鄭麗君，申光輝*，張志清，李辰鳳，陳安均，黎杉珊，吳賀君，羅松明

真空包裝免泡豆桿優(yōu)勢腐敗細(xì)菌分離鑒定及其致腐能力分析

鄭麗君，申光輝*，張志清，李辰鳳，陳安均，黎杉珊，吳賀君，羅松明

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

以真空包裝免泡豆桿為研究對(duì)象，分離鑒定其中的腐敗細(xì)菌，并分析耐高溫優(yōu)勢腐敗菌的腐敗能力，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考。采用選擇性培養(yǎng)基對(duì)免泡豆桿中腐敗細(xì)菌進(jìn)行分離純化，并測定菌株的耐高溫及產(chǎn)蛋白酶能力，通過形態(tài)、生理生化特征結(jié)合16S rRNA、gyrB基因序列分析對(duì)優(yōu)勢腐敗細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。將優(yōu)勢腐敗菌接種到無菌免泡豆桿中，通過樣品感官評(píng)價(jià)、質(zhì)構(gòu)特性、揮發(fā)性鹽基氮值（TVB-N）、蛋白酶活力及pH值的分析，比較不同腐敗菌株對(duì)免泡豆桿的腐敗能力。從腐敗樣品中共分離獲得20 株不同的腐敗菌，其中有12 株可耐受110 ℃、20 min高溫處理，且具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力。回接驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種4 株優(yōu)勢耐高溫腐敗菌的免泡豆桿樣品，37 ℃貯藏至第7天發(fā)生明顯腐敗變質(zhì)，樣品TVB-N、蛋白酶活力及pH值顯著高于未接菌對(duì)照樣品；此外，硬度、彈性、膠著性、耐咀性等產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性也顯著低于對(duì)照樣品。4 株優(yōu)勢腐敗菌均為芽孢桿菌，通過比較TVB-N產(chǎn)量因子確定腐敗能力最強(qiáng)的是解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）DY1a，其次依次分別為解淀粉芽孢桿菌DY1b，枯草芽孢桿菌（B. subtilis）DY3和DY2a。

免泡豆桿；芽孢桿菌；gyrB基因；腐敗能力；質(zhì)構(gòu)特性

豆桿是我國四川隆昌、重慶梁平等地的一種傳統(tǒng)非發(fā)酵豆制品，也稱豆筋，豆棒。其中隆昌豆桿歷史悠久、品質(zhì)優(yōu)良，產(chǎn)品質(zhì)地細(xì)膩，綿軟筋道，豆香濃郁，深受消費(fèi)者喜愛，已被列為國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。傳統(tǒng)豆桿是將大豆經(jīng)清洗浸泡、磨漿、過濾煮漿、起皮、裹棒成型，烘至半干，再次裹棒成型，最后干制而成的棒狀豆制品[1]。豆桿食用前需在常溫下復(fù)水4～6 h，耗時(shí)費(fèi)力，極不方便，且不同水質(zhì)對(duì)復(fù)水后的產(chǎn)品品質(zhì)影響較大。近年來，企業(yè)為滿足消費(fèi)者食用方便的需求，將傳統(tǒng)豆桿復(fù)水，真空包裝成免泡豆桿，開袋即烹即食，節(jié)約時(shí)間，更加方便消費(fèi)者食用，消費(fèi)市場潛力巨大。免泡豆桿中大豆蛋白、脂肪、糖類等營養(yǎng)成分豐富，且水分含量高，非常適宜腐敗微生物生長繁殖，因此免泡豆桿貨架期內(nèi)極易發(fā)生腐敗脹袋，嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)與食用安全。

目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，由于大豆原料來源不同及加工生產(chǎn)環(huán)境狀況差異，傳統(tǒng)非發(fā)酵豆制品腐敗微生物種類及其多樣性差異較大。部分研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌是主要的腐敗微生物。如變質(zhì)豆?jié){主要腐敗菌為地衣芽孢桿菌，短小芽孢桿菌和短芽孢桿菌[2]；豆腐干中主要腐敗菌為枯草芽孢桿菌[3]。另外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除芽孢桿菌外還有其他類群腐敗微生物。如內(nèi)酯豆腐中的主要腐敗菌有堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和屎腸球菌[4-5]，鹵水豆腐的主要腐敗菌為短小芽孢桿菌和惡臭假單胞菌[6]。研究還發(fā)現(xiàn)豆腐中存在發(fā)酵乳桿菌、梨形腸桿菌、腸膜明串珠菌等乳酸菌[7-8]。豆腐絲主要腐敗細(xì)菌有成團(tuán)腸桿菌、短小芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌[9]；發(fā)現(xiàn)白干和薄百葉中主要腐敗菌除枯草芽孢桿菌外，還有溶酪葡萄球菌、約翰遜不動(dòng)桿菌和戊糖片球菌[10]。豆腐干中腐敗菌除枯草芽孢桿菌，還有惡臭假單胞菌[11]。

