楊紅+顧妍+張朝陽+孫玉東+羅德旭

摘要： 以Bonbon、嘉年華二號、先甜74、超玉4個西瓜品種為試驗材料，采用輻射花粉授粉結合胚挽救技術，研究其對西瓜單倍體的誘導效果，結果表明，授粉11～12 d的西瓜果實相對較好，能得到較多的幼嫩種子；采用西瓜表面灼燒消毒再取種的方法簡便易行，污染率極低。

關鍵詞： 單倍體；輻射花粉；胚挽救；授粉；誘導效果；西瓜

中圖分類號： S651.036 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0159-03

γ射線是輻射花粉授粉誘導葫蘆科蔬菜作物單倍體的有效輻射源。近年來，通過輻射花粉誘導雌核發(fā)育獲得單倍體技術已應用于育種中，并培育出黃瓜、西瓜、甜瓜等多種葫蘆科植物單倍體植株[1-3]。西瓜種子由雌花中的胚珠發(fā)育而來，一般普通種子是經(jīng)授粉后雙受精產(chǎn)生，而用輻射處理過的花粉進行授粉無法完成雙受精過程而產(chǎn)生癟種，及時對其進行胚挽救，可以更快得到單倍體。采用化學試劑處理可使雌花不經(jīng)授粉直接膨大，形成的種子就是單倍體。本試驗采用輻射花粉授粉結合胚挽救技術，探討西瓜輻射花粉經(jīng)不同胚挽救處理對坐果和單倍體胚產(chǎn)生的影響，為西瓜單倍體材料的獲得奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2012—2014年在江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學研究所進行，供試西瓜品種Bonbon、嘉年華二號、先甜74、超玉。Bonbon為日本引進西瓜品種，超玉為江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學研究所育成，這2個西瓜品種的種子略大；嘉年華二號和先甜74由先正達公司提供，均為小籽西瓜品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 γ射線輻照花粉授粉對西瓜種子形成的影響 用輻射處理過的花粉進行授粉，標明花粉輻射劑量及授粉時間；授粉后8～20 d，分別采集正常生長的未成熟果實進行胚挽救試驗，調(diào)查種子發(fā)育情況，同時，嘗試用0.1%氯吡脲（重慶諾意）處理部分雌花，使其直接膨大，處理后8 d采集正常生長的未成熟果實進行胚挽救試驗。胚挽救以MS培養(yǎng)基為基礎添加2%蔗糖、2% D-甘露醇、7%瓊脂固化，pH值為 5.8；繼代培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基礎添加3%蔗糖、7%瓊脂固化，pH值為5.8。

1.2.2 不同消毒方式對西瓜幼胚的消毒效果 將未成熟西瓜果實中的種子取出，放入滅菌燒杯中，用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液和不同濃度次氯酸鈉（NaClO）溶液分別浸泡 2～30 min（表1）；滅菌水沖洗5～6次，置于滅菌紙上吸干水分，接種于滅菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，觀察是否污染以確定消毒效果。

將取回的西瓜果實用75%乙醇擦拭表面，放于鐵盤中，用少量的95%乙醇淋濕西瓜表面，用灼燒方法進行滅菌；無菌手術刀切開西瓜，將西瓜中的未成熟種子接種于滅菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，觀察是否污染以確定消毒效果。

1.2.3 不同接種方法的接種效果 試驗設4個處理：切去種子遠胚端約1/3后，將近胚端朝下插入培養(yǎng)基；切去種子遠胚端約1/3后，將胚平放于培養(yǎng)基上；種子近胚端朝下插入培養(yǎng)[HJ1.4mm]基；種子平放于培養(yǎng)基上。接種時種子為白色或淡黃色，待種子轉綠，轉接至普通MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～5周，種子鼓起、表皮變褐或子葉長出時去除種皮，轉接至分化培養(yǎng)基上。

1.2.4 6-BA濃度對西瓜未成熟胚生長的影響 將消毒西瓜種子接種于含有不同濃度6-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，觀察并記錄種子轉綠過程及萌發(fā)狀態(tài)。

1.2.5 西瓜種子幼胚觀察及倍性鑒定 西瓜種子萌發(fā)前，對 種子幼胚進行切片觀察；種子萌發(fā)至子葉展開，切取頂芽，轉接入含有6-BA的MS培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，每個品種擴繁3～4瓶；取部分芽、葉，采用醋酸洋紅法進行倍性鑒定。

