鄭 威, 周迎紅, 劉金龍

1.湖北省農業(yè)科學院農業(yè)經(jīng)濟技術研究所, 武漢 430064; 2.主要糧食作物產業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖北 荊州 434025; 3.無錫商業(yè)職業(yè)技術學院, 江蘇 無錫 214153; 4.湖北民族學院生物科學與技術學院, 湖北 恩施 445000

擬青霉A20140822發(fā)酵生產蟲草素工藝的響應面優(yōu)化研究

鄭 威1,2, 周迎紅3, 劉金龍4*

1.湖北省農業(yè)科學院農業(yè)經(jīng)濟技術研究所, 武漢 430064; 2.主要糧食作物產業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖北 荊州 434025; 3.無錫商業(yè)職業(yè)技術學院, 江蘇 無錫 214153; 4.湖北民族學院生物科學與技術學院, 湖北 恩施 445000

用響應面分析法研究優(yōu)化擬青霉A20140822發(fā)酵蟲草素工藝。通過單因素試驗找出影響發(fā)酵蟲草素得率的主要因素。并按照響應面分析方法設計試驗方案,分析得出影響蟲草素得率的主要因素的最佳參數(shù)。擬青霉在溫度21℃、時間38 h、維生素B1添加量0.08 g/L時，蟲草素含量最高達到1.465 g/L。擬青霉A20140822發(fā)酵生產蟲草素的量比已報道的擬青霉菌種高20%～50%,其發(fā)酵條件受溫度、時間、維生素B1添加量等因素影響。

擬青霉A20140822；發(fā)酵；蟲草素；響應面分析

冬蟲夏草是我國特有的具有較高價值且被人們廣泛認知的藥食兩用中藥，蟲草素是冬蟲夏草的主要有效成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、抗衰老和改善記憶等功能[1～6]。隨著溫室氣體排放的增加，世界氣候逐漸變暖，嚴寒環(huán)境區(qū)域日益縮小。再加上人類活動使得自然環(huán)境受到了毀滅性的打擊，越來越多的原有環(huán)境發(fā)生了變遷或者破壞。這些都使得蟲草的生長范圍正在逐年縮小，但另一方面面對市場對蟲草需求的日益增加，人們大肆進行不計后果的采摘也使得野生蟲草供不應求。

菌絲發(fā)酵的冬蟲夏草的主要成分和藥效與野生蟲草相似，有些成分含量甚至高于野生型,但其價格要低很多，對獲得單一有效成分的生產有很重要的意義。擬青霉是國家藥典認可的藥食兩用菌，可用來生產藥品和保健品，藏蟲草是冬蟲夏草中品質最好的品種。從藏蟲草中分離的擬青霉A20140822是一種新菌種，發(fā)酵液中有效成分含量高，本研究旨在優(yōu)化發(fā)酵工藝，從而為它的開發(fā)提供參考，以便形成更好的醫(yī)藥產品和保健功能品，提高人們的生活質量，形成新的經(jīng)濟增長點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬青霉A20140822菌種：從西藏海拔4 500 m采得的冬蟲夏草中分離獲得。超凈工作臺SW-CJ-2FD(蘇州凈化)；恒溫搖床HQL150B(中國科學院武漢儀器廠)；智能發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術公司)。葡萄糖、 硫酸二氫鉀、硫酸鎂、蛋白胨、 酵母浸膏、 氨基酸、維生素B1、蟲草素標準品均為國藥化學試劑。

單因素實驗培養(yǎng)基配方：小米100 g，葡萄糖10 g，白糖10 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，蛋白胨2 g，酵母浸膏1.5 g，氨基酸0.15 g，維生素B10.1 g，pH 6.0，加超純水定容至1 000 mL分瓶灌裝。

維生素B1添加量單因素培養(yǎng)基配方：培養(yǎng)基其他成分不變僅改變維生素的加入量。加入量從0～0.22 g/L每增加0.02 g/L設置1個濃度處理，共設置12個梯度。

