 600 W進(jìn)行實驗，測定吸光度值，計算提取率。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著輻射功率逐漸增加，植物掌葉大黃中大黃素的提取率是先增大后減小，當(dāng)輻射功率為400 W時，大黃素的提取率最高，隨著輻射功率的再增加，提取率反而降低。由此看出，隨著輻射功率的增大，植物掌葉大黃中的大黃素會逐漸溶解在無水乙醇中，但功率過大可能會使一部分的大黃素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，故選擇400 W為提取大黃素的最佳輻射功率。

2.1.4 輻射溫度對掌葉大黃根莖部大黃素提取率的影響

按照1.2.2的步驟進(jìn)行實驗。在輻射時間40 min，輻射功率為400 W，料液比為1∶8 g/mL的條件下，分別設(shè)定輻射溫度為 30、40、50、60、70 和 80 ℃進(jìn)行實驗，測定吸光度值，計算提取率。結(jié)果如圖6所示。

圖5 輻射功率對植物掌葉大黃中大黃素提取率的影響

圖6 輻射溫度對植物掌葉大黃中大黃素提取率的影響

由圖6可知，大黃素的提取率隨溫度的升高先增大后減小，當(dāng)輻射溫度為60℃左右時，大黃素的提取率最大，再提高輻射溫度時提取率反而降低，因而，最佳的輻射溫度是60℃。

2.2 響應(yīng)面實驗

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立及其顯著性

以單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，選擇輻射功率、輻射時間、輻射溫度為相應(yīng)變量，以大黃素的提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實驗，實驗因素水平及編碼如表1所示，響應(yīng)面實驗設(shè)計及測定結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平及編碼表

采用Design-Expert.8.0.6.1軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值大黃素的提取率（Y）對因素自變量輻射功率（A）、輻射時間（B）和輻射溫度（C）的二次多項式回歸模型方程為：

在回歸模型方程中，正系數(shù)表明變量的正向變化將會引起響應(yīng)值的增加，負(fù)的二次項系數(shù)表明拋物線開口向下，該方程有極大值，可以進(jìn)行最優(yōu)分析。對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3（其中，**表示P＜0.01，達(dá)到差異極顯著水平）。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及測定結(jié)果

表3 回歸模型方程方差分析

由表3可知，該模型顯著（顯著水平P=0.0020＜0.05），而失擬項（P失擬=0.0892＞0.05）不顯著，殘差是由隨機(jī)誤差引起的，說明該模型相關(guān)度較高，模型擬合可靠。

回歸方程一次項回歸系數(shù)的絕對值大小關(guān)系為：C＞A＞B，則3個因素對大黃素提取率影響的大小依次為：輻射溫度＞輻射功率＞輻射時間。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

采用Design-Expert.8.0.6.1軟件對因素繪制響應(yīng)面三維圖，所擬合的響應(yīng)面形狀反映了輻射功率（A）、輻射時間（B）和輻射溫度（C）這 3個因素的兩兩交互作用對大黃素提取率的影響，響應(yīng)面三維圖和等高線如圖7、圖8和圖9所示。

由圖7可知，輻射功率（A）和輻射時間（B）2個因素的交互作用并不顯著。由響應(yīng)面可以看出，當(dāng)輻射功率不變時，隨著輻射時間的增加，大黃素提取率先升高后降低；而當(dāng)輻射時間不變時，隨著輻射功率的提高，大黃素的提取率先升高后降低。

圖7 輻射功率（A）和輻射時間（B）對大黃素提取率影響的響應(yīng)面圖

圖8 輻射時間（B）和輻射溫度（C）對大黃素提取率影響的響應(yīng)面圖

圖9 輻射功率（A）和輻射溫度（C）對大黃素提取率影響的響應(yīng)面圖

由圖8可知，輻射時間（B）和輻射溫度（C）2個因素交互作用并不顯著。由響應(yīng)面圖可以看出，當(dāng)輻射時間不變時，隨著輻射溫度的增大，大黃素提取率先升高后降低，而當(dāng)輻射溫度不變時，隨著輻射時間的增大，大黃素提取率先升高后降低。

由圖 9可知，輻射功率（A）和輻射溫度（C）2個因素交互作用并不顯著。由響應(yīng)面圖可以看出，當(dāng)輻射功率不變時，隨著輻射溫度的增加，大黃素提取率先升高后降低。而當(dāng)輻射溫度不變時，隨著輻射功率的增大，大黃素提取率先升高后降低。

綜上所述：3個因素A、B、C的兩兩交互作用均不顯著，這與回歸方程方差分析結(jié)果一致。由此可得大黃素提取的最佳條件為：輻射功率為409 W，輻射時間為44 min，輻射溫度為55℃，植物掌葉大黃中大黃素提取率的預(yù)測值為0.54%。

2.2.3 回歸模型的驗證

通過上述回歸模型，對最佳條件進(jìn)行修正，最終結(jié)果為：輻射功率400 W，輻射時間40 min，輻射溫度60℃。在該條件下進(jìn)行3次平行實驗，實際測得大黃素提取率平均值為0.598%，與理論值0.54%差異較小，故采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的植物掌葉大黃中大黃素提取條件準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

3 結(jié)論

響應(yīng)面實驗結(jié)果表明，影響大黃素提取率的主次因素依次為：輻射溫度＞輻射功率＞輻射時間；大黃素提取的最佳工藝條件為：料液比1∶8 g/mL，輻射功率400 W，輻射時間40 min，輻射溫度60℃。此條件下，大黃素的平均提取率為0.598%，與預(yù)測值0.54%接近，這說明響應(yīng)面法優(yōu)化的回歸模型是可行的，預(yù)測能力良好。

[1] 徐慶，覃永俊，蘇小建，等.掌葉大黃化學(xué)成分研究[J].中草藥，2009，40（4）：533-536.

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10.13752/j.issn.1007-2217.2017.04.005

2017-07-25