孟憲欣，葛吉生，王希柳，王晨宇，馬延超

MENG Xian-xin1，GE Ji-sheng1，WANG Xi-liu1，WANG Chen-yu2，MA Yan-chao3

隨意跑輪運動預適應對實驗性潰瘍性結腸炎小鼠結腸miR-214/PTEN信號環(huán)路的影響

孟憲欣1，葛吉生1，王希柳1，王晨宇2，馬延超3

MENG Xian-xin1，GE Ji-sheng1，WANG Xi-liu1，WANG Chen-yu2，MA Yan-chao3

目的：觀察8周隨意跑輪運動預適應對葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的C57BL/6小鼠實驗性潰瘍性結腸炎（UC）的影響，并探討miR-214/PTEN信號環(huán)路在其間的可能作用機制。方法：40只雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組：安靜組對照組（SED-CON）、安靜組造模組（SED-DSS）、運動對照組（EXE-CON）、運動造模組（EXE-DSS）。SED-CON組和SED-DSS組大鼠安靜飼養(yǎng)8周，EXE-CON組和EXE-DSS組進行8周隨意跑輪運動。隨后各造模組自由飲用3.5% DSS溶液誘導小鼠UC模型，各對照組自由飲用同等量的蒸餾水。每天觀察并記錄體重和疾病活動指數（DAI），7天后處死小鼠，取結腸觀察組織病理學變化并進行組織損傷評分，檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、miR-214、PTEN、STAT3和Akt基因表達量以及NF-κB活性。結果：與SED-DSS組比較，EXE-DSS組小鼠臨床癥狀改善（即體重增加、DAI降低、促炎癥因子表達下調、結腸組織損傷減輕）。分子生物學測定發(fā)現：與SED-DSS組比較，EXE-DSS組miR-214，Akt、STAT3、IL-6表達量以及NF-κB活性降低（P＜0.05），PTEN mRNA和蛋白表達量升高（P＜0.05）。結論：長期隨意跑輪運動預適應能夠對DSS誘導的C57BL/6小鼠實驗性UC起保護效應，其機制可能與部分恢復miR-214/PTEN信號環(huán)路功能有關。

運動預適應；潰瘍性結腸炎；微小核糖核酸-214；PTEN；炎癥反應；信號通路

炎癥性腸病（inf l ammatory bowel disease，IBD）是一組病因和發(fā)病機制尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn’s disease，CD）兩大類［35］。UC為IBD中常見類型，以結腸黏膜慢性炎癥、潰瘍形成和出血為主要病理特點，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便等為主要臨床癥狀，其病程緩慢、反復發(fā)作、輕重不一，長期不愈可發(fā)展為結直腸癌［10］，嚴重影響患者的健康與生活質量并增加社會醫(yī)療資源負擔［21］。UC作為一種特發(fā)性疾?。╥diopathic disorder），環(huán)境與遺傳因素的相互作用以及腸道微生物代謝紊亂，從而破壞腸道生物屏障，引發(fā)炎癥反應，此為UC的主要發(fā)病機制。針對UC目前尚無有效的根治手段，臨床治療主要包括藥物和手術，但效果并不理想，且副作用大易復發(fā)［45］。因此，深入研究UC的關鍵機制，尋找干預靶點，探索作用持久且副作用小的治療策略以減輕UC癥狀、降低住院率和癌變風險進而改善患者生活質量是亟待解決的課題。

微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一類大小為18～25 bp高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，miRNAs接受大量轉錄因子調控，通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）片段互補或部分互補，引起靶基因mRNA的降解或抑制其翻譯，廣泛負調控靶基因表達，調節(jié)生命活動和疾病發(fā)生［46］。每種miRNA可調節(jié)數百種mRNA的表達，對超過1/3的蛋白編碼基因進行轉錄后調控，廣泛參與個體發(fā)育、細胞增殖、分化、炎性反應、纖維化和凋亡等過程，可能導致人類多種疾病，如腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病、心血管疾病和肝臟疾病等。最近的一項研究發(fā)現［42］，UC患者MicroRNA-214（miR-214）表達水平上調并通過抑制PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， 10號染色體有缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白）而激活Akt/核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）/白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）/信號轉導和轉錄活化蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）——（Akt/NF-κB/IL-6/STAT3）炎癥信號通路，STAT3作為miR-214的轉錄因子反過來又進一步促進miR-214表達，這一信號環(huán)路在UC發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