1.2.6 不同西瓜品種胚挽救效果 調(diào)查不同西瓜品種的胚挽救效果，對胚已萌發(fā)但未成苗進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 γ射線輻照處理對西瓜種子形成的影響

分別用授粉后8～20 d的西瓜種子進行胚挽救試驗，結果表明，授粉后10 d內(nèi)的西瓜種子過于幼嫩，接種時損傷較大，而授粉超過15 d的西瓜種子未成熟胚基本死亡，發(fā)育趨于成熟的又都是二倍體種子；授粉11～12 d的西瓜種子相對較好，可得到較多的幼嫩種子用于胚挽救。經(jīng)氯吡脲處理的西瓜雌花，坐果率較低，但獲得的可用種子數(shù)較多，而氯吡脲的效果受溫度影響較大，試驗效果不明顯。

2.2 不同消毒方式對西瓜幼胚的消毒效果

由表1可見，各濃度的次氯酸鈉溶液對西瓜幼胚的消毒效果不理想，污染率為21.1%～86.5%；隨消毒時間的延長，氯化汞溶液對西瓜幼胚的消毒效果較次氯酸鈉有顯著提高，污染率顯著降低（P<0.05）；灼燒外皮的消毒方法也相對較好，污染率較低，為2.6%。

2.3 不同接種方法的接種效果

試驗表明，由于培養(yǎng)基中加入瓊脂后具有一定的彈性，種子插入培養(yǎng)基后會慢慢滑出，成為平放于培養(yǎng)基的狀態(tài)；種子插入過深，則因組培瓶內(nèi)水分較大，形成無氧狀態(tài)，種子迅速死亡。切去種子遠胚端約1/3后接種，因組培瓶內(nèi)水分較大，種子極易變黑死亡；將完整種子直接接種，在種子種皮變白或變褐、種子中間膨起或看到子葉時，將種子去除種皮進行轉接，該方法接種效率相對較高，污染較少，但也會出現(xiàn)有部分種子因無法撐破種皮或種子內(nèi)水分較高而死亡。

2.4 6-BA濃度對西瓜未成熟胚生長的影響

由表2可見，Bonbon、嘉年華二號、先甜74、超玉在6-BA濃度為5 μmol/L時的種子轉綠比例相對最高，分別為44.70%、43.48%、20.11%、60.28%；種子轉綠與萌發(fā)之間沒有明顯關系，大部分轉綠的種子并沒有萌發(fā)，萌發(fā)的種子大多從種皮已褐變的種子萌發(fā)而來；嘉年華二號在6-BA為 10 μmol/L 時種子萌發(fā)比例相對最高，為7.19%。endprint

2.5 西瓜種子幼胚觀察及幼苗倍性鑒定

對西瓜種子幼胚進行觀察發(fā)現(xiàn)，西瓜種子幼胚存在不同形態(tài)，由于西瓜種子相對較小，種皮較硬，在剝種子的時候極易損傷幼胚，目前得到心形胚、球形胚、子葉形胚3種形態(tài)的西瓜種子幼胚（圖1）。普通二倍體西瓜的染色體為2n=22。由圖2可見，組培苗根尖組織細胞內(nèi)含有11條染色體，確定該組培苗材料為單倍體。

2.6 不同西瓜品種胚挽救效果及胚萌發(fā)但未成苗原因統(tǒng)計分析

由表3可見，嘉年華二號西瓜種子的萌發(fā)率及成苗率明顯高于其他品種，而Bonbon西瓜品種的種子卻沒有1個萌發(fā)

成苗。由表4可見，萌發(fā)的胚沒有生長點是其不能繼續(xù)生長的主要原因，其異常常見為萌發(fā)后的胚異常膨大、表面布滿白色絨毛等；嘉年華二號未成苗原因相對最為復雜，除胚無生長點外，還有擴繁失敗及培養(yǎng)時玻璃化、褐化、污染、生長異常等現(xiàn)象發(fā)生。

