徐鳳華，宋 琪，邢晉祎，孫煒涵

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005)

肉雞MSMO1基因的克隆及表達(dá)模式分析

徐鳳華，宋 琪，邢晉祎*，孫煒涵

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005)

【目的】克隆肉雞MSMO1(Methylsterol monooxygenase 1)基因序列，并分析其表達(dá)模式，為研究MSMO1基因的功能奠定基礎(chǔ)。 【方法】利用RT-PCR技術(shù)克隆肉雞MSMO1基因，采用生物信息學(xué)方法分析其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并用定量PCR技術(shù)檢測(cè)MSMO1基因在組織間的表達(dá)差異?！窘Y(jié)果】肉雞MSMO1基因的cDNA序列長(zhǎng)度為1404 bp，編碼296個(gè)氨基酸；MSMO1蛋白145～274 位氨基酸序列殘基存在FA-hydroxylase結(jié)構(gòu)域，為親水蛋白。進(jìn)化樹(shù)分析表明，肉雞MSMO1氨基酸序列與日本鵪鶉和鸚鵡的MSMO1分子親緣關(guān)系較近；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋(41.89 %)為主。組織表達(dá)水平結(jié)果顯示，在8種組織中均檢測(cè)到MSMO1基因的表達(dá)，且在肝臟中的表達(dá)水平極顯著高于其它7種組織中的表達(dá)水平(P<0.01)，在脾臟和胸肌中的表達(dá)水平極顯著低于在肺臟和肝臟中的表達(dá)水平(P<0.01)?！窘Y(jié)論】本結(jié)果將為進(jìn)一步研究MSMO1基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

肉雞；MSMO1基因；克??；表達(dá)模式

【研究意義】甲基固醇單加氧酶1(Methylsterol monooxygenase 1，MSMO1)，又名固醇-C4-甲基氧化酶樣基因(sterol-C4-methyloxidase-like，SC4MOL)，MSMO1基因突變能引起銀屑病樣尿布皮炎、關(guān)節(jié)痛、先天性白內(nèi)障和發(fā)育遲緩等病人的常染色體隱性綜合癥，該基因編碼固醇-C4-甲基氧化酶蛋白(sterol-C4-methyl oxidase)，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，在膽固醇生物合成途徑中催化C4-甲基固醇去甲基化[1-3]。因此，MSMO1基因通過(guò)調(diào)節(jié)人體能量代謝、肥胖和血脂異常，從而在脂類的生物合成中起著關(guān)鍵作用[4-6]，而且對(duì)細(xì)胞的增殖和免疫調(diào)節(jié)起著調(diào)控作用[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，人MSMO1基因被定位在4q32-q34[7]，對(duì)MSMO1基因的研究主要集中在人類膽固醇合成和脂肪代謝方面，在畜禽方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，盡管在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上已有原雞的MSMO1基因序列，但肉雞作為易于積累脂肪的動(dòng)物，其MSMO1基因功能和結(jié)構(gòu)尚不明了。【本研究切入點(diǎn)】本研究以肉雞為研究對(duì)象，克隆MSMOS1基因序列，分析MSMOS1基因序列特征及表達(dá)譜?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究肉雞MSMO1基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

表1 PCR引物序列和參數(shù)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

隨機(jī)挑選外形體貌和體重相近的42日齡肉雞5只。屠宰前使其空腹12 h，自由飲水。屠宰后采集胸肌、腿肌、腎臟、心臟、脾臟、肺臟、腹脂和肝臟，切割成0.5～1.0 g小塊，液氮速凍，-80 ℃保存，用于后續(xù)提取RNA。

1.2 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、凝膠成像系統(tǒng)、微量移液器(Eppendorf)、定量PCR儀(Roche)、高低溫振蕩培養(yǎng)箱、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、超低溫冰箱、超純水機(jī)等。

1.3 主要試劑

Trizol Reagent和RNase Inhibitor(Invitrogen公司)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)、pMD19-T vector、LATaq聚合酶、EcoRⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、SYBR?Premix ExTaqTMII(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

利用Trizol提取總RNA，并檢測(cè)RNA的質(zhì)量。用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。

1.5 雞MSMO1基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序

依據(jù)GeneBank上公布的原雞MSMO1(NM_001006438)基因序列，用軟件Primer premier 6.0設(shè)計(jì)引物MSMO1-f和MSMO1-r(表1)。以cDNA為模板，按照如下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×PCR反應(yīng)緩沖液(Mg2+plus)2.5 μl、模版cDNA 1.0 μl(約50～100 ng)、4種dNTP 混合物(每種2.5 mmol/L) 2.0 μl、上下游引物 (20 μmol/μl) 各0.5 μl、LATaq聚合酶0.2 μl (1 unit)、滅菌水加至25 μl，混合后稍離心。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s；55 ℃ 退火 30 s；72 ℃延伸 50 s；72 ℃延伸5 min。

把PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。將pMD19-T vector與回收的PCR產(chǎn)物相連接，4 ℃放置過(guò)夜。制備感受態(tài)細(xì)胞，然后挑取平板上白斑單菌落，放置于含有3 mL LB培養(yǎng)液，3 μl Amp(質(zhì)量濃度為100 μg/mL)的試管中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒。用Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 MSMO1基因的生物信息學(xué)分析

將測(cè)序獲得的序列用 NCBI的ORF Finder程序分析MSMO1基因的開(kāi)放閱讀框，預(yù)測(cè)氨基酸序列，用DNAMAN軟件比較與其它動(dòng)物MSMO1的氨基酸序列一致性；采用Blast程序分析其蛋白保守結(jié)構(gòu)域；用軟件MEGA 7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。利用ExPASy服務(wù)器上SOSUI程序進(jìn)行疏水性分析，用SOPMA程序和SWISS-MODEL工具預(yù)測(cè)雞MSMO1蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.7 MSMO1基因mRNA在不同組織中的表達(dá)模式

以胸肌、腿肌、腎臟、心臟、脾臟、肺臟、腹脂和肝臟組織的cDNA為模板，以Ex-f和Ex-r為引物(表1)，β-actin(GenBank: NM_205518)作內(nèi)參，SYBR GreenⅠ為染料，利用real time PCR(qPCR)進(jìn)行基因表達(dá)模式研究。qPCR反應(yīng)體系： cDNA(稀釋10倍)1 μl，SYBR?Premix ExTaqTMII 10 μl，上下游引物各0.2 μl, 40個(gè)循環(huán)；3個(gè)樣本重復(fù)。用公式2-△△ct計(jì)算MSMO1基因的相對(duì)表達(dá)量。采用dps7.05軟件對(duì)MSMO1基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行多重比較統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

表2 不同動(dòng)物MSMO1基因序列比較

2.1 MSMO1基因克隆和序列分析

利用肉雞肝臟cDNA為模板，以引物MSMO1-f和MSMO1-r擴(kuò)增出1條特異帶，經(jīng)測(cè)序和結(jié)果分析表明，所擴(kuò)增的肉雞MSMO1基因序列長(zhǎng)度為1 404 bp(圖1)，開(kāi)放閱讀框?yàn)?91 bp， 編碼296個(gè)氨基酸?？寺〉男蛄信cGenBank上登錄的序列一致性為99.57 %，僅有6 bp差異，氨基酸一致性為100 %，說(shuō)明所克隆的序列為肉雞的MSMO1基因序列。所克隆的肉雞MSMO1基因核苷酸和氨基酸序列與其它物種比較，與日本鵪鶉和鴻雁的一致性較高，與大鼠和斑馬魚(yú)的一致性較低(表2)。由此推測(cè)，MSMO1蛋白在同類物種之間保守性較高。利用軟件MEGA7.0構(gòu)建雞MSMO1氨基酸序列與其它物種的遺傳進(jìn)化樹(shù)。從圖2可見(jiàn)，雞與鸚鵡和日本鵪鶉的MSMO1遺傳關(guān)系比較近。

M：DL2000 DNA marker；1～4泳道：MSMO1基因擴(kuò)增產(chǎn)物M: DL2000 DNA marker; 1-4 lane: PCR amplification products of MSMO1, respectively圖1 雞MSMO1基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of broiler MSMO1

2.2 MSMO1蛋白保守域和結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 雞MSMO1保守域分析 用Blast程序分析MSMOS1蛋白保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明，肉雞MSMO1的145～274 位氨基酸序列殘基存在FA-hydroxylase結(jié)構(gòu)域(圖3)。

0.02代表遺傳距離，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的數(shù)字表示1000次重復(fù)后的靴帶百分比0.02 represents genetic distance, and the number at each node indicates the percentage of bootstrapping after 1000 replications圖2 雞MSMO1氨基酸與其它動(dòng)物氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of MSMO1 with other animals was constructed by neighbor-joining (NJ) method using MEGA 7.0

圖3 MSMO1蛋白包含保守的FA-hydroxylase結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved FA-hydroxylase domain of the broiler MSMO1 protein

