胡晟源 劉姝， 王淑軍 焦豫良， 來蔣麗 顧張慧 房耀維，

（1. 淮海工學院海洋學院，連云港 222005；2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，連云港 222005）

一株產黑色素海洋真菌的分離、鑒定及色素性質的研究

胡晟源2劉姝1，2王淑軍1焦豫良1，2來蔣麗2顧張慧2房耀維1，2

（1. 淮海工學院海洋學院，連云港 222005；2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，連云港 222005）

從海州灣篩選產黑色素的真菌，確定其分類地位，并對其所產色素的性質進行研究。對海州灣海域采集的海水、海葵、海泥等樣品進行富集培養(yǎng)，篩選具有產色素能力的真菌。利用搖瓶發(fā)酵進行復篩，篩選得到產黑色素的菌株，對篩選得到的菌株進行鑒定，然后對其所產色素進行粗提，并對性質進行測定。通過篩選獲得一株產黑色素絲狀真菌菌株CXPF01，結合形態(tài)學觀察和ITS分子序列分析將CXPF01鑒定為Cladosporium cladosporioides。所產黑色素在220 nm處具有最大吸收值。光照對色素的穩(wěn)定性影響不顯著，高溫和酸堿對黑色素穩(wěn)定性具有顯著影響。該色素對Staphylococcus aureus和Escherichia coli具有抑制作用。該真菌所產黑色素對在光照條件下有較好的穩(wěn)定性并具有抑菌作用。

海洋真菌；色素；枝孢屬；性質研究

黑色素（Melanin）是廣泛存在于自然界中的一種色素，大量存在于動植物和微生物中［1］。黑色素結構上為非均質的多聚物，可因組成單元與聚合過程的不同而出現(xiàn)極大差異，是一類結構復雜的多酚類或吲哚類異源多聚芳香族化合物的總稱［2］。目前的研究證明，黑色素有許多重要的生物學方面的功能：一是可以提供機械力保護蛋白質不被降解；二是其形成過程具有進化上的保守性，特別是如巰基（·SH）和氨基（·NH2）親核性的基團，使其獲得抗生素特性。雖然黑色素對于生物的生長、發(fā)育并非不可或缺，但是卻能提高生物體生存和競爭的能力［3］。由于在生物體內能起到抗紫外輻射、清除自由基的作用，具有抗氧化［4］、防衰老等功能［5］，黑色素被廣泛應用于化妝品、染發(fā)劑中，還可以作為生物殺蟲劑的光保護劑［6］。另外，作為新型天然藥物載體，黑色素還可以用來治療某些與黑色素缺乏有關的神經系統(tǒng)疾?。?］。近年來發(fā)現(xiàn)一些可溶性黑色素在體外對艾滋病病毒有顯著的抑制作用，使天然黑色素可望成為一種新的抗艾滋病藥物［8］。

天然黑色素雖然廣泛存在于動植物及微生物中，但動植物受季節(jié)、氣候、產地、復雜工藝等因素的影響，提取的色素價格昂貴，大規(guī)模生產受到局限。只有微生物具有發(fā)酵周期短、成本低廉、易于工業(yè)化的特點，并且微生物所產黑色素是體內的酪氨酸酶催化酪氨酸形成L-多巴，然后繼續(xù)氧化形成，屬于氨基酸的衍生物，無毒無害［3］。因此，研究微生物發(fā)酵生產黑色素，并對其進行開發(fā)利用，具有很大的優(yōu)勢，并越來越得到廣泛的重視［9］。本研究從海洋樣品中篩選產黑色素真菌，對菌株進行鑒定，對其產黑色素的性質進行了初步研究，為今后該色素的開發(fā)奠定科學基礎和提供了理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品為海州灣海域采集的海水、海泥等（N34o43'28″，E119o29'73″）

1.1.2 試劑 微生物直接PCR裂解緩沖液（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）購自TAKARA公司，其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 海水PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、天然海水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌種的篩選和保存 梯度稀釋樣品并涂布于PDA培養(yǎng)基。在27℃培養(yǎng)72 h后挑取形態(tài)不同的菌落用劃線法分離純化，純化后的菌株接種至PDA斜面保存。挑選生長快、顏色深、色素擴散圈大的菌株進行進一步研究。

1.2.2 菌落觀察 點植法接種少量孢子于PDA培養(yǎng)基，平皿接種點呈三角形。將接種平皿在27℃培養(yǎng)7 d。逐日觀察記錄菌落形態(tài)、顏色及生長狀況。