本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)真空包裝免泡豆桿中優(yōu)勢腐敗細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，并比較分析耐高溫腐敗細(xì)菌對(duì)免泡豆桿的腐敗能力，確定優(yōu)勢腐敗菌及其對(duì)豆桿質(zhì)構(gòu)特性品質(zhì)的影響，為免泡豆桿的殺菌防腐工藝條件研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆桿由四川山古坊食品有限公司提供。

主要培養(yǎng)基[12]：LB液體培養(yǎng)基、PCA瓊脂培養(yǎng)基、VRBA瓊脂培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基、STAA瓊脂培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、氣單胞菌培養(yǎng)基（AMB）、錳鹽營養(yǎng)瓊脂 青島海博生物技術(shù)有限公司。

主要試劑：TIANamp Bateria DNA Kit（DP302）天根生化科技（北京）有限公司；MasterMix Taq、Loading buffer、核酸染料 成都康迪生物技術(shù)有限公司；微生物生理生化鑒定管 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CPA225D型電子天平 德國賽多利斯股份公司；FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；ECLIPSE E100型生物顯微鏡 日本Nikon公司；YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；MyCyclerTM Thermal Cycler PCR儀、Gel Doc XR＋凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro公司。

1.3 方法

1.3.1 免泡豆桿腐敗細(xì)菌的分離純化

取腐敗免泡豆桿樣品（25±1）g，無菌條件下充分研磨后轉(zhuǎn)入加有225 mL 0.85%無菌生理鹽水的錐形瓶，200 r/min振蕩30 min，靜置5 min，用0.85%生理鹽水10倍梯度稀釋，選擇3 個(gè)稀釋梯度，各取1 mL梯度稀釋液，采用傾注法，利用不同選擇性培養(yǎng)基分離并統(tǒng)計(jì)各種培養(yǎng)基分離典型菌株的分離頻率。選擇3 批次樣品，每個(gè)批次隨機(jī)選取3 袋樣品進(jìn)行分離。根據(jù)菌落的形狀、大小和顏色等形態(tài)特征，挑取不同選擇性培養(yǎng)基上單菌落進(jìn)行純化，鏡檢，斜面保藏。菌落總數(shù)用PCA瓊脂培養(yǎng)基分離計(jì)數(shù)；葡萄球菌和微球菌（Micrococcaceae）用MSA瓊脂培養(yǎng)基分離計(jì)數(shù)；芽孢桿菌（Bacillus）用錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離計(jì)數(shù)；腸桿菌（Enterobacteriaceae）用VRBA瓊脂培養(yǎng)基分離計(jì)數(shù)；乳酸菌數(shù)用MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；熱殺索絲菌用STAA瓊脂培養(yǎng)基分離計(jì)數(shù)；綠膿假單胞菌用CFC培養(yǎng)基分離計(jì)數(shù)；氣單胞菌用AMB培養(yǎng)基分離計(jì)數(shù)。其中熱殺索絲菌30 ℃培養(yǎng)，其他細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間均為48 h。

1.3.2 腐敗細(xì)菌耐高溫及其產(chǎn)蛋白酶能力測定

從分離純化菌株中篩選既能夠耐受110 ℃高溫處理，同時(shí)具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力腐敗菌。

1.3.2.1 耐高溫能力測定

將分離菌株接種于無菌LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為107～108CFU/mL，經(jīng)110 ℃滅菌20 min處理后，取1 mL菌懸液，采用傾注法于37 ℃培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)，并采用微生物殘活率進(jìn)行評(píng)價(jià)[14]，按公式（1）計(jì)算。

式中：lgS為高溫處理前后菌落總數(shù)降低的對(duì)數(shù)值；N0為高溫處理前菌懸液中的微生物濃度/（CFU/mL）；N為高溫處理后菌懸液中的微生物濃度/（CFU/mL）。

1.3.2.2 耐高溫腐敗菌產(chǎn)蛋白酶能力測定

將耐高溫菌株接種于酪蛋白平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，分別測定產(chǎn)生的蛋白酶水解圈及菌落直徑，以水解圈直徑與菌落直徑比值（HC值）[15]初步確定菌株產(chǎn)蛋白酶活性的強(qiáng)弱。

1.3.3 耐高溫菌株腐敗能力測定

取干制豆桿用無菌水于20～23 ℃水溫下浸泡復(fù)水4 h，真空包裝后121 ℃高溫殺菌處理20 min，以獲得無菌供試豆桿。供試菌株接種于LB培養(yǎng)液37 ℃培養(yǎng)12 h，并用無菌水調(diào)整菌懸液濃度至106CFU/mL。將無菌豆桿置于供試菌株菌懸液中浸泡30 s，用無菌包裝袋真空包裝，即為接種處理免泡豆桿，以無菌水浸泡30 s并無菌真空包裝的豆桿為空白對(duì)照。所有樣品37 ℃貯藏至腐敗后，采集樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并測定質(zhì)構(gòu)特征參數(shù)、菌落總數(shù)及蛋白酶活力、揮發(fā)性鹽基氮、pH值等指標(biāo)，以評(píng)價(jià)菌株對(duì)免泡豆桿的腐敗能力。