2.2.2 MSMO1蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析 利用Protparam在線程序預(yù)測(cè)MSMO1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為35 485.16 u，等電點(diǎn)(pI)為6.75，消光系數(shù)為90 675，脂肪指數(shù)為85.98，不穩(wěn)定指數(shù)為38.69，屬于不穩(wěn)定蛋白。帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)( Arg+Lys)為24個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基數(shù)( Asp+Glu) 為26個(gè)，因此該蛋白質(zhì)可能帶負(fù)電荷。平均親水系數(shù)為-0.024， 該蛋白為親水蛋白。采用PSORTII在線軟件分析MSMO1蛋白的細(xì)胞器定位，其分布概率分別為：高爾基體4.3 %，細(xì)胞核4.3 %，細(xì)胞質(zhì)17.4 %，線粒體34.8 %，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)39.1 %。利用SignalP 4.1服務(wù)器沒(méi)有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。用SOPMA程序預(yù)測(cè)雞MSMO1二級(jí)結(jié)構(gòu)為：α-螺旋占41.89 %，延伸鏈占21.96 %，β-轉(zhuǎn)角占6.76 %，無(wú)規(guī)卷曲占29.39 %，因此MSMO1蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成。利用SWISS-MODEL工具對(duì)MSMO1蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，三級(jí)結(jié)構(gòu)圖以4zr0.1.A為模板，序列一致性為20.90 %(圖4)。

2.3 MSMO1基因組織表達(dá)模式分析

利用qPCR方法對(duì)MSMO1基因在肉雞脂肪、腎臟、肺臟、脾臟、胸肌、腿肌、心臟和肝臟組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述8種組織中均檢測(cè)到MSMO1基因mRNA的表達(dá)，且在肝臟中的表達(dá)水平極顯著高于其它7種組織中的表達(dá)水平(P<0.01)，在脾臟和胸肌中的表達(dá)水平極顯著低于在肺臟和肝臟中的表達(dá)水平(P<0.01，圖5)。

3 小 結(jié)

通過(guò)RT-PCR方法[8]克隆得到了肉雞MSMO1基因的部分序列，長(zhǎng)度為1404 bp，編碼296個(gè)氨基酸，并對(duì)其基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了比較和分析；檢測(cè)了該基因在脂肪、腎臟、肺臟、脾臟、胸肌、腿肌、心臟和肝臟組織中的表達(dá)模式。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究MSMO1基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，將豐富雞基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。

圖4 MSMO1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Three-dimensional model prediction of broiler MSMO1 protein

4 討 論

目前，對(duì)MSMO1基因的功能和結(jié)構(gòu)的研究才剛剛開(kāi)始。研究發(fā)現(xiàn)人類MSMO1基因有2種可變剪接，與轉(zhuǎn)錄變異體1相比，轉(zhuǎn)錄變異體2缺乏外顯子2，在人類組織中轉(zhuǎn)錄變異體1是主要的RNA同種型[9]，而在小鼠中預(yù)測(cè)到3種可變剪接(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=mouse+MSMO1)，其功能還不清楚。雞是否存在可變剪接還不是太明了，尚需進(jìn)一步研究。以前報(bào)道，MSMO1基因的rs17585739位點(diǎn)與高密度脂蛋白膽固醇相關(guān)[5]。最近，從人類MSMO1基因序列鑒定出519T→A和731A→G突變，這些突變導(dǎo)致氨基酸H173Q和Y244C的變化，這種變異在人群中是非常罕見(jiàn)的[1, 9]。也有報(bào)道，MSMO1基因內(nèi)的變異與空腹胰島素和胰島素抵抗人群相關(guān)[6]。

MSMO1基因在人類組織中廣泛表達(dá)，主要高表達(dá)于肝臟、大腦、腎上腺、淋巴母細(xì)胞、皮膚、睪丸和微管組織，在培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和正常的白細(xì)胞也檢測(cè)到了MSMO1基因的表達(dá)[8]。本研究表明，在所研究的肉雞8種組織中均檢測(cè)到MSMO1基因的表達(dá)，且在肝臟中的表達(dá)水平最高，與上述人類組織的表達(dá)水平一致。最近，臨床研究表明，MSMO1基因在肝結(jié)石病人肝臟中表達(dá)水平明顯增高[10]。在人Huh7肝腫瘤細(xì)胞的研究也顯示，miR-223過(guò)表達(dá)能顯著減少M(fèi)SMO1基因的表達(dá)，而抑制miR-223表達(dá)卻對(duì)MSMO1基因mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有改變[11]。另外，在人體腫瘤細(xì)胞中，脂類代謝的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子PPARα和SREBP信號(hào)對(duì)話中能調(diào)節(jié)MSMO1基因的表達(dá)[12]。

圖中數(shù)據(jù)表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=5)，柱狀圖上不同大寫字母表示差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)Data are expressed as means ±std error (n=5), and the uppercase superscripts on the column show statistical difference among different tissues at 0.01 level圖5 雞MSMOS1基因的表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of broiler MSMO1 gene

綜上所述，對(duì)MSMO1基因的研究才剛剛起步，且主要集中在MSMO1基因缺陷對(duì)人類疾病的研究方面，尚未見(jiàn)對(duì)畜禽類MSMO1基因的研究報(bào)道。因此，本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究該基因在禽類方面的功能奠定基礎(chǔ)。

[1]He M, Kratz L E, Michel J J, et al. Mutations in the human SC4MOL gene encoding a methyl sterol oxidase cause psoriasiform dermatitis, microcephaly, and developmental delay[J]. The Journal of Clinical Investigation, 2011, 121(3): 976-984.