1.2.3 菌株的形態(tài)學鑒定 待上述菌株培養(yǎng)7 d后，觀察成熟菌落大小、顏色、形態(tài)、邊緣等特征。再用插片法培養(yǎng)，觀察自然生長條件下菌絲形態(tài)，并在電子顯微鏡下觀察菌株的孢子梗及孢子特征，對其進行初步鑒定。

1.2.4 ITS序列擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析 利用微生物直接PCR裂解緩沖液（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）獲得菌株的總DNA。PCR擴增采用引物為真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'） 和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），由上海生物工程有限公司合成。PCR反應體系（50 μL）為 ：Premix Taq（Ex Taq version 2.0）25 μL，引物各1 μL，模板5 μL，加無菌雙蒸水補至50 μL。PCR反應條件為：94℃ 預變性10 min，94℃變性30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，重復30個循環(huán)，72℃溫育 10 min。PCR產物送上海生物工程有限公司測序。將測序的ITS序列在GenBank數(shù)據庫中進行同源性比對，并用Mega7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor joining method）進行聚類分析和系統(tǒng)進化樹構建，確定菌種生物學分類地位。

1.2.5 黑色素的發(fā)酵與提取 菌株接種于100 mL液體PDA發(fā)酵培養(yǎng)基，在27℃、180 r/min條件發(fā)酵培養(yǎng)7 d，13 400×g離心10 min，取上清液，加入與上清液等體積乙酸乙酯萃取，靜置過夜。使用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)萃取相至干粉狀，得到黑色素的粗提物。用10 mL乙醇溶解黑色素粗提物，將溶液轉移至藥劑瓶中，烘干至恒重。

1.2.6 色素的光譜性質 將黑色素粗提物溶解成0.1%濃度溶液，用UV-1800型紫外可見光光度計進行光譜掃描，以溶劑為參照，在200-700 nm波長范圍內掃描分析。

1.2.7 色素的穩(wěn)定性實驗

1.2.7.1 自然光對色素穩(wěn)定性的影響 將0.1%濃度色素分裝于8支透明試管中，對照樣品避光保存，其他樣品在室內光亮處放置7 d，每24 h取樣品測定OD220。

1.2.7.2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 將0.1%濃度的黑色素密閉分裝于試管中，分別置于4、20、40、60、80、100℃水浴。水浴2 h后分別測定其OD220值。1.2.7.3 pH對色素穩(wěn)定性的影響 將0.1%濃度黑色素分別加入pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的緩沖液中，得到終濃度相同的不同pH色素溶液，避光放置24 h后分別測試其OD220值。

1.2.7.4 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響 向0.1%濃度的黑色素溶液中分別加入濃度為0.01 mol/L和1 mol/L 的 Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Na+、K+、Al3+、Zn2+，振蕩均勻后避光保存24 h，測OD220值。

1.2.7.5 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響 向0.1%濃度的黑色素溶液中分別加入10 g/L的苯甲酸鈉、檸檬酸和山梨酸鉀，振蕩混勻后避光保存24 h，測OD220值。

1.2.8 色素的抑菌性 取濾紙片，分別加10 μL和20 μL的0.1%濃度的黑色素粗提物。分別將濾紙片三點放置于生長了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養(yǎng)皿中。倒置培養(yǎng)，2 d后觀察，通過抑菌圈的大小判斷其抑菌性。

2 結果

2.1 產色素菌株篩選結果

在初篩獲得的21株產色素菌株中，菌株CXPF01和CXPF05產生的色素分別使發(fā)酵液變?yōu)楹谏蜕钭厣?。CXPF01產生色素速度較快，2-3 d 即可使發(fā)酵液完全變色，采用CXPF01進行下一步研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的培養(yǎng)性狀及形態(tài)學鑒定 CXPF01在PDA培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)3 d后，菌株菌落呈圓形，直徑約30 mm。菌落中心有突起，墨綠色，菌絲絨毛狀，較致密。菌落底部黑色，無色素擴散圈，推斷菌株產生黑色素。邊緣菌絲呈白色絨毛狀，菌落周圍無分泌物產生（圖1）。在電子顯微鏡下觀察，可以清晰觀察到該菌的孢子梗和孢子。孢子梗表面光滑，寬度約20 μm，梗間有間隔（圖2）；孢子呈球狀，多個孢子成簇存在，孢子直徑約2 μm（圖3）。2.2.2 ITS序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 對CXPF01菌株的ITS序列擴增獲得538 bp的序列。將序列在GenBank中進行BLAST比對，選取10株相關菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA 7軟件中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），可以看出，CXPF01菌株與Cladosporium cladosporioides CAF032（KU821454.1）相聚于同一支，其置信度達到93%。