規(guī)律運動可通過抗炎機制對諸多慢性炎癥相關疾病產生輔助治療或預防作用［11，23，24］。我們前期的研究發(fā)現［4-7］，有氧運動可下調緩解期UC患者炎癥因子，提示運動改善UC與抑制炎癥反應有關。運動抗炎效應的具體分子機理尚未明確。本研究基于前期工作，以炎癥反應及miR-214/PTEN信號環(huán)路對UC的調控為切入點，從整體、器官、細胞、分子、基因等多個層面觀察并探討8周隨意跑輪運動預適應對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導C57BL/6小鼠實驗性UC的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡清潔級健康雄性C57BL/6小鼠40只，反相明暗周期（reverse light-dark cycle）飼養(yǎng)，自由進食水。適應環(huán)境1周后先隨機分為4組（每組n＝10）：1）安靜對照組（sedentary control，SED-CON），安靜飼養(yǎng)8周后自由飲用蒸餾水7天；2）安靜 造模組（sedentary DSS，SED-DSS），安靜飼養(yǎng)8周后自由飲用3.5% DSS溶液7天進行UC造模；3）運動對照組（exercise control，EXE-CON），進行8周隨意跑輪運動后自由飲用蒸餾水7天；4）運動造模組（exercise DSS，EXEDSS），進行8周隨意跑輪運動后自由飲用3.5% DSS溶液7 d進行UC造模。末次實驗結束后48 h取材。

1.2 運動預適應方案

各運動組（EXE-CON組、EXE-DSS組）放于含有跑輪的飼養(yǎng)籠內進行8周隨意跑輪運動，5天/周（休息日將跑輪固定），不控制運動強度和運動時間。各對照組（SED-CON組和SED-DSS組）大鼠安靜飼養(yǎng)8周。

1.3 UC造模方法

稱取3.5 g DSS粉末溶于100 mL雙蒸水中制備3.5%DSS溶液。各模型組（SED-DSS組、EXE-DSS組）動物自由飲用3.5% DSS溶液7 d誘導小鼠實驗性UC模型，相應對照組（SED-CON組、EXE-CON組）自由飲用同等量的蒸餾水溶液。

1.4 一般情況觀察與取材

造模過程中，每日觀察小鼠精神、活動、毛發(fā)、飲食等一般情況，詳細記錄每只小鼠的體重變化、大便性狀以及隱血情況（大便隱血采用聯苯胺法檢測）。參照Cooper等［18］的經典評分方法，將體重下降、大便性狀和便血情況的評分相加后取平均數，作為UC疾病活動指數（disease activity index，DAI），即DAI=（體重下降分數+大便性狀分數+便血情況分數）/3。實驗結束后處死動物，取整段結腸（回盲部至肛門），測量全結腸長度（精確至0.1 cm）。取部分結腸進行組織病理學觀察，剩余結腸組織用預冷PBS沖洗干凈后，迅速置于液氮中，然后轉入－80 ℃低溫冰箱保存待測基因表達。

1.5 組織病理學觀察與組織損傷評分

取結腸沿腸系膜縱向剖開，用預冷無菌生理鹽水沖洗干凈后，經4%甲醛固定、包埋、切片（4 μm）后行HE染色。光鏡下觀察腸黏膜損傷情況（組織結構改變，隱窩損壞程度及丟失情況，炎性細胞浸潤等），參照Cooper等［18］的經典組織損傷分級標準，對結腸病變進行組織損傷評分。

1.6 mRNA表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR檢測結腸炎癥因子和PTEN mRNA表達。結腸組織勻漿后，用Trizol試劑盒（Qiagen，德國）提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性、分光光度計檢測RNA純度（A260/A280在1.9～2.2 ）和濃度。取總RNA 2 μg利用逆轉錄試劑盒（Qiagen，德國）進行逆轉錄生成cDNA。用實時熒光定量PCR儀（7300HT Fast，ABI美國）分別檢測白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和PTEN以及β-actin（內參基因）mRNA表達水平。引物序列見表1所示。PCR采用反應體系為（10 μL）：上下游引物各0.4 μL，cDNA 1.5 μL，雙蒸水7.7 μL。反應參數為：預變性95℃ 1 min；95℃ 15 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。記錄循環(huán)數（Ct值），基因表達的擴增倍數以2-△Ct表示，△Ct=Ct目的基因－Ctβ-actin，計算相對表達量（SED-CON組的倍數）。

表1 基因引物序列Table 1 Gene Primer Sequence

1.7 miR-214表達量檢測

參照文獻［8］，采用miRNA專用試劑盒（Sigma公司，美國）提取結腸總RNA。取2 μg總RNA利用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Sigma公司，美國）逆轉錄為cDNA，反應條件：37 ℃反應1 h后95 ℃加熱5 min滅活逆轉錄酶。采用SYBR Premix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）試劑盒（Sigma公司，美國）用實時熒光定量PCR儀（7300HT Fast，ABI美國）檢測miR-214的表達量。反應體系為20 μL：SYBR混合試劑10 μL，引物2 μL（引物序 列：5’-TAAGGCACGGTGAATGCC-3’），c DNA 1 μL，Nuclease-Free Water 7 μL；反應條件：95 ℃ 10 min，（95 ℃10 s、60 ℃ 1 min），共40個循環(huán)，使 用U6（引物序 列：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’）作為內參。應用Ct值法計算目的基因的表達量（2-△△Ct）。