[2]Vanparys C, Hectors T L, Blust R, et al. Mechanistic profiling of the cAMP-dependent steroidogenic pathway in the H295R endocrine disrupter screening system: new endpoints for toxicity testing[J]. Toxicology Letters, 2012, 208(2): 174-184.

[3]Cagnone G, Sirard M A. The impact of exposure to serum lipids during in vitro culture on the transcriptome of bovine blastocysts[J]. Theriogenology, 2014, 81(5): 712-722.

[4]Homo-Delarche F, Calderari S, Irminger J C, et al. Islet inflammation and fibrosis in a spontaneous model of type 2 diabetes, the GK rat[J].Diabetes,2006,55: 1625-1633.

[5]Lu Y, Dolle M E, Imholz S, et al. Multiple genetic variants along candidate pathways influence plasma high-density lipoprotein cholesterol concentrations[J].Journal of Lipid Research, 2008, 49: 2582-2589.

[6]Chen G, Bentley A, Adeyemo A, et al. Genome-wide association study identifies novel loci association with fasting insulin and insulin resistance in African Americans[J]. Human Molecular Genetics, 2012, 21(20): 4530-4536.

[7]Li L, Kaplan J. Characterization of yeast methyl sterol oxidase (ERG25) and identification of a human homologue[J].The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271: 16927 -16933.

[8]翁 梁.野桑蠶核糖體蛋白L21基因的克隆及序列分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,47(2):290-295.

[9]He M, Smith L D, Chang R, et al. The role of sterol-C4-methyl oxidase in epidermal biology[J].Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1841(3): 331-335.

[10]K?kel? P, M?nnist? V, Ilves I, et al. Serum Plant Sterols Associate with Gallstone Disease Independent of Weight Loss and Non-Alcoholic Fatty Liver Disease[J]. Obesity Surgery, 2017, 27(5): 1284-1291.

[11]Vickers K C, Landstreet S R, Levin M G, et al. MicroRNA-223 coordinates cholesterol homeostasis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(40): 14518-14523.

[12]van der Meer D L, Degenhardt T, V?is?nen S,et al. Profiling of promoter occupancy by PPARalpha in human hepatoma cells via ChIP-chip analysis[J].Nucleic Acids Research, 2010, 38(9): 2839-2850.

MolecularCloningandExpressionPatternsAnalysisofBroilerMSMO1Gene

XU Feng-hua, SONG Qi, XING Jin-yi*, SUN wei-han

(School of Life Science, Linyi University, Shandong Linyi 276000, China)

【Objective】The aims of this study are to clone broilerMSMO1 (methylsterol monooxygenase 1) gene sequences and analyze its expression patterns, which will provide a basis for further investigationMSMO1 gene function. 【Method】The broilerMSMO1 gene was cloned by RT-PCR, and the protein structure of broiler MSMO1 was predicted by bioinformatics methods, and expression patterns ofMSMO1 were assayed by real-time PCR (qPCR). 【Result】The broilerMSMO1 cDNA was 1404 bp in length, encoding 296 amino acids; MSMO1 protein of 145-274 amino acid residues sequence contained FA-hydroxylase domain, which was hydrophilicity protein. The phylogenetic tree analysis indicated that the broiler MSMO1 was closely related to the Japanese quail and parrot. The secondary structure of MSMO1 protein mainly contained alpha helix (41.89 %). TheMSMO1 mRNA were detected in all 8 tissues by using qPCR were detected, and the expression patterns in the liver were significantly higher than that in the other 7 tissues (P<0.01), and the expression levels in the spleen and breast muscle were significantly lower than that in the lung and liver (P<0.01). 【Conclusion】These results would provide the basis for the further research ofMSMO1 gene structure and function.

Broiler;MSMO1 gene; Cloning; Expression patterns

1001-4829(2017)12-2824-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.035

2017-01-20

山東省自然科學(xué)基金(ZR2017LC018, ZR2013CL01 2)；臨沂大學(xué)校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201710452032)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31372333)

徐鳳華(1992-)，女，山東日照人，E-mail: 1697891180@qq.com， Tel: 17854278086； *為通訊作者：邢晉祎，E-mail: xingjinyi@lyu.edu.cn。

S831.2

A

(責(zé)任編輯陳 虹)