曹 冶，趙素君，謝 晶，王秋實(shí)，廖黨金

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

金堂黑山羊FSH信號(hào)調(diào)節(jié)對(duì)下丘腦基因表達(dá)譜的影響

曹 冶1,2，趙素君1,2，謝 晶1, 2，王秋實(shí)1,2，廖黨金1,2

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

【目的】本研究旨在搞清楚金堂黑山羊FSH信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制的作用模式。【方法】將10只生殖周期相同的健康空懷的金堂黑山羊成年母羊隨機(jī)分成2組，一組為對(duì)照組，一組為試驗(yàn)組。在發(fā)情后的第2天對(duì)試驗(yàn)組金堂黑山羊進(jìn)行FSH肌肉注射100IU，并在注射24 h后，摘取金堂黑山羊的下丘腦；對(duì)照組發(fā)情后的第3天摘取下丘腦，分別提取他們的總RNA，進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序?！窘Y(jié)果】經(jīng)測(cè)序分析：對(duì)照組和試驗(yàn)組分別得到有效序列26004442和25041098條;經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，得到歸一化序列25338808和24413890條，與山羊基因組的符合率分別達(dá)85.31 %和85.32 %。比對(duì)后發(fā)現(xiàn)152個(gè)基因出現(xiàn)顯著性差異表達(dá)，其中117個(gè)基因上調(diào)了表達(dá)，35個(gè)基因下調(diào)了表達(dá)。GO功能分類發(fā)現(xiàn)1個(gè)生物學(xué)過程出現(xiàn)了顯著性差異。KEGG功能分類沒發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)途徑發(fā)生了顯著性改變。結(jié)果顯示FSH信號(hào)通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式對(duì)下丘腦進(jìn)行調(diào)節(jié)，除了少量的基因表達(dá)隨著FSH信號(hào)強(qiáng)度的變化外，其主要的生物學(xué)過程，調(diào)節(jié)途徑均無顯著性變化，這說明FSH信號(hào)的負(fù)向調(diào)節(jié)要輕微很多。【結(jié)論】FSH信號(hào)通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式對(duì)下丘腦進(jìn)行調(diào)節(jié)，相比正向調(diào)節(jié)，F(xiàn)SH信號(hào)的負(fù)向調(diào)節(jié)要輕微很多。

金堂黑山羊；FSH信號(hào)；下丘腦；基因表達(dá)譜

【研究意義】金堂黑山羊?qū)傥覈?guó)優(yōu)良的地方黑山羊品種。它們的繁殖力顯著高于其他一些山羊品種，據(jù)報(bào)道金堂黑山羊的產(chǎn)羔數(shù)達(dá)2.40，大大高于世界上其它優(yōu)秀山羊品種(波爾山羊2.00，南江黃羊2.10)[1]。動(dòng)物繁殖力與FSH信號(hào)通路緊密相關(guān)，搞清楚金堂黑山羊FSH信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)合理利用其高繁殖性能具有極其重要的意義。【前人研究進(jìn)展】在前期研究中，發(fā)現(xiàn)金堂黑山羊的繁殖器官中有2條FSHR同時(shí)表達(dá)，通過形成異源二聚體顯著增加了FSH信號(hào)強(qiáng)度，促進(jìn)了排卵，從而形成高繁殖力。基于以上研究，我們發(fā)現(xiàn)動(dòng)物高繁殖力的主要控制因素在于FSH信號(hào)通路。然而FSH是由腦垂體分泌的激素，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入靶器官，進(jìn)行生殖調(diào)節(jié)，在此過程中，會(huì)受到較多的因素(如FSH劑量、FSH受體表達(dá)、FSH與受體結(jié)合，結(jié)合后下游因子作用等)影響，這些因素疊加起來進(jìn)一步影響動(dòng)物排卵。以上發(fā)現(xiàn)表明動(dòng)物對(duì)FSH信號(hào)通路的調(diào)節(jié)存在著一定的調(diào)節(jié)機(jī)制，可能是受研究手段的限制，到目前為止，尚未見報(bào)道。下丘腦是動(dòng)物性腺軸的重要一環(huán)，它通過釋放促性腺釋放激素來啟動(dòng)動(dòng)物垂體分泌垂體激素，垂體激素作用于性腺啟動(dòng)排卵機(jī)制，同時(shí)啟動(dòng)性腺分泌性激素來優(yōu)化生殖內(nèi)環(huán)境，從而啟動(dòng)動(dòng)物生殖，性腺軸不僅正向調(diào)節(jié)動(dòng)物排卵，同時(shí)也負(fù)反饋調(diào)節(jié)上游激素的分泌等[2-3]，到目前其負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制并不明朗?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究通過改變金堂黑山羊的FSH信號(hào)強(qiáng)度，來測(cè)定下丘腦基因表達(dá)譜的變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過本次研究為徹底搞清楚FSH信號(hào)的調(diào)節(jié)機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在金堂黑山羊原種場(chǎng)隨機(jī)選取年齡在3～5歲，體重30～40 kg，營(yíng)養(yǎng)良好、前3胎產(chǎn)仔數(shù)在2個(gè)以上的健康空懷的金堂黑山羊成年母羊10只作為試驗(yàn)用羊，供試羊在欄內(nèi)散放飼養(yǎng)，自由采食、飲水。實(shí)驗(yàn)前，觀察發(fā)情情況，連續(xù)觀察30 d。