1.8 蛋白表達水平檢測

采用Western Bolt法檢測結腸蛋白表達水平。結腸組織勻漿后，提取總蛋白，用考馬斯亮蘭法測定蛋白含量。蛋白樣品經15% SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜。一抗（IL-1β、IL-6、TNF-α、p-STAT3、STAT3、p-Akt、Akt、p-PTEN和PTEN）（注：“p-”為該蛋白的磷酸化形式）（Santa cruz公司）孵育過夜，HRP標記二抗（TBD公司）孵育1 h，ECL顯影。采用凝膠系統(tǒng)分析軟件掃描各條帶灰度值，以β-actin為內參蛋白，計算相對表達量（SED-CON組的倍數）。

1.9 NF-κB活性檢測

結腸組織勻漿后，用Nuclear Extract Kit（美國Pierce公司）提取核蛋白，考馬斯亮蘭法測定蛋白含量。參照文獻［2，3］，利用TransAMTMNF-κB p65活性檢測試劑盒（Sigma公司）檢測NF-κB p65與DNA結合活性，其中一抗（NF-κB p65 抗體）（1:1 000）孵育過夜，HRP標記二抗孵育1 h，用450 nm波長吸光度值表示NF-κB活性（OD 450 nm）。

1.10 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析。所有數據以“均數±標準差”表示。采用雙因素方差分析進行主效應和交互作用（運動×模型）檢驗，多重比較使用LSD檢驗。統(tǒng)計學檢驗水準為P＝0.05。

2 結果

由于造模失敗、運動過程中拒跑、死亡等原因，共剔除2只動物，最終納入統(tǒng)計的小鼠為38只，各組樣本量分別為：SED-CON組（n＝10）、SED-DSS組（n＝10）、EXE-CON組（n＝9）、EXE-DSS組（n＝9）。

2.1 臨床癥狀的變化

體重：主效應（F造模＝860.544，P＝0.000；F運動＝28.257，P＝0.000）以及交互作用（F造?！吝\動＝140.908，P＝0.000）對體重的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，造模過程中SED-DSS組體重低于SED-CON組（P＝0.000），而EXE-DSS組則高于SED-DSS組（P＝0.015，圖1a）。

圖1 造模期間大鼠體重 （a） 、DAI（b） 以及造模后大鼠結腸長度 （c） 的變化Figure 1. Change of Body Weight （a），DAI （b） during Modelling and Length of Colon （c） after Modelling

DAI：造模前，各組DAI均為0。造模期間，SED-CON和EXE-CON組DAI均為0；SED-DSS組出現典型的UC臨床表現（第4天開始出現體重下降，第3天開始出現腹瀉、直腸出血，第5天后所有小鼠均出現腹瀉和直腸出血；小鼠蜷縮少動，皮毛凌亂，無光澤，精神萎靡），EXE-DSS組小鼠的生長狀況、毛色、精神及活動度較SED-DSS組健康，其腹瀉、便血癥狀均有不同程度的減輕。統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝4259.328，P＝0.000；F運動＝43.387，P＝0.000）以及交互作用（F造?！吝\動＝43.387，P＝0.000）對DAI的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，造模過程中SED-DSS組DAI高于SED-CON組（P＝0.000），而EXE-DSS組則低于SEDDSS組（P＝0.003，圖1b）。

結腸長度：各組結腸長度分別為SED-CON組（7.81±1.12 cm）、EXE-CON組（7.93±1.50 cm）、SED-DSS組（6.11±0.79 cm）和EXE-DSS組（7.69±0.98 cm）；統(tǒng)計結果顯示，造模主效應（F造模＝11.394，P＝0.002）對體重的影響具有統(tǒng)計學意義，運動主效應F運動＝0.642，P＝0.428）以及交互作用（F造?！吝\動＝0.317，P＝0.577）則無統(tǒng)計學差異；多重比較顯示，SED-DSS組結腸長度低于SED-CON組（P＝0.009），而SED-DSS和EXE-DSS組則無顯著性差異（P＝0.354，圖1c）。

2.2 組織病理學改變與結腸組織損傷評分

結腸病理學改變見圖2。SED-CON和EXE-CON組結腸黏膜結構完整，上皮細胞排列規(guī)則，腺體完整，隱窩正常，無充血水腫、糜爛潰瘍及炎癥細胞浸潤等炎癥性病變。SED-DSS組黏膜缺失，腺體多數不完整，隱窩破壞，炎癥細胞廣泛浸潤，呈典型炎癥改變。與SED-DSS組比較，EXEDSS組表現為炎癥浸潤減輕、上皮損傷以及黏膜隱窩破壞減少。

結腸組織損傷評分見圖3。各組結腸組織損傷評分分別為SED-CON組0.11±0.03、EXE-CON組0.15±0.05、SEDDSS組2.81±0.79和EXE-DSS組1.90±0.88；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝177.745，P＝0.000；F運動＝5.298，P＝0.028）以及交互作用（F造模×運動＝7.200，P＝0.011）對結腸組織損傷評分的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，SED-DSS組結腸組織損傷評分高于SED-CON組（P＝0.000），而EXEDSS組則低于SED-DSS組（P＝0.002）。