1.3.3.1 感官評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)感官評(píng)價(jià)采取100 分制，參考陳平等[16]對(duì)豆桿的感官評(píng)價(jià)方法，由感官評(píng)價(jià)小組共10 人按照表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 豆桿樣品感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Dougan

1.3.3.2 質(zhì)構(gòu)特征參數(shù)測定

采用物性測定儀，測定樣品的硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠著性、耐咀性、回復(fù)性等質(zhì)構(gòu)特征指標(biāo)。每組樣品分別取3 塊，剪成2 cm×2 cm大小樣品測定，參考劉建偉等[18]方法并做修正，每塊樣品選擇5個(gè)不同位置測定。質(zhì)構(gòu)測定條件參數(shù)為：P5測試探頭，測前速率1 mm/s，測中速率0.5 mm/s，測后速率1 mm/s，應(yīng)變60%，停留間隔5 s。

1.3.3.3 菌落總數(shù)及理化指標(biāo)測定

參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[18]對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌菌落總數(shù)測定。參照GB 5009.228—2016《蛋白酶制劑》[19]進(jìn)行蛋白酶活力測定，定義40 ℃每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活單位（U）。參照GB/T 23527—2009《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[20]進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）測定。參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》[21]分別對(duì)樣品pH值進(jìn)行測定。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.3.4 耐高溫優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力的定量分析

以TVB-N產(chǎn)量因子Y（TVB-N/CFU）作為各優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力的定量指標(biāo)[22]，腐敗菌的TVB-N產(chǎn)量因子計(jì)算方法見公式（2）。

1.3.4 耐高溫優(yōu)勢腐敗菌分類鑒定

通過形態(tài)、生理生化并結(jié)合16S rRNA及gyrB基因序列對(duì)4 株優(yōu)勢腐敗細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。形態(tài)特征采用革蘭氏染色觀察法，生理生化特性利用試劑盒進(jìn)行測定。

菌株基因組DNA提?。簩⒋郎y菌株分別使用LB液體培養(yǎng)基37 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h獲得新鮮細(xì)胞懸浮液，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1 6 S r R N A擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物：2 7 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）[23]。PCR反應(yīng)體系為：Master mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL，補(bǔ)水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

gyrB基因擴(kuò)增采用簡并引物，UP1s（5’-GA A G T C A T C A T G A C C G T T C T G C A Y G C N G G N GGNAARTTYGA-3’），UP2rs（5’-AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCR TCNGTAT-3’）[24]。PCR反應(yīng)體系：Master mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL，補(bǔ)水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min[25]。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定擴(kuò)增片段長度與目的片段長度相同、無雜帶后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化并測序，將測序結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因序列同源性BLAST搜索比對(duì)，選擇相似度較高的模式菌株序列，用Clustalx 1.83與MEGA 5.1軟件，采用NJ法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)與多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 免泡豆桿中腐敗細(xì)菌的分離

從MSA、STAA、AMB、CFC、錳鹽選擇性培養(yǎng)基中，共分離出20 株菌（表2）。葡萄球菌、微球菌與熱索絲細(xì)菌分離頻率較低（0.01%），錳鹽培養(yǎng)基上芽孢桿菌分離頻率可達(dá)98.04%，其菌數(shù)對(duì)數(shù)值可達(dá)6.85～7.70（lg（CFU/g）），顯著高于其他細(xì)菌數(shù)量。第1批樣品中分離出了DY1a、DY1b兩株芽孢桿菌；第2批樣品中分離出了DY2a、DY2b、DY2c、DY2d四株芽孢桿菌；第3批樣品里分離到1株芽孢桿菌DY3。假單胞菌數(shù)最多可達(dá)5.5（lg（CFU/g）），第3批樣品里分離得到兩株假單胞菌DC3a、DC3b。氣單胞菌數(shù)量波動(dòng)較大，有1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)差距。3 個(gè)批次樣品中細(xì)菌種類相同，僅在數(shù)量上有所差異。

2.2 腐敗細(xì)菌耐高溫與產(chǎn)蛋白酶能力

2.2.1 腐敗細(xì)菌耐高溫能力

真空包裝免泡豆桿生產(chǎn)上采用90～100 ℃、30 min殺菌處理，仍有產(chǎn)品脹袋腐敗現(xiàn)象發(fā)生。因此，本研究從分離獲得的菌株篩選可耐受110 ℃高溫的耐高溫菌株。由表3可見，菌株DA1、DA2、DS1、DS2、DM1、DM3、DY1a、DY1b、DY2a、DY2c、DY2d、DY3能耐受110 ℃、20 min的高溫處理。

表3 耐高溫細(xì)菌菌株殘活率及其產(chǎn)蛋白酶能力Table 3 Residual rate and protease-producing capacity of the heat-resistant strains

