張娟娟 喬玲 朱恩東

（天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所 衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室 天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300070）

長鏈非編碼RNA AK043773在脂肪細胞分化中的作用

張娟娟 喬玲 朱恩東

（天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所 衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室 天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300070）

探索長鏈非編碼RNA（lncRNA）AK043773在脂肪細胞分化過程中的表達變化和調(diào)控作用。將小鼠前脂肪細胞成脂誘導，利用實時定量PCR技術(shù)檢測成脂分化調(diào)控基因KLF7及AK043773的表達，構(gòu)建AK043773過表達載體檢測其對成脂分化的影響。經(jīng)UCSC數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)AK043773位于KLF7基因4號外顯子的3'端下游，骨髓基質(zhì)細胞系ST2和前脂肪細胞系3T3-L1成脂誘導分化后，實時定量PCR檢測結(jié)果顯示AK043773及KLF7表達協(xié)同下調(diào)；構(gòu)建pCDNA3.1-AK043773過表達載體，轉(zhuǎn)染ST2細胞后能顯著提高AK043773的表達，進行脂肪細胞分化條件誘導，通過油紅O染色及OD520nm吸光值檢測可見AK043773過表達顯著抑制ST2細胞中脂滴產(chǎn)生。AK043773及KLF7在脂肪細胞分化過程中協(xié)同下調(diào)，上調(diào)AK043773的表達可顯著抑制脂肪細胞分化。

長鏈非編碼RNA；AK043773；脂肪細胞分化；KLF7

肥胖的發(fā)病率在我國日益上升，2013年針對我國大于20歲的成年人進行統(tǒng)計，肥胖發(fā)病率為8.8%，超重人群則達到55.7%［1］。肥胖的發(fā)生是脂肪異常堆積的結(jié)果，對脂肪細胞分化機制的深入研究有益于為肥胖的治療提供有效策略［2］。脂肪細胞的分化過程是多條信號通路以及大量轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同級聯(lián)調(diào)控的結(jié)果［3］。近期研究發(fā)現(xiàn)kruppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族（Kruppel-like factor，KLF）成員廣泛參與脂肪細胞分化［4］。在人前脂肪細胞和小鼠3T3-L1細胞中過表達KLF7可以顯著抑制脂滴產(chǎn)生，并顯著抑制脂肪細胞特異性基因PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的表達［5］。此外，有研究顯示長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）也參與脂肪細胞分化過程的調(diào)控［6］。lncRNA是一類片段長度大于200 bp的內(nèi)源性RNA分子，人類基因組中只有大約1%具有蛋白編碼潛能，然而在特定的發(fā)育節(jié)點卻有大約70%的基因組轉(zhuǎn)錄，其中多數(shù)轉(zhuǎn)錄本屬于lncRNA，它們通常由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，經(jīng)RNA剪接過程成熟，具有譜系特異性并行使多種生物學功能。例如，胞核lncRNA參與形成核糖核蛋白復合體從而修飾染色體結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄活性，胞漿lncRNA可以直接或通過吸附microRNA調(diào)控mRNA 的穩(wěn)定［7-9］。Sun等［10］通過比對原代棕色和白色脂肪細胞、前體脂肪細胞以及成熟脂肪細胞的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)脂肪細胞分化過程中，175個lncRNAs被特異調(diào)控，而且C/EBPα和PPARγ可以結(jié)合于大量lncRNA的啟動子區(qū)域，通過RNAi抑制其中10個lncRNAs可以顯著抑制脂滴形成。

本研究擬通過分析lncRNA AK043773的基因定位，鑒定其在脂肪細胞分化過程中的表達和功能，旨在為進一步探索lncRNA AK043773在脂肪細胞分化中的分子作用機制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠骨髓基質(zhì)細胞ST2、前脂肪細胞3T3-L1和質(zhì)粒pCDNA3.1（+）由本實驗室保存；SPF級雄性6周齡C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司；Trans5α感受態(tài)細胞、TransStart FastPfu DNA Polymerase和T4 DNA 連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BamH I和EcoRⅤ內(nèi)切酶購自美國Thermo Fisher；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技公司；Lipofectamine 2000 購 自 美 國 Invitrogen；α-MEM 和 DMEM/H 培養(yǎng)基購自美國Hyclone；胎牛血清FBS購自德國SeraPro；RNA提取試劑E.Z.N.A. Total RNA Kit購自美國Omega Bio-tek；Reverse Transcription Kit 購自美國 Thermo Fisher；SGExcel Fast SYBR Mixture kits及特異性引物購自生工生物工程有限公司；誘導試劑胰島素（Insulin）、地塞米松（Dex）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和油紅O購自美國Sigma；吲哚美辛（Indo）購自美國Cyagen Biosciences Inc。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與成脂分化誘導 小鼠骨髓基質(zhì)細胞ST2用含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基，前脂肪細胞3T3-L1用含10% FBS的DMEM/H培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞長至80%以上時傳代。將細胞接種于12孔板，細胞密度達90%以上時進行成脂分化誘導。成脂誘導分化利用經(jīng)典的激素雞尾酒法，誘導試劑包含0.05 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5 mg/L 胰島素、0.05 mmol/L吲哚美辛和0.05 μmol/L地塞米松。