2.3 結腸炎癥因子基因表達的變化

各組結腸IL-1β mRNA表達量分別為SED-CON組1.00±0.38、EXE-CON組1.04±0.25、SED-DSS組2.89±0.59和EXE-DSS組2.15±0.43；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝118.413，P＝0.000；F運動＝6.503，P＝0.015）以及交互作用（F造模×運動＝7.975，P＝0.008）對結腸IL-1β mRNA表達量的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，SED-DSS組結腸IL-1β mRNA表達量高于SED-CON組（P＝0.000），而EXE-DSS組則低于SED-DSS組（P＝0.001，圖4a）。

圖2 結腸組織病理學觀察 （HE染色，×200）Figure 2. Histopathology of Colon （HE staining，×200）

圖3 結腸組織損傷評分Figure 3. Tissue Damage Score of Colon

各組結腸IL-6 mRNA表達量分別為SED-CON組1.00±0.26、EXE-CON組1.07±0.19、SED-DSS組7.95±2.18和EXE-DSS組6.15±1.82；統(tǒng)計結果顯示，模型主效應（F造模＝177.889，P＝0.000）以及交互作用（F造?！吝\動＝4.277，P＝0.046）對結腸IL-6 mRNA表達量的影響均有統(tǒng)計學意義，而運動主效應（F運動＝3.660，P＝0.064）則無統(tǒng)計學差異；多重比較顯示，SED-DSS組結腸IL-6 mRNA表達量高于SED-CON組（P＝0.000），而EXE-DSS組則低于SED-DSS組（P＝0.010，圖4b）。

各組結腸TNF-α mRNA表達量分別為SED-CON組 1.01±0.22、EXE-CON 組 1.05±0.29、SED-DSS 組5.77±1.65和EXE-DSS組5.32±2.30；統(tǒng)計結果顯示，模型主效應（F造模＝101.804，P＝0.000）對結腸TNF-α mRNA表達量的影響有統(tǒng)計學意義，而運動主效應（F運動＝0.208，P＝0.651）以及交互作用（F造?！吝\動＝0.322，P＝0.574）則無統(tǒng)計學差異；多重比較顯示，SEDDSS組結腸TNF-α mRNA表達量高于SED-CON組（P＝0.000），而EXE-DSS組與SED-DSS組則無顯著性差異（P＝0.485，圖4c）。

各組結腸IL-1β蛋白表達量分別為SED-CON組1.00±0.23、EXE-CON組0.94±0.27、SED-DSS組3.27±0.82和EXE-DSS組2.94±0.77；統(tǒng)計結果顯示，模型主效應F造模＝129.687，P＝0.000對結腸IL-1β蛋白表達量的影響有統(tǒng)計學意義，但運動主效應（F運動＝1.139，P＝0.293）以及交互作用（F造?！吝\動＝0.537，P＝0.469）則無統(tǒng)計學差異；多重比較顯示，SED-DSS組結腸IL-1β蛋白表達量高于SED-CON組（P＝0.000），而EXE-DSS組與SED-DSS組則無顯著性差異（P＝0.223，圖5a）。

各組結腸IL-6蛋白表達量分別為SED-CON組1.01±0.38、EXE-CON組0.98±0.33、SED-DSS組6.83±1.83和EXE-DSS組4.37±1.76；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝ 126.821，P＝0.000；F運動＝9.198，P＝0.005）以及交互作用（F造?！吝\動＝8.823，P＝0.005）對結腸IL-6蛋白表達量的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，SED-DSS組結腸IL-6蛋白表達量高于SED-CON組（P＝0.000），而EXEDSS組則低于SED-DSS組（P＝0.000，圖5b）。

各組結腸TNF-α蛋白表達量分別為SED-CON組1.00±0.37、EXE-CON組0.96±0.29、SED-DSS組3.22±1.06和EXE-DSS組2.99±0.77；統(tǒng)計結果顯示，模型主效應（F造模＝91.073，P＝0.000）對結腸TNF-α蛋白表達量的影響有統(tǒng)計學意義，而運動主效應（F運動＝0.358，P＝0.554）以及交互作用（F造?！吝\動＝0.176，P＝0.677）則無統(tǒng)計學差異；多重比較顯示，SED-DSS組結腸TNF-α蛋白表達量高于SED-CON組（P＝0.000），而EXE-DSS組與SED-DSS組則無顯著性差異（P＝0.484，圖5c）。

圖4 IL-1β（a）、IL-6（b）和TNF-α（c）mRNA表達量Figure 4. IL-1β （a），IL-6 （b） and TNF-α （c） mRNA Expression

圖5 IL-1β（a）、IL-6（b）和TNF-α（c）蛋白表達量Figure 5. IL-1β （a），IL-6 （b） and TNF-α （c） Protein Expression

2.4 miR-214/PTEN信號環(huán)路中各信號分子基因表達變化

圖6 miR-214/PTEN信號環(huán)路中miR-214（a）、PTEN（b、c）、Akt（d）、NF-κB（e）和STAT3（f）表達量的變化Figure 6. Expression of miR-214 （a），PTEN （b，c），Akt （d），NF-κB （e） and STAT3 （f） in miR-214/PTEN Signal Circuit Pathway