2.2.2 耐高溫腐敗細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶能力

采用酪蛋白平板法對(duì)可耐受110 ℃、20 min的菌株產(chǎn)蛋白酶能力進(jìn)行測定，采用蛋白水解圈直徑與菌落直徑比值（HC值）來評(píng)價(jià)腐敗細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶能力，結(jié)果見表3。菌株DS2、DY3、DY1a、DY1b、DY2a、DY2d的HC值均高于2，菌株DY1a的HC值最高為3.15；其余菌株產(chǎn)蛋白酶能力相對(duì)較弱。

2.3 耐高溫優(yōu)勢細(xì)菌腐敗能力分析

2.3.1 感官評(píng)價(jià)

通過對(duì)菌株耐熱處理和產(chǎn)酶能力，確定12 株耐高溫優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行回接處理，驗(yàn)證其腐敗能力。

接種菌株后發(fā)生腐敗的免泡豆桿感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表4。通過觀察比較，在37 ℃貯藏至第7天時(shí)，接種DY1a、DY1b、DY3、DY2a、DS1樣品色澤暗淡，質(zhì)地變軟，表面出現(xiàn)黏液和不愉快刺激氣味等腐敗現(xiàn)象，已達(dá)到感官無法接受的程度，感官評(píng)分低于50 分；其余樣品也開始出現(xiàn)不同程度腐敗現(xiàn)象。

表4 接種腐敗細(xì)菌豆桿貯藏7 d后的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation of Dougan inoculated with the 12 heat-resistant isolates after storage at 37 ℃ for 7 days

2.3.2 質(zhì)構(gòu)特征參數(shù)

表5 接種腐敗細(xì)菌豆桿貯藏7 d后的質(zhì)構(gòu)特性Table 5 In fl uence of inoculation with the heat-resistant isolates on textural parameters of Dougan stored at 37 ℃ for 7 days

由表5可見，與對(duì)照組比較，接種DY1a、DY1b、DY2a、DY3菌株的樣品硬度顯著降低，均在815 g以下，表明接種微生物樣品的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化；與對(duì)照樣品相比，接種DY1a、DY2a菌株的樣品彈性值均降低，但與對(duì)照差異不顯著；除DY1a、DY3的內(nèi)聚性低于0.60外，其余都在其之上，樣品腐敗程度與內(nèi)聚性無顯著相關(guān)性。空白樣品的膠著性為858.73 g，而接種DS2、DY1a、DY1b、DY2a、DY3的樣品膠著性值分別為610.56、729.96、632.58、474.99、592.60 g，均顯著低于空白組，表明豆桿腐敗后膠著性降低。同樣，接種DA2、DS1、DS2、DY1a、DY1b、DY2a、DY3的樣品耐咀性低于空白組，表明腐敗導(dǎo)致耐咀性的降低。樣品回復(fù)性值介于0.13～0.31之間，差異不顯著。腐敗程度越高，其硬度、彈性、膠著性、耐咀性越低，可以看出DY1a、DY1b、DY2a、DY3腐敗較嚴(yán)重。

2.3.3 菌落總數(shù)

表6 接種腐敗細(xì)菌豆桿貯藏7 d后的菌落對(duì)數(shù)值、TVB-N、蛋白酶活力、pH值Table 6 Colony counts, TVB-N, protease activity and pH of Dougan inoculated with the heat-resistant isolates and stored at 37 ℃ for 7 days

對(duì)發(fā)生腐敗的樣品進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)，由表6可知，空白對(duì)照豆桿樣品菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值為5.86，表明樣品仍殘存有耐高溫細(xì)菌，如耐熱芽孢桿菌。而接種腐敗細(xì)菌樣品菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值均大于7.0，其中DY3、DY1a、DY1b三株菌株的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值相對(duì)較高，分別為9.60、9.48、9.41，表明這3 株菌在免泡豆桿中的生長繁殖速度相對(duì)較快，是產(chǎn)品腐敗點(diǎn)的優(yōu)勢菌，更易導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗發(fā)生。

2.3.4 TVB-N

TVB-N主要是由于腐敗菌分泌一系列胞外酶，從而引起脫氨、脫羧作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解而形成的產(chǎn)物。在富含蛋白質(zhì)的免泡豆桿中，TVB-N對(duì)產(chǎn)品腐敗程度具有重要指示意義。由表6可見，對(duì)照組樣品TVB-N為10.14 mg/100 g，除了DS1樣品外其他數(shù)值均高于對(duì)照組，即表明實(shí)驗(yàn)樣品已發(fā)生不同程度腐敗。接種DY1a、DY1b、DY2a、DY2d、DY3的樣品TVB-N均超過30 mg/100 g，即已發(fā)生腐敗的嚴(yán)重程度高于其他菌株。其中接種菌株DY1a的豆桿樣品TVB-N值最高，其次分別是DY1b、DY2a、DY3，結(jié)果與樣品感官評(píng)價(jià)基本一致。