結合菌落培養(yǎng)特征、生理生化特征和基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，可將CXPF01菌株的分類地位確定至屬的水平，即CXPF01菌株屬于枝孢菌屬（Cladosporium）。

圖1 CXPF01的菌落形態(tài)

圖2 孢子梗電鏡照片

圖3孢子電鏡照片

2.3 色素的光譜特性

取0.1%濃度黑色素溶液用UV-1800型紫外可見光光度計進行光譜掃描，以溶劑為參照，在200-700 nm波長范圍內掃描分析。根據光譜圖可知，色素在220 nm處有最大吸收峰，在可見光區(qū)內沒有特征吸收峰，吸收值隨波長增大而減?。▓D5）。

2.4 色素穩(wěn)定性驗證結果

2.4.1 自然光對色素穩(wěn)定性的影響 從圖6可以看出，自然光對色素穩(wěn)定性影響結果表明，在自然光照條件下，黑色素的吸光度呈下降趨勢，且第1天降幅最大，第7天色素吸光值僅為第1天的22.3%。結果表明色素對光照較為敏感。

2.4.2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 如圖7所示，隨著溫度的升高，黑色素的OD220值下降。在4-20℃的范圍內，黑色素的吸光值變化較小，溫度對色素的穩(wěn)定性影響較小。當溫度大于20℃時，色素OD220值急速下降，色素穩(wěn)定性受到影響大。當溫度高于80℃時，色素揮發(fā)，無數(shù)據。結果表明該色素對溫度敏感，在0-30℃范圍內具有較好穩(wěn)定性。

圖4 基于ITS序列構建的菌株CXPF01的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 黑色素紫外-可見吸收光譜掃描圖

圖6 自然光對色素穩(wěn)定性的影響

圖7 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

2.4.3 pH對色素穩(wěn)定性的影響 圖8可以看出，pH7-8時，色素保持穩(wěn)定，吸光值幾乎無變化。當pH小于7或大于8時，色素吸光度急劇下降，穩(wěn)定性下降，在pH為11時吸光度達到最小。說明色素在酸性或堿性條件中不穩(wěn)定，在中性條件下較穩(wěn)定。

2.4.4 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響 從圖9中可以看出，黑色素溶液中添加0.01 mol/L濃度的金屬離子后，加入Fe3+的黑色素溶液的吸光度幾乎無變化；加入K+后溶液吸光度降低；加入Cu2+、Mg2+和Na+的黑色素溶液吸光度顯著降低。添加濃度1 mol/L的金屬離子后，加入Fe3+的黑色素溶液吸光度無變化，K+、Cu2+、Mg2+和Na+的黑色素溶液吸光度均減少，Na+和Mg2+離子的溶液吸光度減少最多。結果說明本黑色素對Fe3+穩(wěn)定，對K+較為穩(wěn)定，對Cu2+、Mg2+和Na+不穩(wěn)定。

圖8 pH值對色素穩(wěn)定性的影響

圖9 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

2.4.5 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響 由圖10可以看出，僅山梨酸鉀使色素的OD220顯著變高，說明山梨酸鉀對CXPF01菌株產的黑色素具有增色或者護色作用。檸檬酸和苯甲酸鈉使色素吸光度略微下降，說明色素對苯甲酸鈉和檸檬酸鈉較為穩(wěn)定。

圖10 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響

2.5 色素的抑菌性

0.1 %濃度黑色素溶液在Staphylococcus aureus和Escherichia coli培養(yǎng)皿中都有抑菌圈產生，且色素添加量20 μL產生的抑菌圈大于10 μL（表1）。