各組結腸miR-214表達量分別為SED-CON組 1.01±0.20、EXE-CON 組 0.75±0.13、SED-DSS 組5.33±1.41和EXE-DSS組3.95±1.21；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝161.720，P＝0.000；F運動＝7.725，P＝0.009）以及交互作用（F造?！吝\動＝3.591，P＝0.047）對結腸miR-214表達量的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，SED-DSS組結腸miR-214表達量高于SED-CON組（P＝0.000），而EXEDSS組則低于SED-DSS組（P＝0.003，圖6a）。

各組結腸PTEN mRNA表達量分別為SED-CON組1.01±0.13、EXE-CON組0.99±0.22、SED-DSS組0.49±0.11和EXE-DSS組（0.72±0.10）；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝67.425，P＝0.000；F運動＝4.563，P＝0.040）以及交互作用（F造?！吝\動＝6.650，P＝0.014）對結腸PTEN mRNA表達量的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，SED-DSS組結腸PTEN mRNA表達量低于SED-CON組（P＝0.000），而EXEDSS組則高于SED-DSS組（P＝0.013，圖6b）。

各組結腸PTEN蛋白（p-PTEN/PTEN）表達量分別為SED-CON組1.00±0.50、EXE-CON組1.05±0.29、SED-DSS組0.51±0.14和EXE-DSS組0.86±0.11；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝12.856，P＝0.001；F運動＝4.234，P＝0.047）對結腸PTEN蛋白表達量的影響均有統(tǒng)計學意義，但交互作用（F造模×運動＝2.501，P＝0.123）無顯著性差異；多重比較顯示，SED-DSS組結腸PTEN蛋白表達量低于SED-CON組（P＝0.001），而EXE-DSS組則高于SED-DSS組（P＝0.017，圖6c）。

各組結腸Akt蛋白表達量（p-Akt/Akt）分別為SEDCON組 1.00±0.35、EXE-CON組 1.04±0.23、SED-DSS組5.70±1.65和EXE-DSS組3.78±1.31；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝119.947，P＝0.000；F運動＝7.774，P＝0.009）以及交互作用（F造?！吝\動＝8.356，P＝0.007）對結腸Akt蛋白表達量的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，SED-DSS組結腸Akt蛋白表達量高于SED-CON組（P＝0.000），而EXEDSS組則低于SED-DSS組（P＝0.000），圖6d）。

各組結腸NF-κB活性分別為SED-CON組0.30±0.09、EXE-CON組0.24±0.11、SED-DSS組0.88±0.11和EXE-DSS組0.68±0.18；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝154.389，P＝0.000；F運動＝9.975，P＝0.003）對結腸NF-κB活性表達量的影響有統(tǒng)計學意義，但交互作用（F造?！吝\動＝2.703，P＝0.109）并無顯著性差異；多重比較顯示，SED-DSS組結腸NF-κB活性高于SED-CON組（P＝0.000），而EXE-DSS組則低于SED-DSS組（P＝0.002），圖6e）。

各組結腸STAT3蛋白表達量（p-STAT3/ STAT3）分別為SED-CON組1.00±0.31、EXE-CON組1.03±0.20、SED-DSS組7.70±0.93和EXE-DSS組6.41±1.41；統(tǒng)計結果顯示，主效應（F造模＝488.365，P＝0.000；F運動＝5.275，P＝0.028）以及交互作用（F造?！吝\動＝5.795，P＝0.022）對結腸STAT3蛋白表達量的影響均有統(tǒng)計學意義；多重比較顯示，SED-DSS組結腸STAT3蛋白表達量高于SEDCON組（P＝0.000），而EXE-DSS組則低于SED-DSS組（P＝0.003，圖6f）。

3 討論

本研究成功建立DSS誘導實驗性UC模型并發(fā)現，8周隨意跑輪運動預適應能夠減輕UC小鼠促炎癥因子過表達并改善臨床癥狀，其機制可能與下調miR-214、上調PTEN表達并部分恢復miR-214/PTEN信號轉導環(huán)路功能有關。

3.1 隨意跑輪運動對UC的保護效應

有關運動與UC關系中，病例對照研究顯示，體力活動減少是UC的重要危險因素［14，25，43］，但前瞻性研究結論并不一致。人體研究認為，運動可緩解UC病情［4-7，19，20，29］或無明顯作用［15，27，40］；動物實驗發(fā)現，中等強度跑臺運動（強制運動）［13］和隨意跑輪運動［17，33，44］均可減輕三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）誘導的大鼠結腸炎癥狀并降低炎癥因子表達，而Cook等［17］和Allen等［9］以DSS誘導UC小鼠為模型，發(fā)現強制運動加重結腸炎病情、上調炎癥因子表達并增加死亡率，而隨意跑輪運動則減輕患鼠癥狀并下調炎性介質，其機制可能與不同運動方式對腸道菌群的調控存在差異有關。研究結論不一致甚至相互矛盾可能與受試對象、動物造模、運動方式、運動強度、遺傳因素以及運動時疾病是否處于活動期有關。Nathan等［39］提出，有氧運動可作為UC患者緩解期非藥物治療的重要手段，然而，針對UC患者的最佳的運動處方至今仍未確定［12］。由于隨意運動對于實驗性UC小鼠的療效較為肯定，因此本研究采用該運動方式，結果發(fā)現，與SED-CON組比較，SED-DSS組動物表現出腹瀉、血便、體重下降等癥狀，結腸組織病理學觀察可見黏膜糜爛、潰瘍形成、隱窩結構受損、炎癥浸潤等，DAI評分與組織病理學評分升高、炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表達上調，提示DSS造模成功；經過8周運動預適應再進行UC造模發(fā)現，與SED-DSS組比較，EXE-DSS組小鼠癥狀和組織病理學變化減輕，DAI評分與組織病理學評分下降，炎癥因子表達下調，說明8周隨意跑輪運動預適應對DSS誘導的UC模型具有保護效應，這與課題組前期的研究［1，4-7］以及前人的研究［4-7，13，17，19，20，29，33，44］結果基本一致，同時也提示，隨意運動可能是人類UC行之有效的預防策略，因此，應長期堅持規(guī)律的體力活動。