2.3.5 蛋白酶活力

由表6可知，除了DA1、DM3外，其他接種豆桿樣品均有較高的蛋白酶活力。其中接種DY1a豆桿樣品蛋白酶最高，為926.21 U/g。其次依次是接種DY1b、DY3、DY2a、DS2、DA2、DY2c、DA1豆桿樣品。樣品蛋白酶活力越高，表明該菌株對(duì)豆桿大豆蛋白的分解能力越強(qiáng)，腐敗程度越高。

2.3.6 pH值

由表6可知，除了DA1、DA2、DS1、DS2、DM1、DY1a、DY1b、DY2a、DY2c、DY3，其他腐敗樣品的pH值均低于空白對(duì)照組。說明接種了以上菌株的腐敗樣品中蛋白質(zhì)被微生物分泌的蛋白酶類分解，產(chǎn)生的氨和胺類等堿性含氮物，使樣品pH值升高[27]。部分菌株接種樣品pH值低于未接種對(duì)照樣品，是與糖類等營養(yǎng)物質(zhì)被菌株分解代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，導(dǎo)致pH值降低有關(guān)[28]。

2.3.7 耐高溫優(yōu)勢腐敗菌致腐能力比較

表7 4 株耐高溫優(yōu)勢腐敗細(xì)菌TVB-N產(chǎn)量因子Table 7 Yield factors of TVB-N of four heat-resistant spoilage strains

由表7可知，4株腐敗菌腐敗能力大小依次為DY1a＞DY1b＞DY3＞DY2a，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。菌株DY1a、DY1b、DY2a、DY3為免泡豆桿的耐高溫優(yōu)勢腐敗菌。

2.4 腐敗細(xì)菌鑒定

2.4.1 形態(tài)特征與生理生化特性

菌株DY1a、DY1b、DY2a、DY3在PCA平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落均呈圓形或橢圓形，邊緣不規(guī)則，液體靜置培養(yǎng)有菌膜產(chǎn)生。菌株DY1a（圖1A）、DY1b（圖1B）菌落乳白色不透明，表面干燥；菌株DY2a（圖1C）、DY3（圖1D）菌落透明，外層有透明圈，表面光滑濕潤。4 株菌菌體細(xì)胞分別呈長桿和短桿狀，革蘭氏染色陽性（圖1E～圖1H）。

圖1 4 株耐高溫腐敗細(xì)菌形態(tài)特征Fig. 1 Colonial morphology and micrograph of four heat-resistant spoilage bacterial strains

表8 4 株耐高溫腐敗細(xì)菌生理生化特性Table 8 Physiological and biochemical characteristics of four heat-resistant spoilage strains

由表8可知，4 株腐敗細(xì)菌均可利用葡萄糖、側(cè)金盞醇、木糖、棉子糖，分解尿素；靛基質(zhì)、葡萄糖酸鹽、賴氨酸、鳥氨酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性；MR、VP、苯丙氨酸、硫化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陰性。菌株DY1a、DY1b不能利用山梨醇，菌株DY1a、DY2a不能利用枸櫞酸鹽。

2.4.2 16S rRNA序列分析

分別以腐敗菌株的基因組DNA模板擴(kuò)增16S rRNA的DNA片段，擴(kuò)增到大小約1 500 bp的PCR特征性條帶。4 株優(yōu)勢腐敗菌DY1a、DY1b、DY2a和DY3的16S rRNA測序結(jié)果長度分別為1 354、1 425、1 378 bp和1 398 bp。4 株菌與芽孢桿菌屬多個(gè)近緣種的16S rRNA基因相似性均在99%以上，其中菌株DY1a的16S rRNA（GenBank登錄號(hào)：KY290587）與暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis KCTC 13613）、死亡谷芽孢桿菌（B. vallismortis DSM 11031）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens NBRC 15535）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis subsp. subtilis str.168）、萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus NBRC 15539）相似性分別為99.85%、99.85%、99.78%、99.63%、99.56%；菌株DY1b的16S rRNA（GenBank登錄號(hào)：KY290588）與上述對(duì)比菌株序列相似性分別為99.44%、99.23%、99.16%、99.44%、99.23%。菌株DY2a的16S rRNA（GenBank登錄號(hào)：KY290589）與枯草芽孢桿菌（B. subtilis subsp. subtilis str.168）、莫哈韋芽孢桿菌（B.mojavensis NBRC 15718）、B. axarquiensis LMG 22476、B. malacitensis CR-95相似性分別為99.93%、99.71%、99.57%、99.71%；菌株DY3的16S rRNA（GenBank登錄號(hào)：KY290590）與上述菌株序列相似性分別為100%、99.78%、99.71%、99.78%、99.63%。