1.2 主要試劑

Trizol為Invetrogen公司(美國(guó))產(chǎn)品，F(xiàn)SH購(gòu)自于寧波激素一廠，化學(xué)試劑除注明外，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 FSH處理

將10只試驗(yàn)用羊隨機(jī)分成2組，每組5只羊。一組為對(duì)照組，不進(jìn)行FSH注射。另一組為試驗(yàn)組。在發(fā)情后的第2天對(duì)試驗(yàn)組金堂黑山羊進(jìn)行FSH肌肉注射，注射劑量為100 IU，并在注射24 h后，摘取金堂黑山羊的卵巢。同時(shí)在對(duì)照組發(fā)情后的第3天摘取卵巢。卵巢液氮速凍后在-80 ℃條件下保存，用于基因表達(dá)譜分析。

1.4 總 RNA 提取

用Trizol試劑提取卵巢總RNA。提取步驟按照操作說明進(jìn)行。將提取的卵巢總RNA送上海美吉生物有限公司進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序分析。將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，包括A/T/G/C堿基含量分布統(tǒng)計(jì)、堿基質(zhì)量分布分析、飽和度分析、冗余序列分析以及基因覆蓋度分析，從而確定表達(dá)譜測(cè)序分析的質(zhì)量。

1.5 GO(Gene Ontology)功能分類和KEGG PATHWAY代謝途徑分析

將測(cè)得的基因表達(dá)譜用軟件Goatools (https://github.com/tanghaibao/GOatools) 進(jìn)行GO功能富集分析，使用Fisher精確檢驗(yàn)。為控制計(jì)算的假陽性率，使用多重檢驗(yàn)方法(Bonferroni)對(duì)P值進(jìn)行了校正，通常情況下，當(dāng)經(jīng)過校正的P值(P_fdr)≤0.05時(shí)，認(rèn)為此GO功能存在顯著富集情況[4]。

將測(cè)得的基因表達(dá)譜用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do ) 進(jìn)行KEGG PATHWAY 富集分析,使用Fisher 精確檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。為控制計(jì)算假陽性率，采用BH(FDR) 方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)，經(jīng)過校正的P值(Corrected P-Value)以0.05 為閾值，滿足此條件的KEGG 通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的KEGG 通路[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)

本研究采用RNA-seq技術(shù)對(duì)2組經(jīng)不同F(xiàn)SH處理的金堂黑山羊下丘腦樣品進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序(表1)。

分別得到有效序列26004442，25041098條。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，得到歸一化序列30216946，27124882條。將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行A/T/G/C堿基含量分布統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)該文庫(kù)堿基分布均勻，模糊堿基N %在合理范圍之內(nèi)。同時(shí)，進(jìn)行堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計(jì)，通過公式計(jì)算，可以得出一個(gè)綜合的值，即質(zhì)量值(Q)，用來評(píng)估測(cè)序的質(zhì)量好壞，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)所獲得測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到后續(xù)分析要求。堿基錯(cuò)誤率分布統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)的堿基錯(cuò)誤率均可以達(dá)到低于0.1 %。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，得到歸一化序列25338808和24413890條。

將質(zhì)控后得到的高質(zhì)量測(cè)序序列使用(http://tophat.cbcb.umd.edu/)與指定的參考基因組比對(duì)，參考基因組來自于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/10731，如表2所示，發(fā)現(xiàn)符合率分別達(dá)85.31 %，85.32 %。

飽和度分析顯示飽和度總體質(zhì)量較高，該測(cè)序量能夠覆蓋絕大多數(shù)的表達(dá)基因。冗余序列分析顯示此樣本冗余序列含量正常?；蚋采w度分析顯示結(jié)果不具有偏向性，結(jié)果較均一。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 與參考基因組比對(duì)結(jié)果