3.2 miR-214/PTEN信號環(huán)路在UC中的作用

miRNAs可調控炎癥信號轉導通路，在諸多炎癥相關疾?。ò║C）的發(fā)病機制中起關鍵調節(jié)作用［28，47］。研究證實，miRNAs通過參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和分化過程或影響下游炎癥因子的分泌對炎癥反應起調控作用［28］。miR-214是miRNAs中的一員，可通過調控多種靶基因在諸多疾病中發(fā)揮關鍵作用，其在多個系統(tǒng)特別是心血管疾病中的作用受到廣泛研究［26，49，50］。PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因，可使磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）產生的第二信使去磷酸化而阻斷其下游的Akt發(fā)揮生物學功能，因此，是PI3K/Akt信號通路的負性調節(jié)因子，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關［38，48］。

miR-214、PTEN與UC的關系最近才被確定。Farraye等［22］發(fā)現，UC患者miR-214高表達，且與患者疾病活動度以及病程顯著正相關。miR-214通過與轉錄因子，如NF-κB等相互作用而調節(jié)炎癥信號通路，同時還能夠上調多種促炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等表達，因此，在炎癥反應調控中起重要作用。Polytarchou等［42］最近的一項研究顯示，UC以及UC相關癌變（UC-associated cancer，UCAC）患者miR-214表達水平顯著上調；利用生物信息學和全基因組分析發(fā)現，miR-214可調節(jié)NF-κB活性并激活炎癥反應，其機制在于miR-214下調抑癌基因PTEN，由于PTEN對Akt起抑制作用，而Akt則可激活NF-κB，故miR-214過表達最終激活NF-κB信號途徑。此外，STAT3是miR-214上游的轉錄因子，可上調miR-214表達；IL-6可同時活化STAT3和NF-κB，而IL-6又是NF-κB下游的靶基因，因此形成miR-214/PTEN/Akt/NF-κB/IL-6/STAT3/miR-214反饋環(huán)路，這一信號環(huán)路與UC的發(fā)生、發(fā)展及癌變密切相關。上述結論在本研究得到進一步證實，即與SED-CON組比較，SED-DSS組miR-214表達上調，PTEN表達下調，Akt蛋白含量以及NF-κB與DNA結合活性增加，IL-6和STAT3蛋白水平升高，提示，UC時miR-214/PTEN信號轉導環(huán)路調節(jié)發(fā)生紊亂，炎癥“調節(jié)器”NF-κB被持續(xù)激活并導致下游促炎癥因子大量表達。體外實驗證實［42］，過表達miR-214可誘導腸道炎癥反應甚至UCAC，而miR-214抑制劑則可通過上調PTEN表達減輕DSS誘導的小鼠UC病情以及減少氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）和DSS誘導的小鼠UCAC腫瘤的數量和大小。上述研究提示，miR-214對UC腸道炎癥起重要調控作用，抑制miR-214有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)并預防UC發(fā)生，調控miR-214/PTEN信號通路可能是防治UC的重要干預靶點［42］。

3.3 隨意跑輪運動通過調控miR-214/PTEN信號環(huán)路發(fā)揮對UC的保護效應

運動是否通過調控miR-214/PTEN信號環(huán)路介導對UC的保護效應是本研究的主要目的。針對運動與miR-214、PTEN的關系主要集中在心肌組織，且不同組織結論不一，而腸道中該信號環(huán)路在運動改善UC中的作用如何目前尚無關注。本研究旨在探討運動預適應對UC小鼠miR-214/PTEN信號環(huán)路的調控作用。