圖2 基于16S rRNA 序列的4 株腐敗細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of four spoilage bacterial strains based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，菌株DY1a、DY1b與暹羅芽孢桿菌、死亡谷芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均在同一分支；菌株DY2a、DY3與枯草芽孢桿菌、莫哈韋芽孢桿菌、B. axarquiensis、B. malacitensis聚在同一分支。細(xì)菌16S rRNA序列分析是目前確定細(xì)菌分類地位的常用分子生物學(xué)手段。由于16S rRNA的高度保守性，對(duì)相似率極高的近緣種（如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等）只能做到屬水平上的鑒定，無法進(jìn)行不同種的有效聚類區(qū)分[29-30]。本研究利用16S rRNA序列測序結(jié)果構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)其與芽孢桿菌屬的多個(gè)種相似度均在99%以上，且聚在16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，并不能與其他種的模式菌株明顯區(qū)分開，因此采用16S rRNA序列并不能將4 株腐敗芽孢桿菌準(zhǔn)確鑒定到種，不少研究者也得出了相同結(jié)論[25-26]。

2.4.3 gyrB基因序列分析

將4 個(gè)菌株的基因組DNA為模板擴(kuò)增gyrB的DNA片段，擴(kuò)增到大小約1 200 bp的PCR特征性條帶。4 株優(yōu)勢腐敗菌DY1a、DY1b、DY2a和DY3的gyrB基因測序結(jié)果長度分別為1 155、1 155、1 158 bp和1 152 bp。由圖3可知，菌株DY1a（GenBank登錄號(hào)：KY315725）、DY1b（GenBank登錄號(hào)：KY315726）與解淀粉芽孢桿菌聚在同一分支，gyrB基因序列同源性為100%；菌株DY2a（GenBank登錄號(hào)：KY315727）、DY3（GenBank登錄號(hào)：KY315728）和枯草芽孢桿菌聚在同一分支，gyrB基因序列同源性為100%。故將菌株DY1a、DY1b鑒定為解淀粉芽孢桿菌；菌株DY2a、DY3為枯草芽孢桿菌。通過16S rRNA序列很難鑒別出芽孢桿菌的近緣種，gyrB基因是編碼細(xì)菌DNA促旋酶B亞基（gyrB）的基因，進(jìn)化速率較16S rRNA基因快，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分辨率更高，可用于芽孢桿菌屬內(nèi)近緣種的分類鑒定[25-26]。通過gyrB基因序列分析能區(qū)分出枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），并將4 株腐敗芽孢桿菌準(zhǔn)確鑒定到種。

圖3 基于gyrB基因序列的4 株腐敗細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of four spoilage bacterial strains based on gyrB sequences

3 討 論

豆桿是川渝地區(qū)一種傳統(tǒng)腐竹類非發(fā)酵豆制品，目前對(duì)其腐敗微生物的分離鑒定及其腐敗能力的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用選擇性培養(yǎng)基從四川隆昌免泡豆桿腐敗樣品中分離純化到20 株細(xì)菌，其中12 株能夠耐受110 ℃、20 min高溫處理，且產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)。將其接種到無菌免泡豆桿中進(jìn)行腐敗能力分析比較，結(jié)果表明導(dǎo)致豆桿發(fā)生嚴(yán)重腐敗的4 株優(yōu)勢腐敗菌均為芽孢桿菌。目前國內(nèi)外研究結(jié)果表明，耐熱性芽孢細(xì)菌是非發(fā)酵豆制品主要腐敗菌，主要來源于加工原料[9-10]。此外在各類腐敗樣品中還存在成團(tuán)腸桿菌、溶酪葡萄球菌、戊糖片球菌等非耐熱細(xì)菌[4-11]，由于豆制品加工過程高溫煮漿會(huì)將大部分非耐熱菌殺死，而這類細(xì)菌主要來源于生產(chǎn)、包裝、儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)的二次污染[10]，只要嚴(yán)格保證生產(chǎn)各環(huán)節(jié)環(huán)境衛(wèi)生和工藝要求，基本上可避免非耐熱菌導(dǎo)致的腐敗現(xiàn)象。而來自原料的耐熱性芽孢桿菌在常規(guī)殺菌條件下很難將其徹底殺死，而采用較強(qiáng)的殺菌條件雖能減少耐熱腐敗菌的殘留，但會(huì)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)帶來嚴(yán)重破壞，影響感官品質(zhì)。因此耐熱性芽孢類腐敗菌的殺菌控制是保證免泡豆桿貯藏品質(zhì)與安全的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。目前控制豆制品微生物污染方法主要有高熱殺菌和化學(xué)防腐劑處理，考慮維持產(chǎn)品口感與營養(yǎng)成分，應(yīng)結(jié)合非熱殺菌技術(shù)進(jìn)行處理來控制其中的耐熱芽孢類細(xì)菌。