1.2.2 pCDNA3.1- AK043773載體的構(gòu)建 設(shè)計合成擴增AK043773片段的特異性引物，以C57BL/6小鼠肝臟DNA為模板，經(jīng)FastPfu DNA聚合酶擴增獲得AK043773片段全長，將克隆片段與pCDNA3.1（+）載體分別進行BamH I和EcoRⅤ內(nèi)切酶雙酶切，膠回收PCR片段及載體大片段后用T4 DNA 連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞，提取單克隆后雙酶切鑒定，鑒定正確克隆送交Invitrogen測序，測序正確載體命名為pCDNA3.1-AK043773載體。載體引物上游：5'-GCG GAT CCG AGA GGG CTG GAC TTC AG-3'，下游5'-CCG GAT ATC CTT TTT TTA TAG AGC CTT GCA TTG G-3'。下劃線代表酶切位點，其中GGATCC為BamH I，GATATC為EcoRⅤ。

1.2.3 pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載體轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將ST2細胞接種于12孔板，轉(zhuǎn)染當天細胞融合度達70%-90%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染6 h后細胞換液，具體實驗步驟依說明書為準。轉(zhuǎn)染24 h后可進行成脂細胞分化誘導；轉(zhuǎn)染48 h后可檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 RT-qPCR檢測KLF7和lncRNA AK043773的表達水平 ST2和3T3-L1細胞誘導成脂分化3 d后收取細胞，pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載體轉(zhuǎn)染ST2細胞48 h后收取細胞，按照E.Z.N.A. Total RNA Kit說明書分別提取各組細胞總RNA，利用Reverse Transcription Kit將 0.5 μg總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的條件：25℃ 10 min；42℃ 60 min；70℃ 10 min。

逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板，qPCR檢測KLF7和lncRNA AK043773的表達。根據(jù)SGExcel Fast SYBR Mixture kits試劑盒說明書加入qPCR所需的2×Mix、cDNA和特異性引物反應。反應體系為20 μL，內(nèi)參為β-actin。反應條件為：95℃預變性2 min；95℃變性30 s、57℃退火15 s、72℃延伸15 s，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用溶解曲線法分析，以確定樣品擴增的特異性。采用2-ΔΔCt法計算目的基因?qū)嶒灲M與對照組的表達差異，Ct值指反應管中熒光信號達到一定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。所有實驗重復3次。KLF7 qPCR引物上游5'-ACT GAC AAA CAA ACA GAC CCA G-3'，下游 5'-GGT AGC GTT CCA ACT CAA GG-3'；lncRNA AK043773 qPCR引物上游5'-ACG CCA GGG ATG GCA TTA-3'，下游5'-GAG CCT TGC ATT GGT CAG T-3'；β-actin qPCR引物上游5'-AAG ACC TCT ATG CCA ACA CAG-3'，下游5'-GGA GGA GCA ATG ATC TTG ATC-3'。

1.2.5 油紅O染色及OD值檢測 pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載體轉(zhuǎn)染ST2細胞24 h后，進行成脂細胞分化誘導，待脂滴成熟后棄細胞培養(yǎng)基，1×PBS洗2次；4%多聚甲醛固定15 min后棄液，1×PBS洗1次；加入60%異丙醇，室溫放置1-2 min后棄液；加入60%油紅O染液，染色5 min，蒸餾水漂洗2次，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。拍照后棄水，將細胞培養(yǎng)板倒置晾干后，每孔加400 μL異丙醇萃取油紅O，常溫放置20 min，移至96孔板檢測吸光度，波長設(shè)置520 nm。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x-±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA AK043773的基因位點分析

經(jīng)UCSC數(shù)據(jù)庫（http://genome.ucsc.edu/）檢索，lncRNA AK043773基因全長2 720 bp，位于KLF7基因4號外顯子的下游（圖1）。