NF-κB介導的免疫炎癥信號通路持續(xù)激活及下游炎癥因子過表達是UC發(fā)生發(fā)展的重要分子機制，抑制腸道NF-κB信號途徑是治療UC的重要靶點。我們近期的兩項的研究證實，8周運動預適應能夠抑制C57BL/6小鼠實驗性UC結腸NF-κB過表達［1］，而長期有氧運動可下調緩解期UC患者外周血白細胞NF-κB表達量［6］，提示，運動可能通過抑制NF-κB信號通路改善UC患者的炎癥反應和臨床癥狀。前面提到，miR-214上調間接激活NF-κB是UC的重要機制［42］，但運動是否能夠抑制miR-214介導的信號途徑尚不得而知。有關運動與miR-214的關系研究較少且主要集中在心肌組織。Melo等［37］的研究證實，心肌梗塞大鼠miR-214表達上調，而運動訓練則通過下調miR-214表達而改善心功能。Melo等［36］另一項針對正常心肌組織的研究發(fā)現，抗阻訓練通過下調miR-214并上調其下游靶基因心肌肌質網Ca2+-ATP酶表達介導心肌肥大，但并未改變促炎癥因子的含量，提示，正常狀態(tài)下抑制miR-214表達對炎癥反應并無顯著影響。本研究發(fā)現，與SED-DSS組比較，EXE-DSS組miR-214表達下降，Akt、NF-κB、IL-6、STAT3等炎癥信號分子均表達下調，提示，運動下調miR-214表達可有效抑制NF-κB活性從而使DSS誘導的結腸炎癥得到改善。上述結果說明，運動預適應可能通過下調結腸miR-214表達、抑制促炎癥因子釋放，從而對UC起預防和保護作用。

最近的研究顯示［42］，miR-214與PTEN mRNA 3’-UTR結合并抑制其表達是miR-214激活NF-κB的主要機制，因而構成miR-214/PTEN信號環(huán)路，在UC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。運動與PTEN的關系鮮有關注，Liu等［32］證實，大鼠脊髓損傷后進行后肢運動，可通過下調PTEN并激活mTOR信號途徑改善脊髓可塑性；Ma等［34］發(fā)現，游泳運動可誘導心肌肥大，其機制同樣與心肌PTEN表達下調以及PI3K/Akt/mTOR信號途徑激活有關，同時也提示，正常狀態(tài)下抑制PTEN并未造成機體的不良反應（包括炎癥反應）。在本研究中，與SED-DSS組比較，EXE-DSS組PTEN表達上調，Akt、NF-κB和炎癥因子含量下降，提示，運動上調PTEN表達可有效抑制Akt激活NF-κB的效應。

將結腸健康狀態(tài)、UC發(fā)病機制以及運動改善UC的可能機制進行歸納總結。結腸處于健康狀態(tài)時，miR-214微量表達并對PTEN輕度抑制，PTEN高表達并強烈抑制Akt使其少量表達，繼而使NF-κB/IL-6/STAT3信號途徑輕度激活并維持結腸組織的健康狀態(tài)。當UC發(fā)生時，miR-214大量表達并強烈抑制PTEN使其含量減少，PTEN對于Akt的抑制作用減弱，Akt表達上調并持續(xù)高度激活NF-κB/IL-6/STAT3信號途徑，STAT3升高又進一步促進miR-214表達上調，形成對miR-214的正反饋調節(jié)，最終造成結腸的炎癥反應狀態(tài)，因此，miR-214介導的信號反饋環(huán)路在UC發(fā)生發(fā)展甚至癌變過程中起重要作用［42］。長期運動則抑制miR-214過表達，部分解除了對PTEN的抑制，PTEN表達上調，同時Akt/NF-κB/IL-6/STAT3信號途徑高度激活狀態(tài)亦得到部分抑制，STAT3含量降低，其對于miR-214的持續(xù)正反饋性激活作用減弱，最終改善結腸炎癥反應狀態(tài)并緩解臨床癥狀，因此，運動改善UC可能是通過調控miR-214/PTEN信號環(huán)路實現的。

4 結論與展望

利用DSS建立C57BL/6小鼠實驗性UC模型并探討運動預適應對UC的作用及機制，結果證實，隨意跑輪運動預適應可能通過調控miR-214/PTEN信號環(huán)路，即下調miR-214并上調PTEN表達，抑制Akt/NF-κB/IL-6/STAT3信號轉導通路，改善促炎癥因子過度表達狀態(tài)，進而對DSS誘導的C57BL/6小鼠實驗性UC起保護效應。由于miR-214/PTEN信號環(huán)路參與了UC特別是包括UCAC在內的多種腫瘤發(fā)生的病理過程，因此，本研究也為運動預防UC和結直腸癌提供了間接證據。

miRNAs主要在轉錄后水平調控基因的表達，近年的研究發(fā)現，UC患者的血漿、腸黏膜組織、糞便中均存在多種miRNAs差異表達［28］。除本研究所提及的miR-214外，研究還發(fā)現［28］，與健康人群相比較，活動期UC結腸上皮細胞中miR-192低表達，而miR-21高表達；緩解期UC中miR-192表達不變，而miR-375、miR-422表達增高，提示，不同miRNAs在活動性和非活動性UC組織中的表達有所差異。此后，多種miRNAs被鑒別并發(fā)現與UC發(fā)生、發(fā)展與癌變有關，因此，miRNAs表達譜有望成為UC的有效診斷工具和治療靶點，人為操縱miRNAs的表達水平有可能抑制炎癥反應并有望成為新的治療策略。運動作為防治UC的重要非藥物手段，具有安全、經濟、無副作用的特點，然而運動改善UC的具體機制仍不清楚，針對UC患者最佳運動處方仍未確定。