隆昌豆桿以其筋道細(xì)膩的口感深受消費(fèi)者歡迎。豆制品貯藏過程不僅會(huì)發(fā)生主要營養(yǎng)物質(zhì)成分的變化，還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性變化，喪失原有產(chǎn)品良好的口感，感官品質(zhì)下降[28]。本研究在感官評(píng)價(jià)結(jié)果基礎(chǔ)上，對(duì)接種腐敗菌豆桿樣品的質(zhì)構(gòu)特性測定結(jié)果表明，主要腐敗菌導(dǎo)致豆桿硬度、彈性、膠著性、耐咀性等顯著降低，與感官評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)樣品硬度降低、彈性下降，黏度增加等腐敗現(xiàn)象及程度相符，表明產(chǎn)品硬度、彈性、膠著性和耐咀性與免泡豆桿腐敗后感官品質(zhì)存在一定的相關(guān)性，可與主觀感官評(píng)價(jià)手段相結(jié)合評(píng)價(jià)免泡豆桿品質(zhì)的優(yōu)劣。

4 結(jié) 論

導(dǎo)致免泡豆桿腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗細(xì)菌均為芽孢桿菌屬，包括2 株解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和2 株枯草芽孢桿菌（B. subtilis）。4 株腐敗芽孢桿菌均具有較強(qiáng)的耐高溫和產(chǎn)蛋白酶能力，可引起免泡豆桿TVB-N和pH值升高，導(dǎo)致產(chǎn)品硬度、彈性、膠著性、耐咀性降低，其中解淀粉芽孢桿菌DY1a對(duì)免泡豆桿腐敗能力最強(qiáng)。

[1] 常銀生. 豆棒的加工[J]. 食品工業(yè)科技, 1984, 6(2): 32-33.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.1984.02.007.

[2] 汪立平, 張慶華, 趙勇, 等. 變質(zhì)豆?jié){中腐敗微生物的分離與初步鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2007, 34(4): 621-624. DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2007.04.001.

[3] 袁春紅, 張慶, 向文良, 等. 豆腐干優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定及腐敗特性分析[J]. 食品科技, 2014, 39(1): 312-316.

[4] 李博. GDL豆腐中的主要腐敗菌的研究及HACCP的建立[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2001: 1-3.

[5] 范文教, 孫俊秀, 陳云川, 等. 環(huán)境因子對(duì)豆腐特定腐敗菌消長特性的影響[J]. 食品與機(jī)械, 2014, 30(5): 100-102. DOI:10.13652/i.issn.1003-5788.2014.05.020.

[6] 胡耀輝, 徐云, 于寒松, 等. 北豆腐中主要腐敗微生物的分離與鑒定[J].糧油加工, 2010(9): 108-110.

[7] 楊明, 陳信宇, 張輝, 等. 豆腐致腐細(xì)菌的分離鑒定及控制研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(12): 218-221. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.039.

[8] ROSSI F, FELIS G E, MARTINELLI A, et al. Microbiological characteristics of fresh Tofu produced in small industrial scale and identification of specific spoiling microorganisms (SSO)[J]. LWTFood Science and Technology, 2016, 70: 280-285. DOI:10.1016/j.lwt.2016.02.057.

[9] 王敏, 檀新建, 路玲, 等. 非發(fā)酵豆制品主要腐敗菌的分離鑒定[J]. 中國釀造, 2006, 35(21): 68-70. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2006.06.022.

[10] 歐杰, 李曉蓓, 胡潔云, 等. 傳統(tǒng)豆制品白干與薄百葉中優(yōu)勢腐敗菌的分離與初步鑒定[J]. 大豆科學(xué), 2012, 31(1): 119-123.DOI:10.3969/j.issn.1000-9841.2012.01.027.

[11] 關(guān)統(tǒng)偉, 趙輝平, 張鳳芳, 等. 傳統(tǒng)豆腐干中主要腐敗菌的分離及其系統(tǒng)發(fā)育[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2013, 49(4): 18-20. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2013.04-005.

[12] 李平蘭, 賀稚非. 食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M]. 2版. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 222-224.

[13] 夏秀東, 劉小莉, 王英, 等. 白魚腐敗細(xì)菌的分離與鑒定[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(21): 175-179. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201521033.

[14] 林偉靜, 劉紅芝, 劉麗, 等. 超高壓處理對(duì)杏汁殺菌效果和品質(zhì)的影響[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2015, 15(10): 157-162. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.10.021.

[15] 馬桂珍, 暴增海, 王淑芳, 等. 高產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離篩選及其種類鑒定[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(21): 183-187.

[16] 陳平, 胡潔云, 嚴(yán)維凌, 等. 傳統(tǒng)非發(fā)酵豆制品貯藏過程中微生物變化及預(yù)測模型初建[J]. 大豆科學(xué), 2012, 31(5): 834-837; 841.DOI:10.3969/j.issn.1000-9841.2012.05.032.

[17] 臧茜茜, 吳婧, 潘思軼, 等. 蛋白及脂肪含量對(duì)腐竹差異成膜的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(6): 129-135. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.6.021.

[18] 衛(wèi)生部. 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定: GB 4789.2—2010[S].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[19] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 蛋白酶制劑:GB/T 23527—2009[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

[20] 衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定: GB 5009.228—2016[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2016.

[21] 衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). 食品pH值的測定: GB 5009.237—2016[S].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2016.