表3 金堂黑山羊下丘腦差異表達(dá)基因的GO功能分類

2.2 表達(dá)差異分析

將這些序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組金堂黑山羊152個(gè)基因出現(xiàn)顯著性差異表達(dá)。其中117個(gè)基因上調(diào)了表達(dá)，35個(gè)基因下調(diào)了表達(dá)。其中，gene44399(transthyretin[Capra hircus])上調(diào)表達(dá)最高，上調(diào)了86.98倍。gene32112(ubiquitin-like protein ISG15)下調(diào)表達(dá)最多，下調(diào)了15倍。

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能分類以及KEGG功能分類

表3對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類，發(fā)現(xiàn)1個(gè)生物學(xué)過程出現(xiàn)了顯著性差異(P<0.05)，為器官形態(tài)變化(GO: 0009887)。

對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG功能分類，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)途徑并未發(fā)生顯著性改變。

3 討 論

金堂黑山羊是一個(gè)優(yōu)秀的地方山羊品種，具有生長(zhǎng)發(fā)育快，體格大，特別是其繁殖力明顯高于其它山羊品種。山羊是季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，分別于春季和秋季發(fā)情。只有在發(fā)情期，山羊才會(huì)啟動(dòng)卵泡發(fā)育。已有研究表明：山羊發(fā)情后在1個(gè)發(fā)情期后出現(xiàn)3～4個(gè)卵泡波，第1個(gè)FSH卵泡波峰值出現(xiàn)在發(fā)情后的第1～5天。張超等[5]研究了不同繁殖力山羊血漿中FSH的分泌規(guī)律，發(fā)現(xiàn)大足黑山羊在1個(gè)發(fā)情周期出現(xiàn)3個(gè)卵泡波，第1個(gè)卵泡波FSH峰值出現(xiàn)在第2天，為8.422 IU/L，而莎能奶山羊在1個(gè)發(fā)情期有4個(gè)卵泡波，第1個(gè)卵泡波FSH峰值出現(xiàn)在第1天，為6.227 IU/L。葛世豪等[7]研究了濟(jì)寧青山羊的FSH分泌規(guī)律，發(fā)現(xiàn)濟(jì)寧青山羊在1個(gè)發(fā)情有4個(gè)卵泡波，第1個(gè)卵泡波FSH峰值出現(xiàn)在第2天，為3.63 IU/L。侯衍猛等[8]研究了萊蕪黑山羊的FSH分泌規(guī)律，發(fā)現(xiàn)萊蕪黑山羊在1個(gè)發(fā)情有4個(gè)卵泡波，第1個(gè)卵泡波FSH峰值出現(xiàn)在第5天，為0.70 IU/L。綜上所述，可以確定山羊在發(fā)情后第1～5天，將出現(xiàn)第1個(gè)卵泡波FSH峰，峰值為0.7～8.4 IU/L。本次研究中，在發(fā)情后的第2天對(duì)試驗(yàn)驗(yàn)組金堂黑山羊進(jìn)行FSH注射，提高金堂黑山羊的FSH信號(hào)強(qiáng)度。按照寧波激素一廠的產(chǎn)品說明，山羊超數(shù)排卵為間隔12 h連續(xù)4 d肌注FSH，總量為200～250 IU，平均每次注射60～80 IU。為此，選擇1次注射，注射劑量為100 IU，并在注射24 h后，摘取金堂黑山羊的丘腦，檢測(cè)FSH信號(hào)不同強(qiáng)度調(diào)節(jié)后，丘腦表達(dá)譜出現(xiàn)的差異。

甲狀腺素結(jié)合蛋白(transthyretin)是大量存在于腦脊液的一種蛋白，它的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺素等激素[9]。Rojdmark等[10]推測(cè)甲狀腺激素作用于下丘腦，通過刺激GnRH的分泌來間接影響促性腺激素的分泌；Erfurth等[11]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素可通過作用于下丘腦的多巴胺能神經(jīng)元來影響促性腺激素的分泌。在本次研究中，發(fā)現(xiàn)在下丘腦中甲狀腺激素結(jié)合蛋白基因的上調(diào)表達(dá)，這可能是由于試驗(yàn)組FSH劑量的顯著提高，必將通過負(fù)反饋來抑制促性腺激素的進(jìn)一步分泌，而甲狀腺素就是這樣一個(gè)良好的調(diào)節(jié)劑，高表達(dá)的甲狀腺素結(jié)合蛋白攜帶大量的甲狀腺素在下丘腦中抑制了FSH的繼續(xù)分泌，這也是FSH信號(hào)通路的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式，這與Rojdmark，Erfurth的觀察一致。