1.2 試驗方法

1.2.1冬蟲夏草菌的制備 取海拔4 000～5 000 m生長的天然冬蟲夏草用泥土包裹好放置在4℃冰箱保存，分離前先用自來水沖洗5 min，75%酒精沖洗3 min，再用升汞處理4 min，無菌水沖洗3次后用滅菌后的手術刀將僵蟲和子座切開分別處理。仔細去除表皮后將中間白色菌絲分切成3～5 mm的小段。用滅菌后的鑷子將切分好的片段一半插到加有硫酸鏈霉素的分離培養(yǎng)基中。用封口膜將培養(yǎng)基封住，18℃黑暗培養(yǎng)7 d。

定期觀察，將生長出的擬青霉A20140822挑到無菌水中稀釋成若干個梯度涂布在培養(yǎng)皿中。黑暗培養(yǎng)定期觀察，將單一的菌落再次轉接，直到分離出單一菌種。將分離到的單一菌種用試管斜面保藏后鏡檢。

1.2.2單因素試驗設計 將擬青霉A20140822接入培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)待瓶內出現(xiàn)大量白色菌絲球為止。

①培養(yǎng)時間因素實驗。配制12瓶實驗培養(yǎng)基，每瓶100 mL，在超凈工作臺上接入10 mL種子培養(yǎng)液，選取26～48 h每隔2 h設置1個時間梯度在恒定條件下培養(yǎng)，設定罐壓0.04～0.05 MPa，罐溫20±2℃，pH 6.0,溶氧60%～100%，攪拌速度190 r/min。取出發(fā)酵液測定蟲草素含量。

②培養(yǎng)溫度因素實驗。配制12瓶實驗培養(yǎng)基，每瓶100 mL在超凈工作臺上接入10 mL種子培養(yǎng)液，分別在17～28℃之間每1℃設置1個溫度梯度在恒定條件下培養(yǎng)，設定罐壓0.04～0.05 MPa，pH 6.0,溶氧60%～100%，攪拌速度190 r/min，40 h后取出發(fā)酵液測定蟲草素含量。

③維生素B1添加量因素實驗。配制不同維生素B1濃度(從0～0.22 g/L設置12個梯度)添加量培養(yǎng)基各100 mL在250 mL三角瓶中，設定罐壓0.04～0.05 MPa，罐溫20±2℃，pH 6.0,溶氧60%～100%，攪拌速度190 r/min，40 h后取出發(fā)酵液測定發(fā)酵液中蟲草素的含量。

1.2.3響應面試驗設計 根據(jù)單因素試驗結果設計響應面試驗。根據(jù)Box-Behnken試驗設計方案，選取維生素B1添加量(X1)、溫度(X2)、發(fā)酵時間(X3)3個影響因子，蟲草素得率為響應值，試驗設計見表1。

采用SAS軟件對15組試驗數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸分析，可以得到維生素B1添加量、溫度、發(fā)酵時間對蟲草素得率的多元二次回歸方程。

1.2.4蟲草素檢測 將發(fā)酵產物55℃溫和烘干，粉碎，萬分之一天平稱取0.250 0±0.000 1 g，放入帶蓋玻璃瓶中，放入超聲波清洗器中超聲20 min。再將其移入微波爐中火處理100 s，得到蟲草素待測樣品。本試驗冬蟲夏草蟲草素含量檢測方法選用的濃度為1.8×10-4～12.6×10-4mol/L，蟲草素的濃度與吸光度基本保持線性關系。利用蟲草素標準品在260 nm的最大吸收波長下，得到蟲草素吸光度與蟲草素含量之間的標準回歸方程。再利用分光光度計測定樣品的吸光度，代入回歸方程得到蟲草素含量[7]。

表1 BOX-Behnken試驗設計Table 1 BOX-Behnken experimental design.