3 結論與討論

試驗結果表明，以輻射花粉授粉11～12 d的西瓜果實相

對較好，可得到較多的幼嫩種子，且西瓜果實須當天采當天用，否則無論是室溫還是低溫條件下儲存，都不能保證試驗材料的鮮活。目前，已知成功獲得西瓜的單倍體植株是由花藥培養(yǎng)或胚珠培養(yǎng)[4-7]得來，其消毒方法均采用藥劑消毒。本試驗發(fā)現(xiàn)，西瓜未成熟種子的胚較幼嫩，種皮很薄，用試劑消毒對西瓜未成熟種子損傷較大，且消毒不徹底；完好的西瓜幼瓜內(nèi)部近似于無菌狀態(tài)，采用75%乙醇浸泡并灼燒外皮法消毒并取種，其污染率極低。由于花粉輻射受環(huán)境限制較大，本試驗嘗試用氯吡脲處理西瓜，使其不經(jīng)授粉直接膨大，其幼胚一旦萌發(fā)得到的便是單倍體，但采用氯吡脲處理西瓜雌花坐果率較低，接種數(shù)千粒種子僅得到幾個單倍體材料，加上其過于嬌嫩，未能獲得加倍材料。氯吡脲處理西瓜并進行胚挽救，獲得西瓜單倍體的方法只需靜待其萌發(fā)，前期處理和接種工作量相對較大，但篩選工作量大大減少。

適用于葫蘆科作物的培養(yǎng)基配方多不適于西瓜，而在基礎MS培養(yǎng)基中適當增加鹽酸硫胺素含量有助于西瓜的生長。西瓜幼嫩種子在含有5～10 μmol/L 6-BA、添加2%蔗糖和2%甘露醇的MS培養(yǎng)基上生長3～7 d，轉至無6-BA而添加2～3%蔗糖、1～2%甘露醇的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長（添加6-BA含量會影響種子生長）而產(chǎn)生愈傷組織；待西瓜種子的子葉長出可在含有1～10 μmol/L 6-BA、添加3%蔗糖的MS培養(yǎng)基上進行增殖（6-BA 1 μmol/L和5 μmol/L交替使用可防止玻璃化苗的出現(xiàn)），在含有5 μmol/L IBA、添加3%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）不適用于西瓜單倍體培養(yǎng)，而在培養(yǎng)基中加入0.1%～0.2%的活性炭可能夠促進其生長。

Ertan等對南瓜種子的幼胚進行觀察，得出8種形態(tài)的南瓜種子幼胚，且認為球形胚和心形胚能夠培養(yǎng)得到的是單倍體材料，子葉形胚培養(yǎng)得到的是二倍體材料，而其他形態(tài)的胚則無法正常發(fā)育[8]。本試驗結果表明，西瓜種子球形胚經(jīng)培養(yǎng)得到的是單倍體材料，子葉形胚得到的是二倍體材料，而其他形態(tài)的胚則沒有發(fā)育。

參考文獻：

[1] Sauton A，Vaulx R D. Obtention de plantes haploides chez le melon（Cucumis melo L.）par gynogenèse induite par du pollen irradié[J]. Agronomie，1987，7（2）：141-148.

[2]Sari N，Abak K，Pitrat M，et al. Induction of parthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen in watermelon[J]. HortScience，1994，29（10）：1189-1190.

[3]Abak K，Sari N，Paksoy M，et al. Genotype response to haploid embryo induction with pollination by irradiated pollens in melon，obtaining of dihaploid lines，determination of haploid and diploid plants by different techniques[J]. Turkish Journal of Agriculture and Forestry，1996，20（5）：425-430.

[4]薛光榮，余文炎，楊振英，等. 西瓜花粉植株的誘導及其后代初步觀察[J]. 遺傳，1988，10（2）：5-8，49.

[5]王建設，楊 穎，裴曉利，等. 西瓜單倍體的生產(chǎn)方法及其專用培養(yǎng)基：L201010178184[P]. 2010-05-14.

[6]王 靜，喬 飛，江雪飛，等. 不同倍性西瓜原生質(zhì)體制備與低溫耐受性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（10）：206-209.

[7]王玉書，王 歡，高美玲，等. 小型西瓜花藥愈傷組織誘導條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（3）：30-32.

[8]Kurtar E S，Balkaya A. Production of in vitro haploid plants from in situ induced haploid embryos in winter squash （Cucurbita maxima Duchesne ex Lam.） via irradiated pollen[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2010，102（3）：267-277.endprint