[22] 許振偉, 李學(xué)英, 楊憲時(shí), 等. 海水魚優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力分析[J]. 食品與機(jī)械, 2011, 27(4): 71-74. DOI:10.3969/j.issn.1003-5788.2011.04.019.

[23] 劉麗莎, 彭義交, 鮑魯生, 等. 大豆浸泡過程中腐敗微生物對(duì)豆?jié){品質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(14): 161-164. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201514031.

[24] YAMAMOTO S, HARAYAMA S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains[J].Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61: 1104-1109.

[25] 王亞會(huì), 孟祥坤, 劉永鋒, 等. 八株芽孢桿菌的鑒定及其生物活性差異比較[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 376-384. DOI:10.16409/j.cnki.2095-039x.2014.03.013.

[26] 鄭潔, 孟佑婷, 方瑤瑤, 等. 一株錳氧化細(xì)菌的分離、鑒定及其錳氧化特性[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2016, 56(11): 1699-1708. DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20160029.

[27] 黃林, 陳全勝, 張燕華, 等. 冷卻豬肉優(yōu)勢腐敗菌分離鑒定及致腐能力測定[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(1): 205-209.

[28] 卜宇芳, 李文強(qiáng), 謝靈來, 等. 休閑豆腐干貯藏過程中品質(zhì)變化研究[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(2): 115-118. DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2016.02.030.

[29] WANG L, LEE F, TAI C, et al. Comparison of gyrB gene sequences,16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 1846-1850. DOI:10.1099/ijs.0.64685-0.

[30] 曹鳳明, 楊小紅, 馬鳴超, 等. 枯草芽孢桿菌近緣種群鑒定方法研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2014, 41(5): 968-974. DOI:10.13344/j.microbiol.china.13042.

Isolation, Identif i cation and Evaluation of Dominant Spoilage Bacteria from Vacuum-Packaged Nonrehydrated Dougan, a Chinese Traditional Rod-Shaped Soybean Product Prepared with Protein-Lipid Film

ZHENG Lijun, SHEN Guanghui*, ZHANG Zhiqing, LI Chenfeng, CHEN Anjun, LI Shanshan, WU Hejun, LUO Songming
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The purpose of this study was to isolate and identify the bacteria responsible for spoilage of vacuum-packaged nonrehydrated Dougan (a Chinese traditional rod-shaped soybean product prepared with protein-lipid fi lm) and to evaluate the spoilage potential of the heat-resistant bacteria. The bacteria were isolated using various selective media. The dominant spoilage bacteria were identif i ed by morphological observation, physiological and biochemical characterization, and 16S rRNA and gyrB gene sequence analysis. The heat-resistant spoilage bacteria with higher protease-producing capacity were inoculated into sterilized Dougan to evaluate the spoilage potential according to the sensory quality, textural properties,total volatile basic nitrogen (TVB-N) content, protease activity and pH of Dougan. A total of 20 bacterial strains were isolated from spoiled nonrehydrated Dougan, and among these isolates, 12 strains with higher protease-producing capacity could survive autoclaving at 110 ℃ for 20 min. The Dougan inoculated with strains DY1a, DY1b, DY2a and DY3 showed obvious signs of spoilage after storage at 37 ℃ for 7 days. The TVB-N, protease activity and pH value of the inoculated samples were signif i cantly higher than those of the non-inoculated control. Texture prof i le analysis indicated that hardness, springiness, gumminess and chewiness of the inoculated sample decreased significantly compared with control samples. All four specif i c spoilage bacteria belonged to the Bacillus genus. According to the TVB-N yield factors(Y (TVB-N/CFU) values), the spoilage potential of B. amyloliquefaciens DY1a was the strongest among the spoilage bacteria isolated, followed subsequently by B. amyloliquefaciens DY1b, B. subtilis DY2a and B. subtilis DY3.

nonrehydrated Dougan; Bacillus spp.; gyrB gene; spoilage capability; textural properties

10.7506/spkx1002-6630-201802028

TS254.4

A

1002-6630（2018）02-0177-08

2017-02-14

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)校企合作項(xiàng)目（060H0301）；四川省教育廳川菜發(fā)展研究中心重點(diǎn)規(guī)劃項(xiàng)目（CC2017Z01）；

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“雙支計(jì)劃”項(xiàng)目（03572107）

鄭麗君（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：ZhengLiJJJ@163.com

*通信作者簡介：申光輝（1985—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：shenghuishen@163.com

鄭麗君, 申光輝, 張志清, 等. 真空包裝免泡豆桿優(yōu)勢腐敗細(xì)菌分離鑒定及其致腐能力分析[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2):177-184.

10.7506/spkx1002-6630-201802028. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Lijun, SHEN Guanghui, ZHANG Zhiqing, et al. Isolation, identification and evaluation of dominant spoilage bacteria from vacuum-packaged nonrehydrated Dougan, a Chinese traditional rod-shaped soybean product prepared with protein-lipid fi lm[J]. Food Science, 2018, 39(2): 177-184. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802028. http://www.spkx.net.cn