本研究中，運動對腸道m(xù)iR-214/PTEN信號環(huán)路的調控作用與前人針對心肌組織的研究結果存在差異，即運動下調結腸miR-214并上調PTEN表達，而在心肌組織中miR-214和PTEN在運動后同時下調［34，36，37］，提示，該信號通路具有組織特異性，此外，還可能與運動方式、運動強度、動物是否處于病理狀態(tài)等因素有關。由于miRNAs的主要作用在于負調控靶基因表達，其表達模式具有高度保守性、組織特異性和時序性，在不同發(fā)育階段、不同組織中表達水平有顯著差異［46］，因此，今后的研究應針對不同疾病模型、不同組織，揭示不同運動處方（運動方式、運動強度、運動時間等）以及運動聯合臨床治療手段（藥物、手術等）對miRNAs及其介導信號轉導通路的調控作用，深入探討運動有益健康的具體機制，繼而進一步優(yōu)化運動方案。

需要強調的是，本研究主要關注miR-214/PTEN信號通路在運動預適應預防和保護實驗性UC中的作用，但仍存在其他諸多可能機制。例如，腸道微生物在UC發(fā)生和進展中起重要作用，微生物的多樣性和組成成分與炎癥因子水平密切相關［30］。腸道微生物多樣性受損與疾病易感性和嚴重程度增加有關，增加多樣性能夠改善健康狀況［41］。Clarke等［16］的研究證實，運動可增加腸道微生物多樣性并降低炎癥反應水平。因此，本研究中運動保護UC的機制還可能與腸道微生物多樣性增加有關。此外，骨骼肌作為內分泌器官在運動時可分泌肌肉因子（myokines）（包括肌源性IL-6、IL-15、BDNF、IGF-1和Irisin等），進而調節(jié)遠隔器官（包括結腸）的功能。研究證實，肌肉因子與諸多運動健康效應相關，例如，改善代謝和抗炎作用［31］。本研究并未檢測肌肉因子水平，今后的研究應進一步確定運動保護UC的效應是否與肌肉因子的變化有關。

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Effects of Voluntary Wheel Running Exercise Preconditioning on miR-214/PTEN Signal Circuit Pathway of Colon in Experimental Ulcerative Colitis Mice

Objective：To observe the effects of 8-weeks voluntary wheel running exercise preconditioning on dextran sulfate sodium （DSS）-induced experimental ulcerative colitis （UC） of C57BL/6 mouse and investigate the possible mechanism of miR-214/PTEN signal circuit pathway in the pathological process. Methods：Forty male C57BL/6 mice were divided into four groups：sedentary control group （SED-CON），sedentary DSS group （SED-DSS），exercise control group （EXE-CON）and exercise DSS group （EXE-DSS）. Animals of SED-CON and SED-DSS groups maintained resting state while those of EXE-CON and EXE-DSS groups conducted voluntary wheel running exercise preconditioning lasting for 8 weeks. UC model was induced by 3.5% DSS solution in modeling groups and equivalent distilled water was given to control groups. Body weight and disease activity index （DAI） were recorded daily. Seven days later the animals were sacrif i ced for histopathological examination of the colon and tissue damage score，and gene expression of IL-1β，IL-6，TNF-α，miR-214，PTEN，STAT3，Akt as well as NF-κB activity were determined. Results：Compared with SED-DSS group，mice of EXE-DSS group exhibited improved clinical symptoms （body weight increased，DAI decreased，pro-inf l ammatory factors expression downregulated and tissue damage of colon reduced）. Molecular biology study revealed that，compared with SED-DSS group，miR-214，as well as Akt，STAT3，IL-6 expression and NF-κB activity reduced while PTEN mRNA and protein expression level raised in EXE-DSS group （P＜0.05）. Conclusion：Long-term voluntary wheel running exercise preconditioning protected against DSS-induced experimental UC of C57BL/6 mouse，and the possible mechanism may be related with partial restoration of miR-214/PTEN signal circuit pathwayc function.

exercise preconditioning；ulcerative colitis；miR-214；PTEN；inf l ammatory reaction；signal pathway

G804.7

A

2016-12-18；

2017-12-07

河南省自然科學基金項目（142102310359）。

；孟憲欣，男，講師，碩士，主要研究方向為運動訓練與健康促進，E-mail：mengxianxin1999@126.com，；葛吉生，男，教授，學士，主要研究方向為運動訓練與健康促進，E-mail：sdqdgjs2008@163.com；王希柳，男，講師，學士，主要研究方向為運動訓練與健康促進，E-mail：695381505@qq.com。

1. 青島大學 體育學院，山東 青島，266071；2. 鄭州航空工業(yè)管理學院 體育部，河南 鄭州 450015；3. 洛陽師范學院 體育學院，河南 洛陽，471022 1. Qingdao University，Shandong Qingdao，266071，China；2. Zhengzhou Unwersity of Aeronautics，Zhengzhou 450015，China；3. College of Physical Education，Luoyang Normal University，Luoyang 471022，China.