①蟲草素標準溶液的測定：精確稱取經(jīng)過烘干的蟲草素標準品置于500 mL容量瓶中，純化水定容，搖勻。分別取配制好的蟲草素標準溶液1.8×10-4mol/L、3.6×10-4mol/L、5.4×10-4mol/L、7.2×10-4mol/L、9.0×10-4mol/L、10.8×10-4mol/L、12.6×10-4mol/L 2.0 mL置于260 nm處測定吸光度值(以2.0 mL蒸餾水為空白)得到蟲草素濃度與吸光度的關系如圖1。得到回歸方程：Y=0.007 52X+0.191 57。

圖1 標準蟲草素的吸光度回歸方程Fig.1 Absorbance regression equation of standard cordycepin.

②蟲草素含量測定：吸取樣品液2.0 mL(空白管為同樣處理的未發(fā)酵的培養(yǎng)基2.0 mL)調節(jié)溫度至室溫置于260 nm處測定吸光度。

③蟲草素含量的計算：將待測發(fā)酵液沉淀后取上清液，用純化水梯度稀釋到測得OD值在規(guī)定范圍內,然后用分光光度計測出待測品的OD值，將OD值代入回歸方程中，計算出蟲草素摩爾濃度。再代入下列公式計算：

蟲草素含量(g/L)=NMrX。

其中，N為稀釋倍數(shù)，Mr為蟲草素相對分子質量251.24，X為通過標準回歸方程計算出的蟲草素摩爾濃度。

2 結果與分析

2.1 擬青霉A20140822單因素實驗

2.1.1發(fā)酵時間對蟲草素產量的影響 通過對擬青霉A20140822菌持續(xù)發(fā)酵，通過蟲草素的摩爾濃度的測定探究時間與蟲草素產量的關系。對檢測結果進行非線性擬合得到圖2。如圖2所示，擬青霉A20140822菌隨發(fā)酵時間延長，在32～44 h范圍內蟲草素含量不斷上升，發(fā)酵時間超過44 h后蟲草素由于被細胞代謝，含量呈下降趨勢。

圖2 發(fā)酵時間對擬青霉A20140822蟲草素產量影響Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of cordycepin by fermentation of P. varioti A20140822.

2.1.2溫度對產蟲草素產量的影響 選取17～28℃溫度條件下發(fā)酵40 h，探討溫度變量對擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液所產蟲草素含量效果的影響。對發(fā)酵后產物中的蟲草素摩爾濃度和溫度進行非線性擬合。如圖3所示，在18～23℃范圍內隨溫度提高，蟲草素含量不斷上升，在22～24℃范圍內出現(xiàn)最大值，在23℃后產量逐漸下降。擬青霉A20140822菌最適溫度在20～25℃之間。

圖3 溫度對擬青霉A20140822發(fā)酵液產蟲草素效果的影響Fig.3 Effect of temperature on the production of cordycepin by fermentation of P. varioti A20140822.

2.1.3維生素B1添加量對蟲草素產量的影響 將擬青霉A20140822接入到維生素B1加入量因素培養(yǎng)基中在相同條件(20℃，40 h)通過測定蟲草素的摩爾濃度，分析維生素B1加入量對擬青霉A20140822發(fā)酵液蟲草素含量的影響。將上述檢測結果做非線性擬合得到圖4。

圖4 培養(yǎng)基中維生素B1添加量對擬青霉發(fā)酵產蟲草素的影響Fig.4 Effects of vitamin B1 content in culture medium on the production of cordycepin by the fermentation of the P. varioti A20140822.

