佟智斌 譚紅 尹聰 邱路雅 袁麗君 涂星

摘要：目的 探究不同配比的黃芪-葛根藥對(duì)水煎液中葛根素的含量，驗(yàn)證經(jīng)方黃芪葛根湯和玉液湯配伍比例的合理性，為臨床用藥提供參考。方法 設(shè)置不同劑量配比的黃芪-葛根藥對(duì)（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4），以SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸（35∶65）為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定不同配比藥對(duì)水煎液中葛根素含量。結(jié)果 葛根素在5～300 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=66 449.269 1X-175 665.663 1（r=0.999 6），重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率良好。黃芪與葛根的比例為0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4的混煎液中葛根素含量分別為（2.506 7±0.025 8）%、（2.526 7±0.071 2）%、（2.863 3±0.086 4）%、（2.956 7±0.119 6）%、（2.835 0±0.078 7）%、（2.480 0±0.072 4）%、（2.530 0±0.064 8）%、（2.183 3±0.128 9）%。結(jié)論 黃芪-葛根藥對(duì)配伍比例為2∶1、3∶1、4∶1時(shí)，水煎液中葛根素含量最高，證實(shí)經(jīng)方中兩者的配比合理，可作為臨床選用的最優(yōu)配比。

關(guān)鍵詞：黃芪-葛根藥對(duì)；配伍比例；葛根素；含量分析；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.016

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）11-0073-04

Abstract： Objective To study the contents of puerarin in decoction with different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix； To verify the rationality of compatibility ratios of Huangqi Gegen Decoction and Yuye Decoction； To provide references for clinical medication. Methods Different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix were set as 0：1， 1：1， 2：1， 3：1， 4：1， 1：2， 1：3， and 1：4. SinoChrom ODS-BP （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used as the chromatographic column to detect the contents of puerarin； methanol-0.1% phosphoric acid （35：65） was used as the mobile phase with 0.5 mL/min flow rate； sample volume was 20 μL； the wavelength was 250 nm. Results The regression equation of puerarin was Y=66 449.269 1X-175 665.663 1 （r=0.999 6） in the range of 5 to 300 μg/mL， showing a good linear relationship. The repeatability， stability and recovery rate were fine as well. The contents of puerarin were （2.506 7±0.025 8）%， （2.526 7±0.071 2）%， （2.863 3± 0.086 4）%， （2.956 7±0.119 6）%， （2.835 0±0.078 7）%， （2.480 0±0.072 4）%， （2.530 0±0.064 8）%， and （2.183 3±0.128 9）% in different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix with 0：1， 1：1， 2：1， 3：1， 4：1， 1：2， 1：3， and 1：4， respectively. Conclusion When the compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix are 2：1. 3：1， and 4：1， the contents of puerarin in decoction are the highest. This study verifies that the compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix in classical prescriptions are rational， which can be the optimal compatibility ratios in clinic.

Keywords： Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix； compatibility ratios； puerarin； content analysis； HPLC

黃芪-葛根為臨床常用對(duì)藥，用于治療氣陰兩虛之高血壓、糖尿病和中風(fēng)后遺癥等[1]，尤其適用于糖尿病合并高血壓、冠心病和腦血管病變的患者[2]。王春怡等[3]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪葛根湯通過(guò)降低糖尿病小鼠的空腹血糖，提高糖耐量，增加小鼠對(duì)胰島素的敏感指數(shù)和降低胰島素抵抗指數(shù)，同時(shí)下調(diào)血脂和血清中游離脂肪酸的水平，發(fā)揮治療糖尿病及胰島素抵抗作用?，F(xiàn)代研究表明，黃芪-葛根藥對(duì)對(duì)肝臟糖脂代謝、胃黏膜損傷、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、神經(jīng)根型頸椎病等都具有較好的治療或保護(hù)作用[4-8]。

《證治匯補(bǔ)》黃芪葛根湯以黃芪一兩、葛根五錢(qián)組成，張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中的玉液湯用黃芪五錢(qián)、葛根一錢(qián)半以治療消渴。本研究以黃芪、葛根為關(guān)鍵詞，在線(xiàn)檢索中國(guó)中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(kù)（中藥類(lèi)、方劑類(lèi)、藥品類(lèi)，http：//cintmed.cintcm.com/cintmed）、中成藥處方數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//db.yaozh.com/chufang）、中國(guó)藥典數(shù)據(jù)庫(kù)（2015年版，http：//www.drugfuture. com/standard/）、CNKI專(zhuān)利數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//kns.cnki.net/ kns/brief/result.aspx？dbprefix=SCDB），并手工檢索2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》，發(fā)現(xiàn)含有葛根-黃芪藥對(duì)的常用藥品有60余種，其中黃芪-葛根的配比包括1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4等，不同配比對(duì)葛根主要有效成分葛根素的含量是否存在影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用RP-HPLC研究黃芪-葛根藥對(duì)以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4的不同比例配伍時(shí)葛根素含量的變化，驗(yàn)證經(jīng)方黃芪葛根湯和玉液湯配比的合理性，為臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀系統(tǒng)（日本島津），包括SPD- 10Avp/AVvp紫外-可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器、LC-10ATVP二元梯度泵；N2000雙通道色譜工作站（賽智科技杭州有限公司）；BT-25S型十萬(wàn)分之一電子分析天平（塞多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；Mili-Q超純水機(jī)（貝徠美生物科技有限公司）；KQ2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BUCHI R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（SWITZERLAND）；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；YB-2000A型高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司）。

葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752-201615），中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；水為去離子超純水；磷酸為分析純。葛根、黃芪飲片，購(gòu)于恩施宏升大藥房，經(jīng)湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院朱敏英教授鑒定，分別為豆科植物甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的根和豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（35∶65），流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取置于P2O5中干燥至恒重的葛根素對(duì)照品10 mg，加30%甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 mg/mL對(duì)照品貯備液，置于5 ℃冰箱，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取黃芪、葛根飲片，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)10目篩。按葛根（固定為6 g）與黃芪不同配比（1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1）分別稱(chēng)量粗粉，加10倍量水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次0.5 h，合并水煎液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（58 ℃，300 r/min）濃縮，冷卻后加超純水溶解并定容至50 mL，取10 mL過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

取黃芪飲片，按供試品溶液制備方法制備水煎液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、葛根單煎液、黃芪-葛根1∶1水煎液和陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖1。在該色譜條件下，葛根素素的保留時(shí)間約為19.1 min，分離度R>1.5，理論塔板數(shù)不低于4000，表明樣品中的葛根素分離度良好，陰性對(duì)照及其他成分無(wú)干擾。

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下葛根素對(duì)照品貯備液50、100、200、400、600、1000、2000、3000 μL于10 mL容量瓶中，加30%乙醇定容刻度，即得系列濃度的對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y=66 449.269 1X-175 665.663 1（r=0.999 6），表明葛根素在5～300 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下5、20、100 μg/mL葛根素對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，計(jì)算峰面積RSD。結(jié)果RSD分別為0.671%、0.293%、1.414%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取黃芪-葛根1∶1配比的供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積。結(jié)果葛根素峰面積RSD=2.612%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取3份0.1 g已知葛根素含量為2.51%的葛根粗粉，分別加入葛根素對(duì)照品（相當(dāng)于粗粉中葛根素含量的80%、100%、120%），加10倍量水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次0.5 h，合并水煎液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算平均回收率。結(jié)果平均加樣回收率分別為101.14%、98.94%、99.64%，RSD分別為1.65%、0.69%、2.45%，見(jiàn)表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

按“2.2”項(xiàng)下方法，按黃芪-葛根（固定為6 g）不同配比（0∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1）平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定葛根素含量。若測(cè)得葛根素峰面積不在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)，則倍比稀釋至符合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍。結(jié)果見(jiàn)表2。

可見(jiàn)，黃芪-葛根（固定為6 g）不同配比水煎液中葛根素含量存在顯著差異，與葛根單煎（0∶1組）比較，1∶1、1∶2、1∶3組葛根素含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），1∶4組葛根素含量顯著降低（P<0.05），而2∶1、3∶1、4∶1組葛根素含量顯著升高（P<0.05），3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》測(cè)定葛根中葛根素含量采用30%甲醇超聲提取制備樣品，以甲醇-水（25∶75）作為流動(dòng)相[9]。本研究以該色譜條件進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)葛根素的分離效果欠佳，可能與本研究以水作為提取溶劑導(dǎo)致葛根素水解有關(guān)。葛根素及其水解產(chǎn)物均可能為多羥基化合物，流動(dòng)相pH值對(duì)其分離度的影響較大，故本研究調(diào)整流動(dòng)相pH值，以甲醇-0.1%磷酸水溶液（35∶65）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，保留時(shí)間約為19 min，極大縮短了分析時(shí)間。

古代醫(yī)家常用黃芪、葛根治療消渴?！度杖A子本草》言黃芪能“助氣，壯筋骨，長(zhǎng)肉，補(bǔ)血，破癥癖，瘰疬癭贅，腸風(fēng)，血崩帶下，赤白痢，產(chǎn)前后一切病，月候不勻，消渴，痰嗽，并治頭風(fēng)熱毒，赤目”等；《普濟(jì)方》記載黃芪治療消渴的方劑有115首。葛根治療消渴始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，指出葛根“主治消渴，身大熱，嘔吐，諸痹，起陰氣，解諸毒”。兩者配伍組成的黃芪葛根湯和玉液湯中黃芪、葛根的比例分別為2∶1和3∶1。王治平[10]開(kāi)展的黃芪-葛根藥對(duì)配伍規(guī)律對(duì)藥效物質(zhì)的影響研究發(fā)現(xiàn)，葛根素為君有效成分，3-羥基葛根素、大豆苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為臣有效成分，黃芪-葛根藥對(duì)化學(xué)層次配伍存在協(xié)同作用，主要表現(xiàn)為以2∶1配伍時(shí)葛根素、大豆苷、黃芪甲苷等溶出量顯著增加。葛根素具有降血糖、降血脂、改善胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激、減輕炎性反應(yīng)等作用[11]。故本研究以葛根素為指標(biāo)成分檢測(cè)其在葛根-黃芪不同配比水煎液中的含量。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黃芪-葛根以2∶1、3∶1、4∶1比例配伍時(shí)，其水煎液中葛根素的含量較其他配比高，且三者間無(wú)顯著差異，從葛根素含量角度驗(yàn)證了黃芪葛根湯和玉液湯配比是合理的。王治平[10]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪-葛根混煎時(shí)各成分溶出量均比單煎時(shí)高，而本研究發(fā)現(xiàn)黃芪-葛根混煎時(shí)，黃芪比例高則葛根素的溶出量較大，葛根比例高則葛根素的溶出量無(wú)明顯變化甚至降低，其原因可能在于該研究中供試品溶液制備是以乙醇回流提取，而本研究是以水煎煮，導(dǎo)致指標(biāo)成分溶出量不同。

不同配比的黃芪-葛根藥對(duì)在糖尿病患者或動(dòng)物模型中的生物藥劑學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)特征如何，體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的變化是否能引起作用效果的改變，還有待進(jìn)一步深入研究。

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