圖1 lncRNA AK043773的基因位點分析

2.2 lncRNA AK043773的蛋白編碼能力分析

為確定AK043773的編碼能力，經(jīng)蛋白編碼能力預測數(shù)據(jù)庫CPAT：Coding-Potential Assessment Tool（http://lilab.research.bcm.edu/cpat/index.php）分析，AK043773的蛋白編碼能力得分為0.13，作為對照，KLF7基因（NCBI序列參考編號為 NM_033563.2）的蛋白編碼能力得分為0.98。由此可見，AK043773編碼蛋白的潛能極低，屬于非編碼RNA（圖2）。

圖2 lncRNA AK043773的蛋白編碼能力分析

2.3 RT-qPCR檢測3T3-L1和ST2細胞成脂誘導后KLF7和lncRNA AK043773的表達

ST2和3T3-L1細胞通過經(jīng)典的激素雞尾酒法成脂誘導分化3 d后，與未成脂分化細胞分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行RT-qPCR檢測。結(jié)果（圖3）顯示，與未成脂分化的細胞相比，在成脂分化的3T3-L1和ST2細胞中，KLF7分別顯著下降至0.80和0.47，lncRNA AK043773分別顯著下降至0.74和0.49。

圖3 KLF7和lncRNA AK043773在3T3-L1和ST2細胞成脂前后的表達水平

2.4 成功構(gòu)建pCDNA3.1-AK043773表達載體

以雄性C57BL/6小鼠肝臟DNA為模板，通過PCR特異性擴增2 720 bp的AK043773基因全長，通過BamH I和EcoR Ⅴ雙酶切位點克隆至pCDNA3.1（+）載體，命名為pCDNA3.1- AK043773。測序結(jié)果正確，PCR特異性擴增片段與pCDNA3.1- AK043773載體雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果均顯示載體構(gòu)建成功，擴增片段及酶切結(jié)果見圖4。

2.5 RT-qPCR檢測pCDNA3.1-AK043773轉(zhuǎn)染ST2細胞后lncRNA AK043773的表達

圖4 AK043773基因PCR特異性擴增、pCDNA3.1-AK043773載體PCR特異性擴增及其雙酶切鑒定

pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載 體 分別轉(zhuǎn)染ST2細胞48 h后收取細胞，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行RT-qPCR檢測。結(jié)果（圖5）顯示，與pCDNA3.1載體轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染pCDNA-3.1-AK043773載體可以顯著提高ST2細胞中l(wèi)ncRNA AK043773的表達水平至13.06倍。

圖5 pCDNA3.1及pCDNA3.1-AK043773載體轉(zhuǎn)染ST2細胞后lncRNA AK043773的表達

2.6 lncRNA AK043773對脂肪細胞分化的影響

pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載體分別轉(zhuǎn)染ST2細胞后誘導成脂分化，待脂滴成熟后進行油紅O染色，pCDNA3.1- AK043773載體轉(zhuǎn)染組較pCDNA3.1載體轉(zhuǎn)染組細胞脂滴明顯減少；異丙醇萃取油紅O后經(jīng)OD520nm波長吸光值檢測，可見pCDNA3.1- AK043773載體轉(zhuǎn)染組較pCDNA3.1載體轉(zhuǎn)染組下降30%（圖6）。

3 討論

肥胖被定義為體脂超標，肥胖患病率的持續(xù)上升使得脂肪組織及脂肪細胞生成被廣泛關(guān)注［11］。脂肪組織是非?；钴S重要的內(nèi)分泌器官，對能量及代謝穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要［12］。脂肪細胞是脂肪組織的主要組成部分，脂肪細胞主要由成纖維樣前脂肪細胞分化發(fā)育而來，脂肪細胞的分化是多種轉(zhuǎn)錄因子級聯(lián)反應及各種調(diào)控因子調(diào)節(jié)的結(jié)果［13-15］。近期有研究顯示lncRNA廣泛參與生命活動的發(fā)育和分化進程［16-18］。2013年，Sun等［10］首次針對體外培養(yǎng)的小鼠的前白色、棕色脂肪細胞以及分化成熟的白色、棕色脂肪細胞，篩選得到polyA尾轉(zhuǎn)錄譜然后進行RNA測序，鑒定了175個差異表達的lncRNA，其中很多脂肪細胞富集的lncRNA啟動子區(qū)有PPARγ和C/EBPα的結(jié)合位點，用RNAi抑制這些lncRNA的表達可以有效抑制成脂。2014年，Cooper等［19］在小鼠3T3-L1細胞中發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1可以與SRp40通過調(diào)控PPARγ2的剪接影響成脂。2016年，Huang等［20］發(fā)現(xiàn)lncRNA H19可以通過組蛋白去乙?；傅谋碛^修飾抑制骨髓來源間充質(zhì)干細胞的成脂分化。這些研究結(jié)果提示lncRNA也參與了脂肪細胞的分化生成階段。