如圖4所示，隨著培養(yǎng)基中維生素B1添加量從0.02 g/L增加到0.12 g/L蟲草素的含量呈直線上升趨勢,但超過0.12 g/L之后蟲草素含量又減少。維生素B1添加量對擬青霉A20140822發(fā)酵產蟲草素有影響，維生素B1添加量在(0.1±0.02)g/L時擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液蟲草素含量比較高。

2.2 響應面法優(yōu)化試驗結果

選取培養(yǎng)基維生素B1添加量(X1)、發(fā)酵溫度(X2)、發(fā)酵時間(X3)3個影響因子，蟲草素得率為響應值，可得到試驗結果如表3。表3結果表明，在發(fā)酵時間為38 h，發(fā)酵溫度為21℃，維生素B1添加量在0.1 g/L時，蟲草素得率最高為1.238 g/L。

表2 擬青霉A20140822響應面發(fā)酵產蟲草素含量Table 2 Cordycepin content by the response surface fermentation of P. varioti A20140822.

運用SAS軟件對15組試驗數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸分析，可以得到維生素B1添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對冬蟲夏草擬青霉發(fā)酵液蟲草素含量影響的多元二次回歸方程：

Y=0.283 000-0.177 375X1-0.200 125X2-0.147X3+0.255 375X12+0.440 875X22+0.148 625X32-0.116 250X1X2-0.078 000X1X3+0.010 500X2X3

表3 擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵生產蟲草素回歸模型方差分析結果Table 3 Regression analysis of P. varioti A20140822 fermentation producting cordycepin.

對回歸方程顯著性及3個單因素因子對擬青霉A20140822蟲草菌絲發(fā)酵生產蟲草素的影響進行檢驗，對數(shù)學模型進行方差分析。結果(表4)表明，模型F為112.098 7，P<0.000 1，表明該模型極顯著；對模型進行適合性檢驗，P>0.05，未達到顯著水平，表明該模型是穩(wěn)定的，能較好地預測結果。

回歸模型中X1、X2、X3影響極顯著，且3個因素對蟲草素產量的影響大小順序為：發(fā)酵溫度(X2)>維生素B1添加量(X1)>發(fā)酵時間(X3)。

交互項X1X2影響極顯著，X1X3影響顯著，X2X3影響不顯著，顯著順序為X1X2>X1X3>X2X3。

二次項X12、X22、X32均表現(xiàn)有極顯著影響，3個二次項的顯著順序為X22>X12>X32。

從響應面圖5(彩圖見圖版二)可以看出響應值與影響因素的關系。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，圖形的焦點距離越遠影響越明顯。3個交互項的響應值對應圖中的凹度和等高線圖焦點的重合率表明X1X2>X1X3>X2X3，與方差分析結果一致。

對X1、X2、X3各設置5個水平，即X1為-1(0.08 g/L)、-0.5(0.09 g/L)、0(0.10 g/L)、0.5(0.11 g/L)、1(0.12 g/L)，X2為-1(21℃)、-0.5(21.5℃)、0(22℃)、0.5(22.5℃)、1(23℃)，X2為-1(38 h)、-0.5(39 h)、0(40 h)、0.5(41 h)、1(42 h)，進行3因素5水平設計，共25種組合，代入方程進行檢驗，得到不同組合蟲草素含量如表5。由表5可知，此時的最優(yōu)組合為-1、-1、-1，蟲草素含量為1.465 g/L，而3因素3水平設計的最優(yōu)組合為0、-1、-1，蟲草素含量為1.238 g/L，與3因素5水平設計時0、-1、-1組合的蟲草素含量為1.234 g/L只相差0.004 g/L，差異不顯著。說明方程有很好的重現(xiàn)性，從而得出最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵時間38 h，發(fā)酵溫度21℃，維生素B1添加量0.08 g/L。

3 討論

研究運用響應面法優(yōu)化擬青霉A20140822發(fā)酵工藝，經(jīng)試驗優(yōu)化后的擬青霉A20140822發(fā)酵生產蟲草素的最佳工藝條件為：在發(fā)酵時間38 h條件下，擬青霉發(fā)酵溫度為21℃，維生素B1添加量0.08 g/L,其模型最優(yōu)產蟲草素達1.465 g/L。各因素對擬青霉A20 140822發(fā)酵生產蟲草素的影響分別為：發(fā)酵溫度>維生素B1添加量>發(fā)酵時間。