表1 菌株CXPF01產黑色素的抑菌性

3 討論

微生物產黑色素相較于動植物產的黑色素具有發(fā)酵周期短、成本低廉、易于工業(yè)化的特點，并且微生物所產黑色素是體內的酪氨酸酶催化酪氨酸形成L-多巴，然后繼續(xù)氧化形成，屬于氨基酸的衍生物，無毒無害。因此，研究微生物發(fā)酵生產黑色素，并對其進行開發(fā)利用，具有很大應用前景。目前所發(fā)現(xiàn)的具有產黑色素能力的微生物以細菌為主，主要有堅強芽孢桿菌、放線菌、鏈霉菌、微球菌等［7，10-11］，產黑色素的真菌鮮有報道。CXPF01產黑色素在200-700 nm波長范圍內掃描分析。根據光譜圖可知，色素在220 nm處有最大吸收峰，在可見光區(qū)內沒有特征吸收峰，吸收值隨波長增大而減小。這與Sigma公司所提供的標準黑色素的光譜圖不同，與徐靜等［12］研究中發(fā)現(xiàn)放線菌所產黑色素的光譜掃描圖譜顯著不同，但與葉明等［13］研究的暗盤菌YM421所產黑色素類似，與戴德慧等［14］研究的絲狀真菌D447所產黑色素相似度最高，且在相近波長具有吸收峰，但CXPF01所產黑色素在可見光區(qū)內吸收幾乎為零，推測這種差異是因為真菌產黑色素在結構上有異于細菌產黑色素，下一步將借助其它分析測試手段對菌株CXPF01產的黑色素結構進行進一步的研究和比較。

光照穩(wěn)定性實驗結果表明該黑色素在自然光照條件下穩(wěn)定性一般。絲狀真菌D447產黑色素與鏈霉菌G-HD-4產黑色素相比，對光照較為敏感，但其光照穩(wěn)定性仍強于本色素［11，14］。CXPF01黑色素對pH較為敏感，在pH為7.0-8.0時最穩(wěn)定，這與其他菌種所產黑色素有顯著不同，一般微生物色素在堿性環(huán)境較為穩(wěn)定，如絲狀真菌D447所產黑色素僅在pH12有最好的穩(wěn)定性［14］。

根據金屬離子對黑色素穩(wěn)定性實驗的結果，CXPF01黑色素對大部分陽離子不穩(wěn)定，加入微量的Cu2+、Mg2+和Na+離子后，黑色素的吸光度也會迅速減少。黑色素對金屬離子不穩(wěn)定可能是因為微生物產黑色素作為一類由酪氨酸氧化轉化而來的生物多聚物，其結構中具有帶負電的羧基和去質子化的羥基，對陽離子有明顯的結合作用［3］。

4 結論

從海州灣的海水、海泥樣品中篩選到產黑色素菌株CXPF01，結合形態(tài)學和ITS序列分析將其初步鑒定為Cladosporim cladosporioides。該菌株所產黑色素在220 nm處有最大吸收峰，在0-30℃、pH7.0-8.0時具有良好穩(wěn)定性，對Staphylococcus aureus和Escherichia coli有抑菌效果。該色素對常見食品添加劑苯甲酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀不敏感。性質表明本色素有應用于食品產業(yè)的潛力。

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Isolation and Identification of a Melanin-producing Marine Fungi and Characterization of the Pigment

HU Sheng-yuan2LIU Shu1，2WANG Shu-jun1JIAO Yu-liang1，2LAI Jiang-li2GU Zhang-hui2FANG Yao-wei1，2
（1. Jiangsu Marine Resources Development Research Institute，Lianyungang 222005 ；2. College of Fisheries and Marine Life，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005）

Our aims are to isolate melanin-producing fungi from Haizhou Bay，to clarify the taxonomic status，and to study the properties of the melanin. The pigments-producing fungi were isolated from the collected samples of sea water，sea anemone，and sea mud from Haizhou Bay with the method of enrichment culture. The melanin-producing fungi were re-screened by shake flask fermentation. Then the melanin-producing fungi were identified and the properties of the crudly extracted melanin were measured. The strain CXPF01 was obtained and identified as Cladosporium cladosporioides by its morphological and ITS sequence homology. The pigment had maximum absorption value at 220 nm. There was non-significant effect of light on the pigment while high temperature and alkalinity or acidity had a remarkable impact on it. The pigment presented inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Conclusively，the melanin-producing fungus CXPF01 was obtained，from which the melanin was stable in light and it had antibacterial activity.

marine fungi；pigment；Cladosporium；property study.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0437

2017-05-26

江蘇省自然科學基金面上項目（BK20151282），江蘇省“六大人才高峰”高層次人才項目（SWYY-195），江蘇省高校“青藍工程”，第48批留學歸國人員科研啟動資金，江蘇省普通高校研究生創(chuàng)新項目（XKYCXX2016-2）

胡晟源，男，碩士研究生，研究方向：海洋微生物；E-mail：18651252179@163.com

房耀維，男，副教授，研究方向：海洋微生物及生物技術；E-mail：fangyw@hhit.edu.cn

（責任編輯 朱琳峰）