干擾素刺激基因15(ISG15)是本次研究中下調(diào)表達(dá)最多的基因。該基因最早發(fā)現(xiàn)于牛和人的細(xì)胞中，是泛素小分子的一種，它以共價(jià)的方式鏈接在細(xì)胞膜和核仁蛋白上，影響分子結(jié)合[12]。Cohen等[13]發(fā)現(xiàn)泛素化過程作用于細(xì)胞表面的FSHR殘基，從而調(diào)節(jié)FSH信號(hào)傳導(dǎo)，F(xiàn)ang等[4]，Han等[15]發(fā)現(xiàn)到泛素化過程也可作用在與FSH信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的小蛋白分子上，從而影響FSH信號(hào)傳導(dǎo)。本次研究中試驗(yàn)組ISG15的下調(diào)表達(dá)可能是通過減少下丘腦中的FSH信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白的泛素化，從而減弱高劑量FSH的信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)FSH信號(hào)通路，這與上述的觀察一致。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組的GO功能分類顯示只有1個(gè)生物學(xué)過程出現(xiàn)了顯著性差異，那就是器官形態(tài)變化，而KEGG功能分類結(jié)果表明沒有任何調(diào)節(jié)途徑出現(xiàn)顯著性差異。這可能是由于在哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)SH是由垂體分泌，最終作用于卵巢，刺激原始卵母細(xì)胞的征集、分化等過程。而下丘腦是性軸中通過釋放促性腺釋放激素來調(diào)節(jié)垂體分泌FSH等激素，是調(diào)節(jié)FSH分泌量的器官。那么不同強(qiáng)度的FSH信號(hào)對(duì)于下丘腦來說就是一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)。相對(duì)于作用于卵巢的正向調(diào)節(jié)來說，負(fù)向調(diào)節(jié)就顯得輕微許多。所以在本次研究中只出現(xiàn)了器官形態(tài)變化的顯著性差異。

綜上所述，F(xiàn)SH信號(hào)通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式對(duì)下丘腦進(jìn)行調(diào)節(jié)，除了少量的基因表達(dá)隨著FSH信號(hào)強(qiáng)度的變化外，其主要的生物學(xué)過程，調(diào)節(jié)途徑均無顯著性變化。這說明FSH信號(hào)的負(fù)向調(diào)節(jié)要輕微很多。

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EffectofFSHSignalRegulationonGeneExpressionProfilingofHypothalamusinJintangBlackGoat

CAO Ye1,2，ZHAO Su-jun1,2，XIE Jing1,2，WANG Qiu-shi1,2，LIAO Dang-jin1,2

(1. Sichuan Animal Science Academy, Sichuan Chengdu 610066, China; 2.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Chengdu 610066, China)

【Objective】The purpose of this study was to understand the model of FSH signal regulation mechanism in Jintang black goat.【Method】10 healthy adult Jintang black goats in the same reproductive cycle were randomly divided into two groups, one was as control group, and the other is as tested group. On the second day of the estrus, Jintang black goats of tested group were injected with FSH 100IU, and their Hypothalamus were obtained in 24 hours after injection. On the third days of the estrus, the Hypothalamus of control group was obtained. Total RNAs were extracted, and the expression profiles were sequenced. 【Result】The effective sequences obtained from control group and tested group by sequencing analysis were 26004442 and 25041098, respectively; The normalized sequences by statistical analysis were 25338808, 24413890, and the coincidence rate of goat genome were 85.31 % and 85.32 %, respectively. After comparison, 152 genes were found to be significantly different, of which 117 genes were up-regulated, and 35 genes was down-regulated. GO functional classification reveals that the significant differences were founded in 1 biological process, and no significant difference was found in KEGG functional classification. The results indicated that the FSH signal regulate the hypothalamus by negative feedback regulation, and there was no significant change in the main biological process by FSH signal intensity change except for a small number of gene expression, which indicated that the negative regulation of FSH signal was slight. 【Conclusion】The FSH signal regulates the hypothalamus by feedback and is much less than that of the forward regulation.

Jintang black goat；FSH signal；Hypothalamus；Gene expression profiling

1001-4829(2017)12-2820-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.034

2017-05-02

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目“金堂黑山羊FSH信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制的研究”(2015JY0008)

曹 冶(1970-)，男，四川蓬安人，博士，研究員，現(xiàn)從事動(dòng)物分子遺傳研究，E-mail:cy3831@163.com。

S827

A

(責(zé)任編輯陳 虹)