圖5 發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基維生素B1添加量對擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液中蟲草素含量影響的響應面分析結果Fig.5 Response surface analysis of the effect of fermentation temperature, time and the amount of VB1 on cordycepin content.A:發(fā)酵時間40 h,維生素B1添加量和發(fā)酵溫度對擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液中蟲草素產量影響； B:發(fā)酵溫度22℃,維生素B1添加量和發(fā)酵時間對擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液中蟲草素產量影響；C：培養(yǎng)基維生素B1添加量0.1 g/L，溫度和發(fā)酵時間對擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液中蟲草素產量影響。(彩圖見圖版二)

表4 擬青霉A20140822發(fā)酵條件響應面優(yōu)化分析結果Table 4 Response surface optimization analysis results of P. varioti A20140822 fermentation condition.

擬青霉A20140822蟲草菌是從藏蟲草中篩選出的一株新的國家有關部門鑒定保藏的菌株，也是藥典認可的可生產藥品、飲食品的藥食兩用菌。本研究生產蟲草素的能力比已報道的擬青霉菌種高20%～50%。但試驗只就發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、維生素B1添加量對擬青霉A20140822產蟲草素的影響進行了研究，在今后應對其他的發(fā)酵工藝參數(shù)，如培養(yǎng)基成分、接種量、搖瓶轉速、pH等因素進行優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)體系，滿足工業(yè)化生產的要求，同時對菌絲體中其他有效成分的最大獲得量開展研究[8,9]。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草中存在多種真菌并能競爭性生長，并成功分離出多種真菌，如蝙蝠蛾被孢霉、蝙蝠蛾擬青霉、蟲草多毛孢、中國擬青霉、中國彎頸霉、中國被毛孢等[10～13]，蝙蝠蛾擬青霉是競爭性優(yōu)勢較強的一種真菌，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體與冬蟲夏草的化學成分指紋譜極為相似[14]。如何利用這些真菌發(fā)酵工業(yè)化生產菌絲體已成為現(xiàn)階段人們研究的重點。

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ResponseSurfaceOptimizationoftheFermentationProcessofCordycepinbyPaecilomycesvariotiA20140822

ZHENG Wei1,2, ZHOU Yinghong3, LIU Jinlong4*

1.InstituteofAgriculturalEconomicandTechnology,HubeiAcademyofAgriculturalScience,Wuhan430064,China; 2.HubeiCollaborativeInnovationCenterforGrainIndustry,HubeiJingzhou434025,China; 3.WuxiVocationalInstitueofCommerce,JiangsuWuxi214153,China; 4.CollegeofBiologicalScientificandTechnical,HubeiMinzuUniversity,HubeiEnshi445000,China

Response surface analysis method was used to study the optimization of the fermentation process of cordycepin byPaecilomycesvariotiA20140822. The main factors affecting the yield of fermented cordyceps were found out through single factor experiment. According to the response surface analysis method, we obtained the optimal parameters. The content of cordycepin was the highest 1.465 g/L at the vitamin B10.08 g/L, time 38 h and temperature 21℃. The fermentation condition of A20140822 was 20%～50% higher than that of the fungus. The fermentation conditions were affected by the factors such as temperature, time and vitamin B1content.

PaecilomycesvariotiA20140822; fermentation; cordycepin; response surface analysis

2017-10-03;接受日期2017-10-18

湖北省科技支撐計劃項目(2015BBA178);湖北省富硒產業(yè)發(fā)展專項(XKJ201501-17;XKJ201501-20)資助。

鄭 威,研究員,博士,主要從事富硒技術研究及功能產品研發(fā)。E-mail:nkyzhengwei@163.com。*通信作者：劉金龍,高級實驗師,主要從事富硒生物工程教學與研究。E-mail:liujl1618@163.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0146