圖6 lncRNA AK043773對脂肪細胞分化的影響

在研究前期，對原代培養(yǎng)的小鼠骨髓基質(zhì)細胞進行脂肪細胞誘導分化，72 h后采用芯片技術(shù)獲得脂肪細胞分化前后的lncRNA及mRNA表達譜。發(fā)現(xiàn)在成脂分化的細胞中KLF7表達顯著下調(diào)，該結(jié)果與文獻報道一致［5］，而位于KLF7基因4號外顯子下游的lncRNA AK043773協(xié)同下調(diào)。經(jīng)蛋白編碼能力預測數(shù)據(jù)庫Coding Potential Calculator（http://cpc.cbi.pku.edu.cn/programs/run_cpc.jsp） 分 析，lncRNA AK043773不具備編碼蛋白的潛能。通過RT-qPCR驗證了芯片結(jié)果，從而提示lncRNA AK043773可能參與脂肪細胞分化的調(diào)控，而且其可能發(fā)揮負向調(diào)控的功能。通過構(gòu)建lncRNA AK043773的過表達載體并轉(zhuǎn)染ST2細胞，經(jīng)成脂誘導后證明了我們的猜想，即過表達lncRNA AK043773可以抑制脂肪細胞分化。

后續(xù)研究將驗證lncRNA AK043773的蛋白編碼潛能，通過5'和3'cDNA末端快速克?。≧ACE）實驗確定其全長，通過分離脂肪分化前后細胞的胞核和胞漿部分，采用RT-qPCR技術(shù)確定lncRNA AK043773的亞細胞定位，通過設(shè)計合成lncRNA AK043773的siRNA驗證其在脂肪細胞分化中的功能。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA AK043773位于KLF7基因的下游，后續(xù)研究還將探討其是否通過順式作用影響KLF7的表達發(fā)揮其抑制脂肪細胞分化的功能，從而進一步深入的研究lncRNA AK043773發(fā)揮調(diào)控功能的分子機制，為闡釋脂肪細胞分化進程的調(diào)控提供新理論。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA AK043773，其位于KLF7基因4號外顯子的下游，在成脂分化的ST2和3T3-L1細胞中表達下調(diào)，在ST2細胞中過表達lncRNA AK043773可以抑制脂肪細胞分化。

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Role of Long Non-coding RNA AK043773 in Adipocyte Differentiation

ZHANG Juan-juan QIAO Ling ZHU En-dong
（Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases，Metabolic Diseases Hospital & Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070）

This work is to investigate the expression changes and regulating role of long non-coding RNA（lncRNA）AK043773 in adipocyte differentiation. First，pre-adipocyte cells in mice were induced for adipogenesis. Then，the expressions of adipogenic differentiation regulating gene（KLF7）and AK043773 were measured by real-time quantitative PCR（RT-qPCR）. Next，the overexpression vector for AK043773 was constructed for detecting its effects on adipogenic differentiation. According to search in UCSC database，the locus of AK043773 was in the 3'-end downstream of KLF7’s exon 4. The expressions of KLF7 and AK043773 were down-regulated coordinately in adipogenesis-induced and differentiated bone marrow stromal cell line ST2 and pre-adipocyte cells 3T3-L1. Furthermore，the overexpression vector pCDNA3.1-AK043773 was constructed and transfected into ST2 cells，which significantly enhanced the expression of AK043773，but inhibited the adipogenesis in ST2 cells by oil red O staining and OD520nmabsorbance test after the induction of adipocyte differentiation. All of results indicate that AK043773 and KLF7 coordinately down-regulate in adipocyte differentiation，and increasing the expression of AK043773 remarkably suppresses the differentiation of adipocyte.

lncRNA；AK043773；adipocyte differentiation；KLF7

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0556

2017-07-04

國家自然科學基金項目（81501846），天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所科學基金（2014RC01）

張娟娟，碩士研究生，研究方向：脂肪與成骨細胞分化調(diào)控研究；E-mail：839973071@qq.com

朱恩東，助理研究員，研究方向：脂肪與成骨細胞分化調(diào)控研究；E-mail：ezhu@tmu.edu.cn

（責任編輯 朱琳峰）